全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（8）：1311–1316
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–10–13；修回日期：2010–05–17
基金项目：国家自然科学基金项目（30771522）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：mlchai@zju.edu.cn）
沟叶结缕草胚性愈伤组织继代培养基对其生长
和再生的影响
贾玉芳，陈 曙，柴明良*
（浙江大学园林研究所，杭州 310029）
摘 要：以沟叶结缕草匍匐茎诱导的胚性愈伤组织为材料，通过连续 3 代的培养，比较了 MS、N6
和 N6AA 3种基本培养基与不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg · L-1）2,4-D组合对愈伤组织生长速度、胚性
保持、再生能力、再生植株的抗氧化酶活性、脯氨酸含量和染色体倍性的影响。结果表明：MS培养基添
加 2.0 mg · L-1 2,4-D对愈伤组织的生长和胚性保持效果最好，胚性愈伤组织比率达 85.00%。但不同基本
培养基对再生植株的 SOD、POD、CAT 活性和脯氨酸含量没有显著影响，流式细胞仪测定结果表明其染
色体倍性也没有发生变化，植株个体间没有形态差异。
关键词：沟叶结缕草；培养基；2,4-D；染色体倍性
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）08-1311-06

Effects of Subculture Media on Embryogenic Callus Growth and Regenera-
tion of Zoysia matrella
JIA Yu-fang，CHEN Shu，and CHAI Ming-liang*
（Institute of Landscape Architecture，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）
Abstract：The embryogenic calluses induced from the stolons of manilagrass [Zoysia matrella（L.）
Merr.] were taken as materials and cultivated on three basic media（MS，N6 and N6AA）with different
concentrations（0.5，1.0，1.5 and 2.0 mg · L-1）of 2,4-D for three successive generations to compare their
effects. Growth rate，embryogenic maintenance and regeneration ability of the calluses，activities of
anti-oxidant enzymes，contents of proline and ploidy of the regenerated plants were measured. The results
showed that MS medium supplemented with 2.0 mg · L-1 2,4-D was optimal for callus growth and its
embryogenic maintenance，and the rate of embryogenic callues reached 85.00%. However，there were no
significant differences among the activities of SOD，POD，CAT and proline content in the regenerated
plants acquired from the calluses that had been successively subcultured on three different basic media.
The ploidy of the regenerated plants measured with flow cytometry showed unchanged. There were also no
morphological differences appeared among individual plants regenerated from different treatments.
Key words：manilagrass；Zoysia matrella（L.）Merr．；medium；2,4-D；ploidy

沟叶结缕草[Zoysia matrella（L.）Merr.]是一种优良的暖季型草坪草。它具有植株低矮、叶片

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细密、色泽翠绿、持绿期长、草层密集、抗逆性强等优点，既可用于观赏休憩草坪，也可用于运动
场草坪，已成为我国南方大部分地区的主要草坪草（苟文龙 等，2002）。但沟叶结缕草易感锈病，
抗寒性较差，季节变换时易变黄（李国平 等，2005），需通过生物技术进行改良。转基因技术已在
多种草坪草上成功应用（Guo et al.，2003；Goldman et al.，2004）。通过体细胞无性系变异进行抗
性突变体的筛选，在结缕草（Chai et al.，2001）、狗牙根（Lu et al.，2007）等草坪草上已有成功探
索，成为草坪草育种的另一重要途径。
无论是转基因还是体细胞无性系变异育种，都必须依赖于高效、稳定的再生体系。草坪草通过
成熟胚或种子建立离体再生体系的研究开展较早，并且已经比较完善（Chai et al.，1998；Rim et al.，
2001），而以其他器官为外植体诱导胚性愈伤组织还相当困难。沟叶结缕草在自然界是通过匍匐茎
进行无性繁殖的，必须通过芽等无性器官建立再生体系。虽然李国平等（2005）和 Dhandapani 等
（2008）通过沟叶结缕草茎尖诱导的丛生芽以及幼花序和茎节诱导出愈伤组织，并获得了再生植株，
但是他们的研究仅针对愈伤组织的诱导和再生环节，进行了外植体种类及培养基的比较，没有进行
愈伤组织长期继代保存和再生植株生理、遗传方面的探讨。本实验室经过多年的离体试验，已经熟
练掌握了以沟叶结缕草匍匐茎段为外植体诱导愈伤组织并高效再生的技术，在此基础上，针对愈伤
组织的长期继代保存条件进行了研究。
在植物离体培养中，继代培养基的筛选是最基本也是极为重要的一个环节，尤其是对于沟叶结
缕草等愈伤组织诱导维持非常困难的草坪草种。目前，关于沟叶结缕草等多种草坪草的继代培养条
件还缺乏长期、系统、深入的研究，对于不同培养条件下再生植株的抗氧化酶等生理变化及遗传稳
定性等方面的研究也未见报道。本试验比较了连续 3 次继代培养过程中，不同基本培养基和 2,4-D
浓度对愈伤组织的生长、胚性保持、再生能力、再生苗生理指标及染色体倍性的影响，以期寻找适
合的继代培养条件，优化沟叶结缕草再生体系，为其遗传改良奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 胚性愈伤组织的继代培养
试材为沟叶结缕草匍匐茎段诱导的胚性愈伤组织。试验于 2008年在浙江大学农学院园林所实验
室进行。以 MS、N6 和 N6AA（N6 培养基添加脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸）培养基为基
本培养基（表 1），添加 40 g · L-1蔗糖、5.3 g · L-1琼脂粉以及不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg · L-1）
的 2,4-D。取沟叶结缕草胚性愈伤组织直径约 3 mm的小块，每个培养皿接种 24块，每个处理设 5
皿重复，（25 ± 2）℃下暗培养，每 6周继代 1次。继代前观察统计愈伤组织的生长速度和胚性保持

