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用凝胶层析法和示踪技术评估腐植酸分子量
分级组成及其与 Cd、Zn 的络合特性
华　珞　陈世宝　白玲玉　韦东普
(中国农业科学院原子能利用研究所　北京　100094)
通过凝胶层析法对土壤腐植酸进行了分组提取 ,并对其各分子量分级组成及其
与 Cd、Zn 的络合特性进行了研究。结果表明 :土壤胡敏酸通过 G250 可以分成 3 个
较集中的组分 ,分子量分别为 M = 78180、M = 48339 及 M = 22863 ;通过 G2100 可以
得到 2 个组分 ,分子量分别为 M = 63343 和 M = 19870。富里酸通过 G250、G2100 层
析 ,则从总体上成为单一的宽带 ,分子量约为 M = 2300。腐植酸对 Cd、Zn 络合量的
测定显示 :胡敏酸对 Cd、Zn 的络合量呈 2 个明显的峰值 ,而富里酸只有 1 个峰值。
两者对 Cd、Zn 络合量随洗脱体积的变化曲线与其吸光值随洗脱体积的变化曲线相
一致。65 Zn 示踪技术研究65 Zn 与胡敏酸、富里酸络合的结论与常规方法一致。
关键词 :凝胶层析 　腐植酸 　分子量 　重金属 　络合量
国家自然科学基金及国家核工业基金资助项目　编号 :39470134 　Y7196F9601
此文于 1998 年 8 月 13 日收到。
凝胶层析是现代的物理化学分析方法 ,能最全面地解决许多有关土壤化学状态和功能团的
问题 (A. И. Карпухи,1989) [1 ] ,应用凝胶层析可简单快速研究络合物的分级组成、分子量范围等 ,
较之经典方法能更准确地测定络合物的物理、化学性质 ,成功地分离和立体切割了有机、无机络
合物 ,并研究其性质、特点及组成。用放射性2凝胶色层分析研究上述问题则更为有效。
凝胶层析法是以分子大小为基础的一种分离方法 ,通过多孔珠床而将分离物洗脱 ,该法的
主要原理是分离物的洗脱容积 Ve 是该物质分子量对数的线性函数 ,即 : Ve = K1 - K2lg M
( K1 、K2 为常数 ,M 为分子量) ,Ve 也可用 Ve - Vo (分离体积)或 Kav代替 Kav = (Ve - Vo) / (Vt
- Vo) = 流动相体积/ 固定相体积 (分配系数) ,即 Kav = - K2lgM + K1 或 lgM = ( K1 - Kav) / K2 。
1 　材料与方法
111 　供试腐植酸
供试腐植酸提取土样为北京浅色草甸褐土 ;腐植酸提取按照国际腐植酸协会 ( IHSS) 推荐
的方法 ,采用 Na4 P2O7/ NaOH 法 ,即用 011M NaOH 提取腐植酸 ,粗腐植酸样品用 1∶1 的
011mol/ L HCl/ 013mol/ L HF 洗涤以降低残余无机物的含量 ,用傅立叶红外光谱和核磁共振
波谱检验其结构和纯度。
112 　HA的纯化
HA (沉淀)加蒸馏水洗涤多次 ,离心得到 HA 悬液 ,用 1∶1 的 011mol/ L HCl/ 013mol/ L HF
632 　核 农 学 报　1999 ,13 (4) :236～241Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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洗涤数次 ,通过半透膜透析至无 Cl 离子 ,得出纯 HA 悬液 ,转至蒸发皿在 50 ℃恒温水浴 ,于
50 ℃真空冰冻干燥 ( P2O5) ,得到 HA 制品 ,用刀片刮出即得纯净 HA。
113 　FA的纯化
FA 橙黄清液通过活性炭柱 ,弃去流出液 ,蒸馏水洗至无酸性 ,加 012mol/ L 或 0105mol/ L
NaOH 洗涤活性炭层 ,至洗脱液近乎无色 ,得到 FA 碱性溶液 ,通过氢式强酸型离子交换树脂 ,
得到 FA 纯净清液 ,在 50 ℃恒温水浴浓缩 ,移至蒸发皿 ,于 50 ℃冰冻真空干燥 ( P2O5) ,得到 FA
制品 ,刀片刮出得到 FA 制品。
114 　试验仪器与装置
层析柱规格为 1165 ×36cm ;葡聚糖 (Sephadex)型号为 G250 及 G2100 ;洗脱液为 0105mol/
L 的 TRIS 洗脱液 (p H810) ;采用 Mariotte 瓶保持洗脱液的静水压以保持恒定流速 ,用 BSZ230
自动部分收集器收集洗脱液 ;用 WFZ8002D3A 型紫外/ 可见分光光度计测定洗脱液的光密度
(280nm) ,用 WFD2Y3 原子吸收分光光度计测定洗脱液中 Cd、Zn 的含量。
115 　凝胶参数的测定
凝胶柱体积 Vt = 3114 ×(D/ 2) 2h (h 为凝胶柱高度 ,D 为凝胶柱直径) ;外水体积 Vo ,即柱
床颗粒间的自由空间所含水的体积 ,溶解兰色 Sephadex G22000 (2mg/ ml) ,取 1ml 该溶液通过
G250、G2100 凝胶柱 ,收集洗脱液 ,测定其洗脱曲线 (紫外吸收 280nm) ,洗脱峰顶洗出的体积即
为 Vo ;内水体积 Vi ,即凝胶颗粒内部孔隙所含水相的体积 ,选用一种分子量小于凝胶工作范
