全 文 ：带有正电荷。在酸性条件下壳聚糖可以得到充分的电离而带正
电荷，对呈负性离子的色素有良好的吸附和絮凝作用［5］。
不溶性壳聚糖法去除积雪草粗多糖中的色素用时短、操作简
单、效果佳，并且在此过程中对多糖保留影响小。通过正交实验
得出积雪草多糖脱色的最优条件是:温度 25℃，pH 4． 5，脱色时
间 60min，壳聚糖(g) :0． 5 mg /ml 积雪草多糖(100 ml)为 3． 0∶
1，能使脱色率达到 64． 24%，多糖保留率 80． 11%。
参考文献:
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水生态学杂志，2009，2(3) :42．
收稿日期:2010-06-20; 修订日期:2010-12-07
基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(No． 0992025 － 22) ;
广西自然科学基金(No．桂科自 0991137)
作者简介:肖云晓(1983-) ，女(汉族) ，山东烟台人，现为广西医科大学在
读硕士研究生，主要从事海洋药物应用研究工作．
* 通讯作者简介:庞 辉(1962-) ，女(汉族) ，广西博白人，现任广西医科
大学基础医学院教授，硕士研究生导师，硕士学位，主要从事海洋药物应
用研究工作．
螺旋藻激酶分离提纯方法初探
肖云晓，陈高斯，庞 辉*
(广西医科大学，广西 南宁 530021)
摘要:目的 研究螺旋藻激酶的分离纯化方法，为工业化放大生产螺旋藻激酶药物提供一定的实验依据，为后续的酶学性
质研究打下基础。方法 配制螺旋藻激酶粗酶液，通过离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析来分离提纯螺旋
藻激酶，最后用 SDS － PAGE电泳法验证螺旋藻激酶纯度，测定分子量。结果 通过一系列的分离提纯得到了较纯的蛋
白，酶回收率达到 42． 3%，纯化倍数达到 6． 1。所得螺旋藻激酶的分子量为 40 KD。结论 初步探索出较为优化的螺旋藻
激酶的分离纯化方法。
关键词:螺旋藻激酶; 分离纯化; 凝胶层析
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 06． 053
中图分类号:R284． 2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)06-1399-02
近年来，随着人们生活水平的提高，心、脑血管血栓栓塞性疾
病发病率逐年提高，已成为我国人口死亡的首位原因［1］。开发
研制出高效、低毒、特异、经济的防治血栓性疾病的食品和药品对
人类健康具有重大意义，也是人类健康的迫切需要。自 1991 年，
日本科学家须见洋行从纳豆中发现纳豆激酶(Nattokinase，NK) ，
微生物来源的溶栓酶逐渐引起人们重视，有关如何优化产酶菌株
发酵条件的研究也成为人们关注的热点问题［2 ～ 4］。
广西北海广泛养殖的螺旋藻，不仅具有极高的营养价值，含
有丰富的蛋白质、维生素、矿物质和多种微量元素。而且还具有
广泛的药用价值，如增强免疫力、抗癌、降血脂、抗氧化、抗疲劳、
抗诱变、抗辐射、抗胃溃疡、抗血栓、抗过敏等。
根据其特点筛选特殊的菌种经过发酵产生含蛋白激酶(称
为螺旋藻激酶)的特殊螺旋藻粉，再经生物发酵后制备出含有蛋
白激酶的特殊螺旋藻产品，前期的研究已经证明其不仅具有抗凝
血作用，而且具有直接溶解血栓作用［5］。
本研究从经发酵的特殊螺旋藻粉出发，由粗提液中确立螺旋
藻激酶的分离纯化方法，为该酶进一步研究，开发新型的溶栓药
物奠定理论基础。
1 材料
1． 1 原料 螺旋藻激酶发酵提取物粉剂，由广西北海市康福保健
食品有限公司提供。
1． 2 试剂 尿激酶，丽珠集团丽珠制药厂;凝血酶，河南省中泰药
业有限公司;纤维蛋白原冻干粉，广西医科大学实验中心蛇毒所;
考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程公司;BM201，低分子量蛋
白质标准品上海生工生物工程有限责任公司;葡聚糖凝胶 Sepha-
dex G － 75，Pharmacia;PBS磷酸盐缓冲液(干粉) ，上海嘉适科学
仪器有限公司;SDS分析纯，中药集团上海化学试剂公司;Tris 分
析纯，上海精细化工科技有限公司。
2 方法
2． 1 工艺流程 螺旋藻激酶粗酶液制备———前处理(除菌、除杂
蛋白、降黏度)———层析柱———较纯螺旋藻激酶提取物———测试
或冷冻保藏、冻干保藏;或进一步提纯。
2． 2 螺旋藻激酶粗酶液制备 取螺旋藻干粉 20 g，加入 200 ml三
蒸水，在层析冷柜中搅拌均匀，4℃下静置过夜，低温离心(4℃，
3 000 r /min，10 min)后弃去沉淀，上清液即为 SPK粗酶液。
2． 3 酶蛋白的分离 上清液饱和硫酸铵分级盐析，沉淀物经脱盐
透析和 SephadexG － 75 凝胶层析等步骤进行分离纯化。
2． 4 SDS － PAGE电泳 分离胶浓度 30%，浓缩胶浓度 10%。
2． 5 蛋白含量的测定 蛋白含量测定使用考马斯亮蓝法。由
