全 文 ：林业科学研究　2005, 18 (5) : 541～545
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2005) 0520541205
沟叶结缕草的组织培养和无性系的建立
李国平 1, 2 , 杨鹭生 2 , 胡文英 2 ,黄群策 13
(1. 郑州大学离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州　450052; 21莆田学院环境与生命科学系 , 福建 莆田　351100)
摘要 :通过研究不同基本培养基及植物生长调节组合对沟叶结缕草丛生芽诱导、增殖和愈伤组织诱导、分化的影响 ,
建立起沟叶结缕草试管无性系。以地下匍匐根状茎的顶芽为外植株 ,在 MS + 62BA 2 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·
L - 1培养基上诱导丛生芽形成 ,以 MS + KT 3 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1作为继代增殖培养基 ,建立起丛生芽苗
→不定芽发生 →丛生芽苗速生试管无性系 ;以丛生芽苗基部为外植体 ,以 MS + 2. 42D 4 mg·L - 1作为愈伤组织诱
导培养基 ,以 MS基本培养基作为愈伤组织分化培养基 ,建立起丛生苗 →愈伤组织 →愈伤组织分化 →丛生苗试管无
性系。试管无性系室外移栽成活率达 95%以上。沟叶结缕草试管无性系的建立为细胞工程育种和基因转化的研
究奠定了基础。
关键词 :沟叶结缕草 ;组织培养 ;无性系 ;愈伤组织 ;分化
中图分类号 : Q94311　S68814　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2004211223
基金项目 : 国家“十五”科技攻关项目“离子束应用技术研究”(2001BA302B)
作者简介 : 李国平 (1966—) ,男 ,福建莆田人 ,副教授 ,博士生 ( E - mail: p tlgp@ sina. com) 13 :通讯作者
T issue Culture of Zoysia m a tre lla and the Establishm en t
of A sexua l System
L I Guo2ping1, 2 , YANG Lu2sheng2 , HU W en2ying2 , HUANG Qun2ce13
(1. Provincial Key Laboratory of Ion Beam B io2engineering, Zhengzhou University, Zhengzhou　450052, Henan, China ;
2. Department of Environment and L ife Science, Putian University, Putian　351100 , Fujian, China)
Abstract: The paper dealt with the studies on the tissue culture and the establishment of asexual system of Zoysia m atrella.
Two kinds of asexual system were established successfully based on careful studies on the methods and major factors for in2
duction, differentiation and p ropagation of tufted shoots and calli. One asexual system was maintained through tufted shoots
regeneration, using top buds of rhizome of Zoysia m atrella as exp lants, MS + 62BA 2mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1 as
the effective medium for adventitious shoot induction and MS + KT 3mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1 as the suitable sub2
culture medium for adventitious shoot p ropagation. Another asexual system was maintained through callus induction and dif2
ferentiation, using the base of tufted shoots as exp lants, MS + 2, 42D 4 mg·L - 1 as the op timum medium for callus induc2
tion and MS basic medium as the effective medium for differentiation in callus. And the p lantlets got acclimatized well,
with the survival rate up to 95%. Establishment of asexual system laid a solid foundation for further studies on breeding by
means of somaclonal variation and Agrobacterium 2mediated genetic transformation.