围下限的化合物 (吸取 1ml K2Cr2O4 溶液通过 G250、G2100) ,收集其洗脱液测定其洗脱峰 ,洗脱
体积为 Ve ,则 Vi = Ve - Vo。
116 　腐植酸的层析
凝胶处理 :分别称取 G250 8g、G2100 6g 在沸水浴中溶胀 2h ,抽出空气 ,用 TRIS 浸泡待
用 ;装柱 :垂直装好洗净的层析柱 ,注意防止出现“纹路”,平衡柱床 ,用细胞色素 C 检查柱床是
否偏斜后待用 ;上样及洗脱 :将 TRIS 洗脱液装入洗脱瓶 ,保持 25cm 操作压 ,用柱上螺旋控制
流速在 015ml/ min ,利用自动部分收集仪 ,收集洗脱液。
117 　分子量的测定
将标准低分子量蛋白用 TRIS 溶解 ,吸取 1ml 溶液 (浓度为 2～3mg/ ml) 上样。洗脱条件
与 HA、FA 相同 ,根据蛋白洗脱峰的位置 ,通过紫外吸收曲线测出每种蛋白质的洗脱体积
(Ve) ,以蛋白分子量对数 logM 与 Ve 作标准曲线图 ,根据 HA、FA 紫外检出的洗脱峰的位置量
出洗脱体积 ,分别由标准曲线查得样品的分子量。
118 　腐植酸与65 Zn 的络合量测定
除了在洗脱液 (1000ml)中加入活度为 172 ×104Bq 的65 ZnCl2 外 ,其余条件与有机络合量
研究试验保持相同。每试管收集 3ml 液 ,收集的65 Zn2腐植酸液体置于 100ml 平底烧杯中 ,用
HPGe2GC230182γ谱仪进行放射性活度测定 ,仪器测量误差控制为 Err < 5 %。
2 　结果与讨论
211 　凝胶参数测定
柱床体积 Vt :Vt = 3114 (D/ 2) 2h = 3114 ×(D/ 2) 2 ×36 = 76194cm3 ;
外水体积 Vo :用兰色葡聚糖 G22000 过滤 ,得 Vo = 25140ml ;
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内水体积 Vi :用铬酸钾过柱 ,测定其洗脱峰体积 Ve ,则
　　Vi = Ve - Vo = 7115 - 2514 = 4611ml
212 　标准蛋白分子量曲线方程
用标准分子量蛋白过凝胶柱 (215ml/ 5min) ,将淋洗液通过紫外/ 可见分光光度计 ,检测出
各标准蛋白的洗脱峰体积 (见表 1) 。根据 Kav = - K2lgM + K1 对 G250 模拟方程得 : Kav =
- 116013lg M + 719403 ( R2 = 019606) ,由此得出 : K1 = 719403 , K2 = 116013 ;对 G2100 模拟方
程得 : Kav = - 116972lgM + 815011 (R2 = 019901) ,得出 : K1 = 815011 , K2 = 116972。
表 1 　各种标准蛋白分子量的凝胶过滤
Table 1 　Gel filt ration of different molecular weight of protein
名称
Name
分子量
Molecular
weight
lg M
洗脱体积
Volume of eluent
(ml)
G250 G2100 吸光值Optical densityA260nmG250 G2100 分配系数Distribution coefficientKavG250 G2100
磷酸化酶
Phosphory lase
94000 41973 2715 3010 0167 0171 01041 0109
牛血清蛋白
BSA 67000 41826 3715 4215 0190 0198 01235 01332
肌动蛋白
Actin
43000 41633 4715 5510 0192 1110 01429 01574
碳酸酐酶
Carbonic anhydrase
30000 41477 6010 7010 1110 1121 01671 01865
烟草花叶病毒
TMV
外壳蛋白
coat protein
17500 41243 9010 9510 0184 0190 11253 11351
213 　腐植酸分子量的测定[2 ,3 ]
在保持与上述蛋白凝胶过滤条件一致的情况下 (pH810 ,20cm 高水柱 ,015ml/ min ,腐植酸浓
度为 2mg/ ml ,215ml/ 管) ,根据 Kav = (Ve - 2514) / 51154 = - 116013lgM + 719403 ( G250) ,测得腐
植酸分子量分布情况。以淋出体积为横座标 ,以腐植酸的光密度值为纵座标 ,可得 1 条随洗脱体
积逐渐增加腐植酸各组分出现的曲线图 (见图 1、图 2) 。从图中可以看出 ,胡敏酸通过 G250 的凝
胶过滤 ,得到了 3 个多分散的组分 ,其分子量分别为 M = 78180、M = 48339 及 M = 22863 ; 而对于
图 1 　胡敏酸的凝胶过滤 ( G250)
Fig. 1 　Gel filt ration of humic acid by G250 图 2 　富里酸的凝胶过滤 ( G250)Fig. 2 　Gel filt ration of fulvic acid by G250
