全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042617204
花生品种间杂种 F1 代的 SSR 标记分析
陈　静　胡晓辉　石运庆　苗华荣　禹山林
(山东省花生研究所 ,山东 青岛　266100)
摘　要 :以花育 22 号和 Sunoleic 95R 为亲本配置杂交组合 ,获得杂种 F1 ,利用 SSR 引物对亲本和杂种 F1
各单株进行扩增 ,分析其带型 ,辨别真伪杂种 ,并对亲本和杂种 F1 各单株的农艺性状、品质进行调查测
定。结果表明 :5 对引物 PM50 、PM179、PM15、PM384 和 PM348 对亲本、杂种 F1 各单株的分析结果是一
致的 ,15 个杂种 F1 单株中 ,8 株表现为母本带型 ,是伪杂种 ;7 株表现为杂合带型或父本带型 ,即真杂种。
但 5 对引物的带型表现存在明显差异 ,PM50、PM179、PM15、PM384 表现为双亲互补带型 , PM348 表现为
偏父本型。农艺性状和品质性状分析表明 ,真杂种与伪杂种的籽仁重、侧枝长、亚油酸含量、油酸含量差
异大 ,主茎高、蛋白质含量、脂肪含量差异较小。证实利用 SSR 标记辨别栽培种花生真伪杂种是可行
的。
关键词 :花生 ;SSR 标记 ;真伪杂种 ;品质 ;农艺性状
IDENTIFICATION OF PEANUT HYBRIDS ( Arachis hypogaea L. ) USING SSR MARKERS
CHEN Jing 　HU Xiao2hui 　SHI Yun2qing 　MIAO Hua2rong 　YU Shan2lin
( Shandong Peanut Research Institute , Qingdao , Shandong 　266100)
Abstract :In order to identify self2crosing and hybrids , DNA was extracted from leaf tissue of parents and F1 plants , and SSR
markers were used for amplification , and the bands separated by polyacrylamide gel electrophoresis. By comparing the resulting
bands patterns to those of parents , seven plants of the putative hybrids were shown to be true hybrids. The amplification bands
of hybrids were complementary with that of the parents , or similar with that of the male parent . On the basis of agronomic and
qualitative analysis between the true and the false hybrids , the true hybrids had much more difference from the false hybrids in
seed weight , branch length , linoleic content and oil content , and had much less difference from the false hybrids in stem
height and oil content . This method provides a reliable assay to identify hybrids , and should result in greater efficiency and
more effective use of resources in peanut breeding programs.
Key words :peanut ; SSR ; true and false hybrids ; quality ; agronomy trait
收稿日期 :2008212223 　接受日期 :2009203217
基金项目 :山东省良种工程 ,国家科技支撑计划课题 (2006BAD01A04)
作者简介 :陈静 (19762) ,女 ,山东兖州人 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事花生遗传育种研究。Tel :0532287631512 ; E2mail :mianbaohua @yahoo. com. cn