Key word: Zoysia m etrella; tissue culture; asexual system; callus; differentiation
沟叶结缕草 (Zoysia m atrella (L. ) Merr. )是禾本
科 (Gram ineae)结缕草属 ( Zoysia W illd1)的多年生草 本植物 ,原产于台湾、广东、海南等地 ,生于海岸沙地上 [ 1 ]。沟叶结缕草是一种比较优良的暖季型草坪草 ,
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
其叶细、色绿、绿期长、草层密集而无丛状草丘突起 ,
具有较强的耐旱性、耐盐碱性、耐荫性、对土壤要求不
严等特性 ,被认为是一种高质量的草坪草 ,适于景点
绿化、休憩广场和高级运动场的草坪建植 ,已成为我
国南方大部分地区的主要草坪栽培种 [ 2 ]。但沟叶结
缕草也存在一些突出的缺陷 , 如成坪速度慢、叶量少、
易感锈病、抗寒性较差、季节变换时易变黄等 ,这些性
状在一定程度上都可以通过遗传育种的手段得到改
良。利用植物组织和细胞培养技术与体细胞突变体
筛选技术相结合的方法是植物育种途径之一 ,已经在
很多作物上获得抗病、耐盐、耐重金属等多种类型的
突变体 [ 3, 4 ] ;采用基因工程技术 ,可将抗逆功能基因
导入特定品种的愈伤组织或原生质体 ,获得改良的转
基因植物。无论是采用细胞工程或是基因工程方法
培育作物新品种 ,首先必需建立高频、稳定的植物再
生系统 [ 5～7 ]。目前国内结缕草属开发应用研究大都
以采收种子及传统繁育为主 [ 8, 9 ] ,有关组织培养和遗
传转化方面的报道较少 [ 7, 10 ] ,且大都涉及结缕草 ( Z.
japonica Steud. ) [ 11～13 ]。本研究旨在建立用于基因转
化和体细胞突变体筛选的高频再生体系 ,为开展沟叶
结缕草的遗传育种工程研究奠定基础。
1　材料和方法
111　实验材料
沟叶结缕草 ( Zoysia m a trella (L. ) Merr. ) 的地
下匍匐根状茎 ,取自莆田学院校园内草坪。植物生
长调节剂 2, 42D、NAA、62BA、KT、LH均为分析纯。
112　培养基
除本文 2. 2. 2项实验研究不同基本培养基对愈
伤组织诱导的影响外 ,其它项实验中基本培养基均
为 MS,按实验设计需要添加植物生长调节物质。培
养基均附加蔗糖 30 g·L - 1 ,琼脂 8. 0 g·L - 1 , pH值
调至 5. 8。所有培养基均在 121 ℃、1. 1 kg·cm - 2高
温高压灭菌 20 m in。
113　培养条件
培养温度 (25 ±2) ℃。除愈伤组织的诱导阶段
进行暗培养外 ,其它培养过程均在光照下进行 ,光照
12 h·d - 1 ,光照度 1 500～2 000 lx。
114　外殖体选取与处理
丛生芽的诱导 :选取校园中长势强壮的沟叶结
缕草地下葡匐根状茎顶芽 1 cm左右 ,将顶芽置于烧
杯里 ,用肥皂水浸洗 5 m in,然后放在自来水下冲洗
3 h;在无菌室里用 75%乙醇浸渍 30 s,无菌水冲洗
一遍 ,再用 0. 1%氯化汞处理 10 m in,用无菌水冲洗
5～6次后在无菌操作台上切取顶端长约 0. 5 cm的
小段作为外植体。把这些外植体接种于诱导丛生芽
培养基中 (见表 1)。
表 1　不同植物生长调节剂组合对
丛生芽形成的影响
序号
植物生长调节剂 /
(mg·L - 1 )
62BA NAA 外植体数 形成丛生芽的外植体数 诱导率 /% 繁殖系数
1 0. 5 0. 1 45 14 31 3
2 1. 0 0. 1 45 20 44 5
3 2. 0 0. 1 45 25 56 8
4 0. 5 0. 5 45 0 0 0
5 1. 0 0. 5 45 9 20 2