A595 nm吸光值作标准曲线。
2． 6 螺旋藻激酶的活力测定 酶活的测定采用纤维蛋白平板法，
依照 Astrup等［6］报道。的纤维蛋白平板法，并加以改进。用微
量加样器注射样品(5 μl)于平板中，于 37℃恒温箱内放置 8 h，测
溶圈的垂直直径。以尿激酶标准品作标准曲线。
3 结果
3． 1 硫酸铵分级盐析 粗酶液体积较大，但其中所含的酶量却相
对较少，所以纯化分为传统的两个部分:粗分离和精分离。在粗
分离阶段，考虑到浓缩蛋白且尽量除去大部分杂质同时保证酶活
的损失较小，所以选择硫酸铵盐析。盐析曲线见图 1。
图 1 螺旋藻激酶盐析曲线
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 6 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 6 期
图 1 可知，随着硫酸铵饱和度的增加，上清液中螺旋藻激酶
量逐渐减少，沉淀中逐渐增加。因此首先采用 45%饱和度硫酸
铵沉淀除去杂蛋白，再用 75%饱和度硫酸铵沉淀收集该酶。
3． 2 凝胶层析 盐析后的样品，经凝胶层析后，洗脱分离出洗脱
峰。如图 2 所示，共有 5 个洗脱峰，以纤维蛋白平板法检测各洗
脱峰活性，其中只有第 2 个洗脱峰有活性，其余洗脱峰均未检测
到酶活，故此洗脱峰为螺旋藻激酶所在部分。
图 2 Sephadex G － 75 凝胶层析的洗脱曲线
3． 3 SDS － PAGE电泳结果分析 将收集到的活性产物进行 SDS
－ PAGE电泳分析，由图 3 可知，经过 Sephadex G － 75 凝胶层析，
杂蛋白基本被除尽，得到单一的螺旋藻激酶蛋白带，表明分离出
的螺旋藻激酶已达到电泳纯。
1．纯化样品 2．未纯化样品 M － Marker
图 3 SDS － PAGE电泳结果
3． 4 螺旋藻激酶的分子量 由图 3 可知，与标准蛋白分子量比
较，所得螺旋藻激酶的分子量为 40 KD。
3． 5 纯化方案的评价 纯化过程中，需对每个步骤进行测定评价，
计算比活(活力单位数 /毫克蛋白)、纯化倍数(每步比活 /粗酶液
比活)和回收率(每步总活力 /粗酶液总活力 ×100%)。见表 1。
表 1 各步纯化效果比较
步骤
活力
/ IU·ml －1
蛋白浓度
/mg·ml －1
体积
/ml
总活力
/ IU
总蛋白
/mg
活力回收率
(%)
蛋白回收率
(%)
比活
/ IU·mg －1
纯化倍数
粗酶液 291． 43 0． 672 100 29143 67． 2 100 100 433． 7 1． 0
45%饱和度上清 129． 25 0． 231 182 23 523． 5 42． 04 80． 7 62． 6 559． 6 1． 3
75%饱和度沉淀 1 960． 39 2． 479 10 19 603． 9 24． 79 67． 3 36． 9 790． 8 1． 8
凝胶层析 153． 96 0． 058 80 12 316． 8 4． 66 42． 3 6． 9 2 643． 1 6． 1
结果表明，螺旋藻样品经过两级硫酸铵盐析和 Sephadex G －
75 凝胶层析后，酶回收率达到 42． 3%，纯化倍数达到 6． 1。纯化
过程简单，减少了活性损失，使得比活较高。纯化过程中应注意
控制温度，缩短操作时间，从而进一步减少活性损失，为大规模工
业化生产提供帮助。
4 讨论
实验所用的原料螺旋藻粉剂中含有大量杂质，制备的螺旋藻
粗酶液是复杂的多相系统，本身所含酶量相对较少，且黏度较大，
为得到纯度较高的螺旋藻激酶需进行一系列的分离纯化。
粗分离使用硫酸铵分级盐析法，通过盐析曲线确定第一级盐
析所需硫酸铵饱和度为 45%，第 2 级需 75%。硫酸铵饱和度低
于 45%时，沉淀中酶活相对含量较小，硫酸铵饱和度高于 75%
时，沉淀中酶活相对含量无明显增加。第 1 级盐析后螺旋藻激酶
比活达到 559． 6 IU /mg，活力回收率 80． 7%，纯化倍数 1． 3;第 2
级盐析后螺旋藻激酶比活达到 790． 8 IU /mg，活力回收率67． 3%，
纯化倍数 1． 8。
细分离采用 Sephadex G － 75 凝胶层析，层析后比活达到
2643． 1 IU /mg，活力回收率 42． 3%，纯化倍数 6． 1。根据厂商提
供的参考参数将体积流速设定为 1 ml /min，加样量为每次 10 ml，
在确定 pH时考虑到蛋白质样品的性质和凝胶所能耐受的 pH范
围两方面的因素，pH控制在 6 ～ 8 之间，选择 PBS磷酸盐缓冲液，
层析的操作全部在专门的冷房中进行，使操作温度控制在凝胶的
最适用范围内。
得到的螺旋藻激酶用 SDS － PAGE 电泳测定为电泳纯，其分
子量为 40KD。经过 SDS － PAGE 检测，得到单一条带，说明所得
的蛋白成分已经比较均一，排除了大部分杂质的干扰，为之后进
行螺旋藻激酶酶学性质研究，得到可信、准确的数据打下了良好
的基础。
参考文献:
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