通讯作者 :禹山林 (19562) ,男 ,山东莱州人 ,研究员 ,主要从事花生遗传育种研究。Tel :0532287626830　　花生是严格的自花授粉作物[1 ] ,理论上讲 ,品种间杂交后获得真杂种 F1 的机率很大 ,但实际操作并非如此 ,产生伪杂种的主要原因是花生花器结构较小 ,杂交过程中母本去雄不及时或不彻底 ,导致自交形成伪杂种。以往人们多利用亲本间的表型差异 ,通过田间鉴定去除伪杂种。但随着花生育成品种的遗传基础日益狭窄[2～4 ] ,花生科研人员在育种工作中选用的亲本表 型差异较小 ,导致利用其配置杂交组合获得的杂种表型差异极小 ,即便是具备丰富育种经验的育种者也难以通过表型性状辨别伪杂种 ;同时花生分子育种的前期工作已逐步展开 ,创建回交群体、代换系群体是必然的[5 ,6 ] ,创建这些遗传群体均要求苗期就进行伪杂种的辨别 ,但绝大多数品种配置的杂种在苗期均无法通过表型性状辨别真伪 ,因此探索快速、有效地鉴别双亲及
716　核 农 学 报　2009 ,23 (4) :617～620Journal of Nuclear Agricultural Sciences
真实杂种的方法非常必要。本研究利用 SSR 标记对
花育 22 号和 Sunoleic 95R 为亲本杂交获得的杂种 F1
单株进行分析 ,辨别因杂交工作中的疏忽产生的伪杂
种 ,进而通过对亲本和杂种 F1 各单株的农艺性状调
查、品质测定 ,证实利用 SSR 标记辨别栽培种花生真
伪杂种是可行的。
1 　材料与方法
111 　材料
母本 (P1 )花育 22 号是山东省花生研究所育成的
传统出口型大花生 ,2003 年通过山东省农作物品种审
定委员会审定[7 ] ;父本 ( P2 ) Sunoleic 95R 是来自美国的
一个高油酸品种[8 ] 。
112 　材料种植与取样
2007 年以 P1 、P2 为亲本配制杂交组合 ,收获杂交
种 ;2008 年单株种植 P1 、P2 和 F1 ,苗期剪取幼叶 ,放置
于冰箱备用。成熟时单株收获 P1 、P2 和 F1 ,调查单株
主茎高、侧枝长、籽仁重。
113 　SSR标记分析
将 P1 、P2 、F1 的单株幼叶采用 CTAB 法提取
DNA[9 ] 。SSR 引物序列参照文献 [ 10 ] ,由北京华大基
因研究中心合成。采用 15μl PCR 反应体系 : 模板
115μl ,Taq 酶 012μl ,10 ×Taq Buffer 715μl ,引物 016μl ,
ddH2O 416μl。SSR 反应程序 :94 ℃预变性 3min ;94 ℃变
性 1min ,55 ℃退火 1min ,72 ℃延伸 90s ,34 个循环 ;72 ℃
延伸 10min。4 ℃保存。扩增产物在 8 %非变性 PAGE
凝胶上分离 ,银染法显带。所有胶板均拍照存档 ,以备
SSR 电泳谱带统计。
114 　品质测定
利用建立的近红外模型测定花生籽仁蛋白质含
量、脂肪含量以及油酸和亚油酸占脂肪酸总量的百分
率[11 ] 。采用德国布鲁克光谱仪器公司产 Matrix2E型傅
立叶变换近红外光谱仪 ,使用漫反射大体积积分球作
为光谱采集手段 ,采样光斑直径 2cm ,高灵敏度的检测
器 ,扫描谱区范围 4000～10000cm- 1 ,扫描次数 64 次 ,
分辨率为 8cm - 1 。采用旋转样品台以增加采集面积 ,
样品杯内径 5cm。每个单株测量 3 次 ,取平均值。
2 　结果与分析
211 　杂种 F1 苗期的 SSR 分析
利用 67 对 SSR 引物分析亲本的多态性 ,其中 62
对引物获得扩增产物 ,5 对引物未获得扩增产物 ,两亲
本间表现多态性的引物有 15 对 ,选择其中扩增带型好
的 5 对引物用于辨别真伪杂种 F1 。由表 1、图 1 可知 ,
杂交后获得的 15 个单株中 ,有 8 株表现为母本带型 ,
是伪杂种 ;有 7 株表现为杂合带型或父本带型 ,是真杂
种。5 对引物对于辨别杂种 F1 各单株真伪的结果是
一致的 ,但其带型表现存在明显差异 , PM50 、PM179、
PM15、PM384 表现为双亲互补带型 , 而 PM348 表现为
偏父本型。
表 1 　亲本和 F1 的 SSR带型表现
Table 1 　Banding pattern of SSR primers
in F1 and its parents
亲本和 F1
parents and F1
单株数
No. of plant
SSR 标记带型 banding pattern of SSR marker
PM50 PM179 PM15 PM384 PM348
母本 P1 1229 A A A A A
female parent 1230 A A A A A
父本 P2 2219 B B B B B
male parent 2220 B B B B B