6 2. 0 0. 5 45 12 27 3
愈伤组织的诱导 :诱导愈伤组织时以继代增殖
的丛生苗基部作为外植体。在无菌操作下 ,剪去丛
生苗上部的叶片 ,然后将带有分生组织的基部切割
成块 ,大小约为 0. 5 cm ×0. 5 cm,分别接种于诱导愈
伤组织培养基中 (见表 3、表 4)。先放在 25℃下进
行暗培养 12 d后 ,再转到光照条件下培养。
115　愈伤组织的细胞组织学观察
取愈伤组织用卡诺液固定 2～12 h,在 1 mol·
L - 1盐酸 60℃下水解 10 m in,卡宝品红染色压片 ,
O lympus BX51型显微镜观察照相。
2　结果与分析
211　丛生芽的诱导与增殖
21111　植物生长调节剂组合对丛生芽形成的影响
以 MS为基本培养基 ,加入不同浓度的 62BA、
NAA ,植物生长调节剂组合见表 1。沟叶结缕草地
下匍匐茎顶芽在培养基上启动较慢 ,培养 80 d后始
见丛生芽形成 (图 1)。从表 1可以看出 ,不同植物
生长调节剂组合对丛生芽诱导率及繁殖系数 (在一
定的时间内平均每个外植体形成的不定芽数 )影响
较大 , 4号培养基中 62BA与 NAA的比值为 1,不能
诱导丛生芽形成 , 3号培养基中 62BA与 NAA的比
值为 20,其诱导率为 56% ,繁殖系数为 8,可见 , 62
BA与 NAA的比值越大 ,丛生芽的诱导能力越高。
21112　62BA和 KT对丛生芽增殖的影响 　将 2. 1. 1
项实验中形成的丛生芽 ,接种于附加不同浓度 62BA
和 KT的 MS培养基中 ,每瓶接一丛 , 40 d后观察 62
BA和 KT对丛生芽增殖的影响。如表 2所示 , 62BA
或 KT浓度越高 ,丛生芽的增殖系数越高 ,但其浓度
245
第 5期 李国平等 :沟叶结缕草的组织培养和无性系的建立
以 3. 0 mg·L - 1为宜 ,当浓度为 5. 0 mg·L - 1时 ,外
植体增殖形成的丛生芽苗过于密集、矮小 ,不适宜作
为下一代的继代培养材料 ;从丛生芽苗形成的速度
及丛生芽苗质量看 , KT优于 62BA。
将在 MS + KT 3 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1
培养基上形成的芽苗丛切成小丛后转接于相同培养
基上 ,丛生芽苗分蘖快 , 35 d后可形成直径约为 3
cm的密集丛生苗 (图 2)。几年来 ,笔者以 MS + KT
3 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1作为继代培养基 ,
其分蘖生长速度稳定 ,从而建立起丛生芽苗 →不定
芽发生 →丛生芽苗速生试管无性系。
表 2　62BA和 KT对丛生芽增殖的影响
植物生长调节剂 / (mg·L - 1 )
62BA KT 接种芽丛数 每丛增殖芽数 丛生芽苗生长情况
3 0 6 65 芽苗草绿、稍弱、分蘖慢
5 0 6 88 芽苗黄绿、矮小、分蘖较快
0 3 6 72 芽苗墨绿、强壮、分蘖快
0 5 6 94 芽苗绿、矮小、分蘖较快
　　注 :基本培养基为 MS + NAA 0. 1 mg·L - 1
212　愈伤组织的诱导与继代培养
21211　2. 42D浓度对愈伤组织诱导的影响 　取在
MS + KT 3 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1培养基中
继代增殖的丛生苗基部作为外植体 ,接种于附加不
同浓度 2. 42D的培养基中 ,实验重复 3次。从表 3
可以看出 , 2, 42D为 1. 0～4. 0 mg·L - 1时均能诱导
出愈伤组织 ,其中 2. 0～4. 0 mg·L - 1的愈伤组织诱
导效果好 ,诱导率可达 100%。2, 42D为 4. 0 mg·
L - 1时 ,出愈较快 ,出愈量大 ,生长较迅速 ,培养至第