表 1 不同基本培养基主要成分
Table 1 The major component in different basal media /（mg · L-1）
主要成分 Major component MS N6 N6AA
K 593.4 1 206.4 1 206.4
NO3--N 1 103.4 783.7 783.7
NH4+-N 577.2 162.1 162.1
P 38.7 91.1 91.1
Ca 119.7 45.2 45.2
Mg 36.0 18.0 18.0
S 52.2 24.9 24.9
Cl 212.5 80.2 80.2
有机物 Organism 103.1 9.5 2 366.0
8期 贾玉芳等：沟叶结缕草胚性愈伤组织继代培养基对其生长和再生的影响 1313

情况。测量每块愈伤组织的直径，以大部分愈伤组织直径大小（5 mm）为衡量标准，直径超过 5 mm
的愈伤组织比率越高，表明愈伤组织生长速度越快。同时统计胚性愈伤组织的比率（胚性愈伤组织
数/总愈伤组织数）。继代时剔除水渍化和表面产生毛状根的非胚性愈伤组织，挑取颜色淡黄、质地
紧密的胚性愈伤组织，以直径约 3 mm的小块，接种到新的同种培养基上。连续培养两代后，根据
愈伤组织的生长情况调整培养基种类和 2,4-D的浓度。
1.2 愈伤组织的再生培养
培养 3代后，分别从 3种不同基本培养基上挑取颜色淡黄、质地紧密的愈伤组织，以直径约 3 mm
的小块接种到 1/2MS（大量元素减半）+ 0.1 mg · L-1 BA + 30 g · L-1蔗糖 + 5.3 g · L-1琼脂粉的再生培
养基上，每皿接种 16块，每个处理设 3皿重复，于光强约 12.5 µmol · m-2 · s-1左右，每天光照 12 h，
（25 ± 2）℃条件下培养。愈伤组织再生过程中颜色由黄转绿，膨大生长，再生较快的愈伤组织率
先分化形成绿色小苗。4周后观察记录直径超过 5 mm以及分化形成 5个以上小苗的外植体比率，
作为衡量愈伤组织再生速度的指标，同时统计愈伤组织再生率（再生的愈伤组织数/总愈伤组织数）。
1.3 再生植株 SOD、POD、CAT活性和脯氨酸含量的测定
将上述 3 种不同基本培养基培养过的愈伤组织在同一再生培养基上获得的再生植株移栽到温
室，8周后长成生长旺盛的成熟植株。取不同处理再生植株幼嫩叶片 0.2 g，加 50 mmol · L-1的磷酸
缓冲液（pH 7.8，含 0.2 mmol · L-1 EDTA，1%PVP）3 mL，于冰浴中研磨提取，匀浆液于 12 000 r · min-1，
4 ℃离心 20 min，取上清液用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）
活性测定。SOD活性测定采用 NBT（氮蓝四唑）光还原法（高俊凤，2006）；POD活性的测定采用
愈创木酚法（周艳虹 等，2003）；CAT 活性测定参照 Lu 等（2007）的方法；脯氨酸含量测定采用
酸性茚三酮比色法（高俊凤，2006）。每个处理设 3 次重复。采用 UV-2550 型分光光度计（日本
SHIMADZU公司生产）测定吸光度，计算各指标的含量。
1.4 再生植株染色体倍性检测
采用 Otto提取液（Dolezel & Bartos，2005），用 BD FACSCalibur流式细胞仪对上述不同处理的