1231 H H H H B
1232 A A A A A
1233 A A A A A
1234 A A A A A
1235 A A A A A
1236 A A A A A
1238 H H H H B
F1 1239 H H H H B
1240 A A A A A
1241 H H H H B
1243 H H H H B
1244 H H H H B
1245 A A A A A
1246 H H H H B
1247 A A A A A
注 :A :P1 带型 ;B :P2 带型 ;H :杂合带型。
Note: A : P1 banding pattern ; B : P2 banding pattern ; H: heterozygous banding
pattern
212 　杂种 F1 的农艺性状分析
为验证 SSR 标记在苗期辨别真伪杂种的可靠性 ,
进一步分析亲本和 F1 各单株的农艺性状。由图 2 可
以看出 ,P1 、P2 和 F1 籽仁种皮均为粉色 ,P1 籽仁大 ,P2
籽仁较小 ,真杂种 F1 籽仁大小介于两亲本之间 ,而伪
杂种籽仁大小与母本 P1 相像。表 2 显示亲本 P1 与 P2
的籽仁重、侧枝长存在较大差异 ,而主茎高差异较小。
P1 籽仁重为 9196 和 9169g ,P2 籽仁重为 6134 和 519g ,
真杂种 F1 籽仁重介于 6184～8162g ,而伪杂种籽仁重
介于9138～10194g 。P1 侧枝长为58和55cm , P2 侧枝
816 核　农　学　报 23 卷
图 1 　SSR 引物对亲本和 F1 各单株扩增效果
Fig. 1 　Amplification results of SSR primes in F1 and its parents
A :引物 PM50 的扩增效果 ;B : 引物 PM179 的扩增效果
A : Amplification results of PM50 ;B :Amplification results of PM179
1～20 泳道 :M ,1229 ,1230 ,2219 ,2220 ,1231 ,1232 ,1233 ,1234 ,1235 ,1236 ,1238 ,1239 ,1240 ,1241 ,1243 ,1244 ,1245 ,1246 ,1247
1～20 lane :M ,1229 ,1230 ,2219 ,2220 ,1231 ,1232 ,1233 ,1234 ,1235 ,1236 ,1238 ,1239 ,1240 ,1241 ,1243 ,1244 ,1245 ,1246 ,1247
图 2 　亲本 (P1 ,P2 )和 F1 的籽仁大小
Fig. 2 　Seed size of parents (P1 ,P2 ) and F1
长为 90 和 80cm ,真杂种 F1 侧枝长介于 61～87cm ,而
伪杂种侧枝长介于 41～ 52cm。P1 主茎高为 56 和
54cm ,P2 主茎高为 47 和 44cm ,真伪杂种主茎高无明显
差异。
916　4 期 花生品种间杂种 F1 代的 SSR 标记分析
表 2 　亲本和 F1 的农艺性状表现
Table 2 　Agronomic characters of parents and F1
亲本和 F1
parents
and F1
单株
No. of
plant
主茎高
height of
stem(cm)
侧枝长
length of
branch(cm)
籽仁重
weight of seed
(gΠ10grain)
P1
1229 56 58 9196
1230 54 55 9169
P2
2219 47 90 6134
2220 44 80 519
1231 55 61 8162
1232 50 42 10101
1233 48 40 10187
1234 46 52 9157
1235 52 52 9138
1236 48 50 10194
1238 53 67 7140
F1 1239 50 87 6184
1240 49 45 10108
1241 43 81 7140
1243 50 68 7152
1244 53 70 7123
1245 49 41 9169
1246 51 62 8104
1247 50 42 9163
213 　杂种 F1 的品质分析
利用近红外品质测定方法对亲本和 F1 各单株进
行品质分析。由表 3 可知 ,亲本 P1 与 P2 籽仁亚油酸
和油酸含量差异较大 ,蛋白质和脂肪含量差异较小。
亲本 P1 亚油酸含量为 30130 %和 28146 % ,油酸含量为
50197 % 和 53158 % , P2 亚 油 酸 含 量 为 1199 % 和