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富里酸则从总体上成为单一的宽带 ,分子量为 M = 2300。这一结论与 R. S. Cameron ;A. M.
Posner 及 R. S. Swift 基本是一致的[4～6 ] 。胡敏酸通过 G2100 的凝胶过滤 ,得到了近似两个多
分散的组分 ,分子量分别为 M = 63343 和 M = 19870 ;富里酸的过滤结果与上述相似。
214 　腐植酸不同分级组成对 Cd、Zn 的络合量测定
腐植酸是一类聚电解质 ,由分子量及芳构化程度不同的物质组成。芳构化程度不同 ,其分
子的总酸度、羧基、酚羟基、解离度及代换量都有很大的差异 ,故对 Cd、Zn 络合量也有较大变
化。试验结果如图 3 和图 4。在胡敏酸的组分中 ,其对 Cd、Zn 的络合量变化呈现出 2 个明显
的络合量峰值 ,相对应的分子量值大约都在 73130～78180 和 21983～23501 左右 , HA2Cd 的
浓度分别为 105104 和 107132mg/ kg ,HA2Zn 的浓度分别为 10818 和 106172mg/ kg。而在富里
酸组分中 ,其对 Cd、Zn 的络合量只呈现出 1 个峰值 ,对应分子量约为 2965～3170 之间 ,FA2Cd
和 FA2Zn 的浓度分别为 111188mg/ kg 和 112104mg/ kg ,这与 HA、FA 的光密度曲线变化是一
致的。这一结果证实了腐植酸的浓度与其吸光度之间有很好的相关性[7 ] 。从以上结果可以
看出 ,在 FA 组分中 ,由于其脂族性增强而结构相对简单 ,其 CH2 、 CH 及季 C 相对
增多 ,故单位质量浓度形成的络合物的浓度较 HA 高 ,而其络合物的稳定性却不如 HA。由于
HA 分子量较 FA 大 ,与金属 Cd2 + 、Zn2 +成络反应时形成的螯合效应较多 ,故形成的复合物稳
定性较大。
图 3 　HA 的不同分级组成对 Cd、Zn 的络合分析
Fig. 3 　Complexation of Cd and Zn with dif2
ferent gradations of humic acid
图 4 　FA 对 Cd、Zn 的络合分析
Fig. 4 　Complexation of Cd and Zn with dif2
ferent gradations of fulvic acid
215 　腐植酸与65 Zn 络合量的测定
试验结果见图 5 和图 6。从图中可以看出 ,65 Zn 与 HA 络合物放射性活度呈 2 个明显的
高峰 ,其活度分别为 2419CPS 和 2119CPS ,对应的胡敏酸分子量分别为 73130 和 23501。65 Zn
与 FA 络合物的放射性活度呈现 1 个明显的峰值 ,对应活度值为 2515CPS ,对应的富里酸分子
量约为 2594。65 Zn2HA ,FA 的放射性活度与体积的变化曲线与图 6 和图 7 基本相似 ,即前者
呈 2 个峰值而后者只呈单一的峰值 ,这与前面的结论是一致的 ,从而更进一步对常规方法的结
果进行了证实。
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图 5 　HA265 Zn 络合物放射性活度随洗脱体积的变化
Fig. 5 　Change of radioactivity of 65 Zn2humic
substance complexes with the volume
of eluent
图 6 　FA265 Zn 络合物放射性活度随洗脱体积的变化
Fig. 6 　Change of radioactivity of 65 Zn2fulvic
substance complexes with the volume
of eluent
3 　结 　论
11 通过凝胶层析方法测定腐植酸分子量的结果表明 :胡敏酸通过 G250 凝胶可以分成 3
个分子量分级组分 ,通过 G2100 凝胶也可以明显分成 2 个组分 ;而富里酸只有 1 个明显的组
分。
21 腐植酸对 Cd、Zn 络合量的测定显示 :胡敏酸对 Cd、Zn 的络合量呈 2 个明显的峰值 ,而
富里酸只有 1 个峰值。两者对 Cd、Zn 络合量随洗脱体积的变化曲线与其吸光值随洗脱体积
的变化曲线相一致。
31 65 Zn 示踪试验表明 :腐植酸的不同分级组成对65 Zn 的络合量有较大变化 ,其络合物的
放射性活度与洗脱体积的曲线与常规分析中的光密度与洗脱体积的曲线基本一致 ,即胡敏酸
-
65 Zn 呈两个络合峰值 ,而富里酸只有一个明显的峰值。该方法快速、准确 ,具有常规方法无
法比拟的优越性。
参 考 文 献
1 　Kapnyxn A N ,等. 土壤中有机金属络合物的性质与组成. 土壤学进展 ,1993 , (5) :29～33
2 　Hummel J P ,Dreyer W J . Measurement of protein2binding phenomena by gel filtration ,Biochim Biophys Acta ,1962 ,63 :530～
532