45 d,愈伤组织直径可达 1. 5 cm ,愈伤组织为乳白
色 ,表面干燥 ,愈伤质量与 2, 42D 2. 0 mg·L - 1的并
无差异。所以 ,MS + 2, 42D 4. 0 mg·L - 1适宜用于
愈伤组织的诱导 (见图 3)。
表 3　不同浓度 2, 42D对愈伤组织诱导的影响
2, 42D浓度 / (mg·L - 1 ) 接种外
植体数
始出愈
时间 / d
出愈
个数
诱导
率 /%
0. 5 45 - 0 0
1. 0 45 45 38 84
2. 0 45 30 45 100
4. 0 45 23 45 100
21212　基本培养基对愈伤组织诱导的影响 　取在
MS + KT 3 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1培养基中
继代增殖的丛生苗基部作为外植体 ,接种于附加有
4 mg·L - 1 2, 42D的 MS、W hite、N6、N itsch培养基上 ,
实验重复 3次。愈伤组织的诱导结果见表 4。在
W hite和 N itsch培养基上不能诱导出愈伤组织。在
MS和 N6 培养基上愈伤组织的诱导结果均较好。但
N6 培养基上诱导产生的愈伤组织质地松软 ,表面湿
润 ,生长速度较快 ,从以往实验推测 ,此类愈伤组织
的分化能力较低 ,所以 , N6 培养基不适合作为愈伤
组织诱导的基本培养基。
表 4　不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
基本培养基 [ 14 ] 接种外植体数 诱导率 /% 愈伤生长状况
MS 45 100 乳白色、致密、干燥
W hite 45 0 -
N6 45 100 黄白色、松软、湿润
N itsch 45 0 -
21213　愈伤组织的继代培养 　将在 MS + 2, 42D 4
mg·L - 1培养基上诱导出来的、生长良好的愈伤组
织转接相同培养基和 MS + 2, 42D 4 mg·L - 1 + LH
500 mg·L - 1培养基中 ,暗培养 12 d后 ,再转到光照
条件下培养 ,结果发现愈伤组织在继代培养基中均
可生长膨大 ,附加有 LH的培养基中愈伤组织生长
更快 , 30 d后 ,其直径大小可约达 2. 2 cm。但是 ,愈
伤组织经在上述两种培养基上继代培养 35 d后 ,愈
伤表面逐渐产生大量白色毛状物 ,最终愈伤组织被
白色短毛覆盖 (图 4)。对继代培养 40 d的愈伤组织
进行细胞组织学观察表明 ,愈伤组织上已有不定根
分化 (图 5) ,且有大量细胞分化成类根毛细胞 (图
6)。
213　愈伤组织的分化
在 MS + 2, 42D 4 mg·L - 1和 MS + 2. 42D 2 mg
·L - 1培养基上诱导出来的愈伤组织切割成小块后
转接到 MS基本培养基上 ,进行光照培养。25 d后 ,
白色的愈伤组织部分转绿 (图 7) ,表面产生绿色瘤
状突起 ,瘤状突起逐步发育成绿苗 (图 8～10) ,继续
培养 ,整块愈伤组织转绿 ,并逐渐长成密集丛生苗
(图 11 ) ,绿苗分化率 87%。值得一提的是 ,经继代
培养后表面覆盖有毛状物的愈伤组织在 MS基本培
养基上也可分化出绿苗 ;将愈伤组织转接至 MS +
62BA 0. 5～3 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1培养基
上 ,愈伤组织也可分化 ,分化结果并不比在 MS基本
培养基中的好。
切割已分化的绿苗基部作为外植体 ,接至新鲜
MS + 2, 42D 4 mg·L - 1培养基上 ,诱导形成的愈伤
组织在 MS基本培养基上可再分化出绿苗。几年
来 ,我们一直维持着这个丛生苗 →愈伤组织 →愈伤
345
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