2186 % ,油酸含量为 83195 %和 82159 %。真伪杂种 F1
的油酸和亚油酸含量差异也较大 ,7 株真杂种 F1 的油
酸均高于母本的油酸含量 ,除单株 1231 油酸含量为
55179 %外 ,其他单株油酸含量均在 60 %以上 ,8 株伪
杂种油酸含量在 53141 %以下 ;真杂种 F1 的亚油酸含
量变幅为 15107 %～26110 % ,远低于母本的亚油酸含
量 ,而伪杂种的亚油酸含量与母本的亚油酸含量基本
相当。真伪杂种 F1 的蛋白质和脂肪含量则没有明显
差异。
3 　结论与讨论
本研究利用 5 对 SSR 引物分析了 2 个品种间杂种
F1 的真伪 ,其中 4 对引物的扩增带型为双亲互补带
型 ,1 对引物的扩增带型为偏父本型 ,由此可见 ,同一
组合亲本和杂种用不同 SSR 引物扩增往往表现不同
的带型特征 ,有偏父本型、双亲互补带型和偏母本型 ,
表 3 　亲本和 F1 的营养品质表现
Table 3 　Nuttition Quality of parents and F1
亲本和 F1
parents and F1
单株
No. of
plant
蛋白质
protein
( %)
亚油酸
linoleic
( %)
油酸
oleic
( %)
脂肪
oil
( %)
P1
1229 25137 30130 50197 50197
1230 25155 28146 53158 51190
P2
2219 25186 1199 83195 48156
2220 26143 2186 82159 45145
1231 27185 26110 55179 53194
1232 26102 28189 52141 51168
1233 26190 31195 48169 52178
1234 27102 29189 53141 50168
1235 27120 31132 49154 48199
1236 26186 32193 47143 54105
1238 27189 16127 67115 52173
F1 1239 27167 15107 68144 50121
1240 25119 34108 46119 51131
1241 27162 18137 64137 51166
1243 27152 21103 61160 50184
1244 26112 16182 68103 51173
1245 26173 32128 48140 51176
1246 27163 17130 66125 51151
1247 26132 28114 53124 53184
偏母本型无法对真伪杂种进行鉴别 ,偏父本型和双亲
互补带型能够鉴别真伪杂种 ,两者相比较而言 ,双亲互
补带型是鉴别杂种与亲本的最佳类型 , 因此筛选双亲
互补带型的引物有利于真杂种鉴定。通过农艺性状和
品质分析进一步证实利用 SSR 标记辨别品种间真伪
杂种是可行、可靠的 ,且该方法具备快速、重复性高、不
受时间和生长环境影响等优点[12 ] 。在育种过程中 ,利
用该方法辅助选择杂种 ,提高了真杂种的选择效率 ,有
助于促进育种进程。另外创建回交群体、代换系群体
时要求苗期就要进行伪杂种的辨别 ,SSR 标记具备在
苗期鉴定真杂种的特点 ,所以利用 SSR 标记辅助创建
这些遗传群体 ,确保了所创建群体遗传来源的可靠性。
利用近红外模型分析作物品质 ,如在小麦、水稻、
花生的研究均有报道[11 ,13 ,14 ] 。本研究利用花生各项品
质指标的近红外模型对亲本和杂种各单株进行分析 ,
显示出各单株品质差异趋势 ,表明利用该方法对较大
的变异群体或较大变异的群体进行品质分析时是可行
的 ,且对于品质育种来讲提供了重要的技术支撑。
参考文献 :
[ 1 ] 　万书波. 中国花生栽培学[M] . 上海 :上海科学技术出版社 , 2003
[ 2 ] 　唐荣华 ,庄伟建 ,高国庆 ,韩柱强 ,钟瑞春 ,贺梁琼 ,周翠球. 珍珠
豆型花生的简单序列重复 (SSR) 多态性[J ] . 中国油料作物学报 ,
2004 ,26 (2) :20 - 26 (下转第 625 页)
026 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (4) :617～620
早熟禾种子形成了愈伤组织 ,说明固化物种类对愈伤
组织的诱导率没有影响 ;但用 Gelrite 固化的培养基上 ,
愈伤组织的鲜重和干重均为琼脂固化培养基的 2
倍[11 ] 。谢海燕等[12 ] 发现 ,只有在 Phytagel 作固化物的
培养基上 ,普通狗牙根种子形成了胚性愈伤组织。本
实验室在对 4 种草坪草种子愈伤组织的诱导试验中也
发现不同固化物的效果存在差异[13 ] 。本试验发现 ,愈
伤组织诱导率最高的是 Phytagel。Phytagel 对胚性愈伤