再生植株进行 DNA相对含量的测定。试验数据分析采用 SAS分析软件，Tukey比较法，5%水平差
异。
2 结果与分析
2.1 不同基本培养基和 2,4-D浓度对愈伤组织生长状况的影响
2.1.1 第 1代愈伤组织生长状况
用 SAS软件双因素方差分析第 1代愈伤组织培养的数据。不同处理直径≥ 5 mm的愈伤组织比
率为 38.75% ~ 62.50%，由于愈伤组织还不稳定，重复性不是很好，所以它们之间的差异不显著。不
同基本培养基和 2,4-D浓度对于愈伤组织胚性保持也没有显著影响，胚性愈伤组织比率为 84.17% ~
90.83%。
2.1.2 第 2代愈伤组织生长状况
随着培养时间的延长，不同培养基和 2,4-D浓度对愈伤组织生长和胚性保持的影响越来越明显。
统计分析结果表明，在 N6AA、N6培养基上，直径≥ 5 mm的愈伤组织比率分别为 62.97%和 62.29%，
显著高于MS培养基（直径≥ 5 mm的愈伤组织比率为 52.54%），但是生长较快的多为水渍化的非
胚性愈伤组织。2,4-D浓度对愈伤组织的生长速度没有显著影响（图 1）。
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MS培养基对于愈伤组织的胚性保持效果最好，N6AA培养基次之，N6培养基最差，三者之间
的差异均达到显著水平。较低的 2,4-D浓度（0.5、1.0 mg · L-1）不利于愈伤组织的胚性保持。培养
基和 2,4-D浓度的互作对愈伤组织胚性保持的影响是显著的。MS + 2.0 mg · L-1 2,4-D的组合效果最
好，胚性愈伤组织比率为 85.83%，其次是MS + 1.5 mg · L-1 2,4-D的组合（胚性愈伤组织比率为
75.83%）和 N6AA + 1.5 mg · L-1 2,4-D组合（胚性愈伤组织比率为 72.50%）。N6培养基同各种 2,4-D
浓度的组合效果均较差（图 1）。
图 1 第 2代愈伤组织生长状况
Fig. 1 Growth state of calluses in the second subculture generation
2.1.3 第 3代愈伤组织生长状况
根据第 2 代的统计分析结果，对试验方案做了一些调整：对于 N6 培养基上愈伤组织，不再记
录其生长状况，仅进行继代培养，为后面的再生试验提供材料；2,4-D浓度去掉 0.5、1.0 mg · L-1两
个梯度；以MS为基本培养基时，2,4-D浓度增加一个梯度（2.5 mg · L-1），以探讨更高的 2,4-D浓
度是否更有利于愈伤组织的生长和胚性保持，继代时取第 2代MS + 2.0 mg · L-1 2,4-D培养基上的愈
伤组织作为其外植体。
结果（图 2）显示，在生长速度方面，N6AA + 2.0 mg · L-1 2,4-D组合的效果最差（直径 ≥ 5 mm
的愈伤组织比率为 45.00%），与其他组合差异显著，而其他组合之间没有显著差异。
在愈伤组织的胚性保持方面，MS + 2.0 mg · L-1 2,4-D组合效果（胚性愈伤组织比率为 85.00%）
显著好于其他组合。
图 2 第 3代愈伤组织生长状况
Fig. 2 Growth state of calluses in the third subculture generation
8期 贾玉芳等：沟叶结缕草胚性愈伤组织继代培养基对其生长和再生的影响 1315