3 　Mantoura R F C , Riley J P. The use of gel fithation in the stady of metal binding by humic acids and related compands ,Analytica
Chimica Acta ,1975 ,78 :193～200
4 　Posner A M. Nature ,1963 ,198 :1161～1163
5 　Swift R S , Posner A M. J Soil Sci ,1971 , (112) :231～238
6 　Cameron R S , Swift R S , Thornton B K , Posner A M. J Soil Sci ,1972 ,23 :335～344
7 　Kuiters A T , Mulder W , Gel permeation chromatograghy and cu2binding of water2soluble organic substances ,from litter and hu2
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EVAL UATING THE MOL ECULAR WEIGHT AND CHARACTERISTICS OF
HUMIC ACIDS GRADATIONS USING GEL FILTRATION
AND RADIOISOTOPE TRACER TECHNIQUE
Hua Luo 　Chen Shibao 　Bai Lingyu 　Wei Dongpu
( Instit ute f or A pplication of A tomic Energy , CA A S , Beiji ng 　100094)
ABSTRACT
The measurement for molecular weight of humic acids gradations in the drab soil showed
that the humic acid could be separated into three gradations of molecular weight using gel f iltra2
tion by G250 and t wo gradations by G2100 , the molecular weights by G250 were 78180 , 48339 ,
22863 and molecular weights by G2100 were 63343 and 19870 respectively. While f ulvic acid had
only one gradation by both G250 and G2100 , the molecular weight was 2300 approximately. The
measurement for complexaton capacity of cadmium( zinc)2humic acids showed that the contents
of Cd( Zn)2humic acid had t wo peak values with the volume of eluent compounded by cadmium
( or zinc) . The Cd( or Zn)2f ulvic acid had only one peak value. The curve bet ween contents of Cd
( Zn)2humic acid and the volume of eluent met with the curve bet ween spectrum and the volume
of eluent. The experiment conducted by radioisotope tracer technique indicated that the complex2
ation capacity of 65 Zn2humic acids changed with different gradations of humic acids , the com2
plexation curve met with the spectrum curve on the whole , i. e. the value of 65 Zn2humic acid had
t wo peak values , while the 65 Zn2f ulvic acid had only one , indicating that the use of radioisotope
tracer technique could el iminate the intervention accompanied by other heavy metal ions.
Key words : Gel filt ration , humic acids , molecular weight , heavy metal , complexation
capacity
142Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (4) :236～241