组织的发生和维持胚性能力正效应的原因并不清楚。
但是对其同类固化剂 Gelrite 的研究发现 , Gelrite 比琼
脂所含的生长抑制物质要少[14 ] ; Gelrite 可以防止香蕉
愈伤组织变色 ,而琼脂却不能 [15 ] 。还有研究表明 ,
Gelrite 比琼脂含有更多的无机成分 ,同时对某些阳离
子具有束缚作用[16 ] 。因此 ,对于离体培养比较困难的
草坪草 ,进行固化物种类及其浓度的筛选 ,以提高愈伤
组织的数量和质量是有重要意义的。
由于本试验采用的是匍匐茎 ,材料制备和灭菌等
过程耗时较长 ,难度较大 ,故未进行多因子的正交设计
来探讨各因子的最优配比 ,需在今后的试验中加强。
参考文献 :
[ 1 ] 　Chai B , Sticklen M B. Application of biotechology in turfgrass genetic
Improvement[J ] . Crop Sci , 1998 , 38 :1320 - 1338
[ 2 ] 　张　磊 ,胡繁荣 ,沈希宏 ,马传喜 ,吴殿星. 草坪草生物技术进展
及研究热点[J ] . 核农学报 ,2004 , 18 (5) :372 - 375
[ 3 ] 　Zhong H , Bolyard M G, Srinivasan C , Sticklen M B. Transgenic plants
of turfgrass ( Agrostis palustris Huds. ) from microprojectile bombardment
of embryogenic callus [J ] . Plant Cell Rep , 1993 , 13 :1 - 6
[ 4 ] 　Chai M L , Senthil K, Mo S Y, Chung Y S , Cho S H , Shin J S , Park M
H , Kim K H. Embryogenic callus induction and Agrobacterium2mediated
transformation in bentgrass ( Agrostis spp . ) [J ] . Journal of the Korean
Society for Horticultural Science , 2000 ,41 (5) :450 - 454
[ 5 ] 　Guo Z F , Bonus S , Meyer W A , Day P R , Belanger F C. Transgenic
creeping bentgrass with delayed dollar spot symptoms [ J ] . Molecular
Breeding , 2003 , 11 :95 - 101
[ 6 ] 　胡繁荣. 农杆菌介导获得转基因抗虫匍匐翦股颖植株[J ] . 农业
生物技术学报 ,2005 , 13 (2) :262 - 263
[ 7 ] 　Wang Z Y, Ge Y X. Rapid and efficient production of transgenic
bermudagrass and creeping bentgrass bypassing the callus formation phase
[J ] . Functional Plant Biology , 2005 ,32 (9) :769 - 776
[ 8 ] 　Hu S L , Chai M L , Guo D C , Niu Y M , Dong L S. In vitro clonal
propagation of three zoysiagrass species [ J ] . International Turfgrass
Society Research Journal , 1993 ,7 :812 - 815
[ 9 ] 　李国平 ,杨鹭生 ,胡文英 ,黄群策. 沟叶结缕草的组织培养和无性
系的建立[J ] . 林业科学研究 , 2005 , 18 (5) :541 - 545
[10 ] 　Dhandapani M , Hong S B , Aswath C R , Kim D H. Regeneration of
zoysia grass ( Zoysia matrella L. Merr. ) cv. Konhee from inflorescences
and stem nodes[J ] . In Vitro Cell Dev Biol2Plant , 2008 ,44 :8 - 13
[11 ] 　Van Ark H F , Zaal M A C M , Creemer2Molenaar J , Van der Valk P.