图版　沟叶结缕草的组织培养和无性系的建立
图 1　地下匍匐茎顶芽诱导形成丛生芽　　　　　　　　　　　图 2　丛生芽苗无性系
图 3　MS + 2. 42D 4. 0 mg·L - 1培养基上形成的愈伤组织 图 4　继代培养基上形成的愈伤组织
图 5　继代愈伤组织上有不定根分化 (显微照片 ) 图 6　继代愈伤组织细胞形态 (显微照片 )
图 7　愈伤组织转绿 图 8　愈伤组织分化出瘤状突起
图 9　愈伤组织上瘤状突起分化成小苗 图 10　愈伤组织上丛生苗形成
图 11　愈伤组织分化成无根绿苗 图 12　绿苗生根
445
第 5期 李国平等 :沟叶结缕草的组织培养和无性系的建立
组织分化 →丛生苗试管无性系 ,发现愈伤组织诱导
率和分化率较稳定 ,无甚变化。
214　生根培养与移栽
把上述实验形成的试管丛生苗切割成小丛后转
入生根培养基 1 /2 MS + NAA 1 mg·L - 1中进行光
照培养 ,一周后幼苗生出大量须根 (图 12) ,生根率
达 100%。成苗后 ,打开瓶口炼苗 5 d,取出小苗 ,洗
净琼脂 ,移栽至经 0. 1%高锰酸钾溶液消毒过的栽
培基质 (珍珠岩 ∶蛭石 = 1∶1)中 ,先在室内培养 3～4
d,然后再移至户外培养 ,成活率可达 95%以上。
3　结论与讨论
组织培养技术是生物技术的主要组成部分和基
础 ,只有建立起成熟的高频再生无性系 ,才能进行细
胞工程育种和基因转化的研究 [ 5, 6, 14 ]。禾本科草坪
草的高频再生体系的建立是比较困难的 [ 5, 7, 15, 16 ]。
通过本研究 ,建立起两个沟叶结缕草试管无性系保
持系统 :第一 ,以 MS + KT 3 mg·L - 1 + NAA 0. 1
mg·L - 1作为继代增殖培养基 ,建立起丛生芽苗 →
不定芽发生 →丛生芽苗速生试管无性系 ;第二 ,以
MS + 2, 42D 4 mg·L - 1作为愈伤组织诱导培养基 ,
以 MS基本培养基作为愈伤组织分化培养基 ,建立
起丛生苗 →愈伤组织 →愈伤组织分化 →丛生苗试管
无性系。第一个无性系是通过不定芽的分蘖而增
殖 ,约 35 d可继代一次 ,第二个无性系是通过愈伤
组织分化而增殖 ,从诱导愈伤组织形成至再生植株
约需 75 d。第一个无性系不仅继代时间短、增殖系
数高 ,而且芽苗健壮 ,连续继代保持不衰 ,是比较理
想的无性系 ;第二个无性系中愈伤组织的诱导率和
分化率较高 ,但其缺点是愈伤组织形成的时间偏长 ,
且愈伤组织继代培养后趋于分化不定根 ,不适宜连
续继代培养。赵永辉等 [ 17 ]报道 ,从结缕草 ( Z. ja2
pon ica Steud. )种胚诱导获得的愈伤组织可以进行连
续继代培养并保持生长分化能力。本项研究结果与
之不同 ,究其原因可能是物种差异、外殖体来源不同
或培养条件不同等因素所致。愈伤组织的继代培养
问题有待进一步研究。
在沟叶结缕草的组织培养中 ,有两点值得一提 ,
一是愈伤组织的诱导过程中 ,要进行一定时间的暗
培养 ,这样有利于愈伤组织的形成 ,而愈伤组织的分
化则需在光照条件下 ,暗培养不利于愈伤分化 ;二是
2, 42D是诱导沟叶结缕草胚性愈伤组织所必需的因
素 , 2, 42D诱导的愈伤组织在 MS基本培养基上可完
成很好的分化。我们初步认为 ,这种愈伤组织已经
在生理上决定了体细胞胚胎发生方向 ,愈伤组织的
分化可能通过体细胞胚胎发生途径 ,但有关沟叶结
缕草体细胞胚胎发生的详细过程还有待进一步研
究。
本研究建立起的两个沟叶结缕草试管无性系可
作为研究植物离体培养中器官发生调控机制的一个
良好实验体系 ;同时 ,沟叶结缕草试管无性系的建立
为细胞工程育种和基因转化的研究奠定了基础。
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