图 3 愈伤组织再生情况
Fig. 3 Regeneration of the calluses
2.2 不同基本培养基对愈伤组织再生能力的影响
愈伤组织在不同基本培养基上培养了 3代
后，在相同的再生培养条件下再生能力有显著
差异。MS 培养基上继代培养过的愈伤组织再
生时，直径 ≥ 5 mm的外植体比率为 77.08%，
显著高于 N6培养基（66.67%）和 N6AA培养
基（29.17%）。在成苗速度方面，MS培养基培
养过的愈伤组织分化形成 5个以上小苗的比率
为 62.50%，显著好于 N6AA培养基（27.08%）。
3 种不同培养基对于愈伤组织再生率没有显著
影响，再生率为 91.67% ~ 100.00%（图 3）。
2.3 再生植株 SOD、POD、CAT活性和脯氨酸含量测定
愈伤组织在不同基本培养基上经过 3代培养，在相同的再生培养基上获得的再生植株移栽后的
SOD、POD和 CAT活性及脯氨酸含量均没有显著差异。其中，SOD活性在 3.32 ~ 3.40 U · min-1 · g-1FW
之间；POD活性在 15.41 ~ 17.64 U · min-1 · g-1FW之间；CAT活性在 0.94 ~ 1.01 U · min-1 · g-1FW之
间；脯氨酸含量为 0.05% ~ 0.06%。
2.4 再生植株染色体倍性检测
试验中，从不同基本培养基培养过的愈伤组织获得的再生植株 DNA相对含量为 44.58 ~ 45.16，
经统计分析，它们之间没有显著差异，说明不同基本培养基对于再生植株的染色体倍性没有显著影
响。
3 讨论
建立并维持高效、稳定的离体再生体系是植物进行遗传转化和体细胞无性系变异育种的基础。
沟叶结缕草胚性愈伤诱导和维持困难。寻找长期保持愈伤组织良好胚性和遗传稳定的途径，可以减
少诱导愈伤组织的繁琐过程，为转基因提供大量优质的受体，也为体细胞无性系变异筛选提供充足
和均一的起始材料。本实验室经过多年的离体培养发现，沟叶结缕草以匍匐茎段为外植体，诱导产
生的初代愈伤组织为胚性愈伤的几率较低，胚性愈伤组织经过长期的继代培养后也容易转换成非胚
性愈伤组织，失去再生能力。因此，探讨合适的继代培养条件以维持愈伤组织的胚性具有重要意义。
关于草坪草组织培养的研究，多集中于愈伤组织诱导及一代培养条件的比较（Bai & Qu，2001；
李瑞芬 等，2004），未见通过长期的继代培养来筛选合适培养条件的研究，也没有考虑培养基成分
及生长调节剂的积累对于愈伤组织生长和胚性保持的影响。本试验发现，愈伤组织在不同培养基上
短期的生长并不能表现出显著或稳定的差异，只有经过长期多代培养才能获得可靠的结论。不同处
理对愈伤组织生长速度影响不大，而差异主要表现在胚性保持方面。与MS培养基相比，N6和 N6AA
培养基上的愈伤组织水渍化程度较高，因此在之后的再生试验中表现出较差的再生能力（图 3）。
MS同 N6和 N6AA培养基的主要区别在于，前者含有较高的 NO3--N和 NH4+-N，以及 Ca、Mg、S、
Cl等元素（表 1）；后两者含有较高的 K和 P。这种成分上的差异显著影响了愈伤组织的胚性保持。
至今尚未有具体哪种成分或几种成分的复合对胚性愈伤组织维持和生长的报道，本试验也未进行这
方面的探索。N6AA 培养基效果优于 N6 培养基，说明脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸等氨基
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酸的添加有利于愈伤组织胚性保持，故也被用于结缕草的愈伤组织诱导试验中（张俊卫 等，2005）。
2,4-D浓度过高和过低都不利于愈伤组织的胚性保持。可能由于 2,4-D的添加改变了愈伤组织细
胞内部生长素与细胞分裂素的比例，从而影响其水渍化过度生长和表面毛状根的产生。试验中，沟
叶结缕草愈伤组织在添加 2.0 mg · L-1 2,4-D的MS培养基生长状况最好，在长期的继代培养中能够
保持旺盛生长和良好的胚性。
经过不同培养基上较长时间的继代培养，沟叶结缕草胚性愈伤组织虽然在生长速度、胚性保持、
再生能力方面存在差异，但是移栽后成熟的植株观察不到明显的形态差异（数据未列出）。并且，
组织培养过程中的差异也没有引起再生植株过氧化酶活性等生理指标的变化和染色体倍性的变异。
这表明不同继代培养基的若干代培养并不会引起遗传变异的发生，但培养基的筛选对于维持胚性愈
伤组织的稳定性和高效的再生能力却是不可或缺的程序。

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