Improvement of the culture response of seed2derived callus cultures of
Poa pratensis L. : Effect of gelling agent and abscisic acid [J ] . Plant
Cell , Tissue and Organ Culture , 1991 , 27 :275 - 280
[12 ] 　谢海燕 ,毛碧增 , 单兰兰 , 陈毓荃. 狗牙根颖果胚性愈伤组织的
诱导和胚性细胞的超微结构及植株再生[J ] . 植物生理与分子生
物学学报 , 2004 , 30 (2) :209 - 215
[13 ] 　王贺飞 ,柴明良. 4 种固化剂对若干草坪草愈伤组织诱导的影响
[J ] . 园艺学报 ,2006 , 33 (2) :437 - 440
[14 ] 　Koda T , Ichi T , Yamagishi H , Yoshikawa H. Effects of phytohormones
and gelling agents on plant regeneration from protoplasts of red cabbage
[J ] . Agric Biol Chem , 1988 ,52 :2337 - 2340
[15 ] 　Huang L C , Chi D L. Pivotal roles of picloram and Gelite in banana
callus culture[J ] . Environ Exp Bot , 1988 , 28 :249 - 258
[16 ] 　Winkle Van S C , Johnson S , Pullman G S. The impact of Gelrite and
activated carbon on the elemental composition of two conifer embryogenic
tissue media[J ] . Plant Cell Rep , 2003 , 21 :1175 - 1182
(上接第 620 页)
[ 3 ] 　陈　静 ,胡晓辉 ,苗华荣 ,石运庆 ,迟玉成 ,崔风高 ,吴兰荣 ,禹山
林.利用 SSR 标记分析山东省花生区试品种的遗传多样性特点
[J ] . 中国农学通报 ,2008 ,24 (12) :105 - 110
[ 4 ] 　唐荣华 ,贺梁琼 ,高国庆 ,庄伟建 ,韩柱强 ,钟瑞春. 多粒型花生的
SSR 分子标记[J ] . 花生学报 ,2004 ,33 (2) :11 - 16
[ 5 ] 　何风华 ,席章营 ,曾瑞珍 , Akshay Talukdar ,张桂权. 利用高代回交
和分子标记辅助选择建立水稻单片段代换系 [J ] . 遗传学报 ,
2005 , 32 (8) :825 - 831
[ 6 ] 　徐华山 ,孙永建 ,周红菊 ,余四斌. 构建水稻优良恢复系背景的重
叠片段代换系及其效应分析[J ] . 作物学报 ,2007 ,33 (6) :979 - 986
[ 7 ] 　吴兰荣 ,陈　静 ,石运庆 ,苗华荣 ,齐 　卫 ,陈效东 ,胡文广. 射线
与杂交相结合选育新品种花育 22 号[J ] . 核农学报 ,2006 ,3 :309 -
312
[ 8 ] 　Gorbet D W , Knauft D A. Registration of Sun oleic 95R peanut [J ] .
Crop Science , 1997 , 37 :1392
[ 9 ] 　陈 　静 ,胡晓辉 ,苗华荣 ,崔风高 ,禹山林. CTAB 法提取花生总
DNA 在 SSR 和 SRAP 中的扩增效果[J ] . 花生学报 ,2008 ,37 (1) :29
- 32
[10 ] 　唐荣华. 花生属种质资源遗传多态性和分子分类研究[ D] . 福建
农林大学 :博士论文 ,37 - 39
[11 ] 　禹山林. 傅立叶近红外漫反射非破坏性测定花生种子蛋白质及
含油量[J ] . 花生学报 ,2003 ,增刊 :138 - 143
[12 ] 　Michael S Gomez , Nicholas Denwar , Ramasubramanian T , et al .
Identification of Peanut Hybrids Using Microsatellite Markers and
Horizontal Polyacrylamide Gel Electrophoresis [ J ] . Peanut Science ,
2008 ,35 (2) :123 - 129
[13 ] 　李　勇 ,魏益民 ,王　锋. 影响近红外光谱分析结果准确性的因
素[J ] . 核农学报 ,2005 ,3 :236 - 240
[14 ] 　陆艳婷 ,张小明 ,叶胜海 ,祁永斌 ,严文潮 ,王建清 ,金庆生. 粳稻
七种必需氨基酸含量近红外漫反射光谱分析技术研究[J ] . 核农
学报 ,2007 ,5 :478 - 482
526Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (4) :621～625