全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032471206
超临界 CO2 杀灭大肠杆菌过程中菌体蛋白的变化
饶伟丽　张德权　李淑荣　李春红　朱　捷
(中国农业科学院农产品加工研究所 ,农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室 ,北京　100193)
摘 　要 :通过 SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,结合超临界 CO2 对大肠杆菌的杀菌曲线 ,研究超临界压力、温度
和处理时间对大肠杆菌菌体蛋白的影响。结果表明 :超临界 CO2 在杀灭大肠杆菌过程中 ,可显著降低
菌体碱溶性 (pH810)蛋白的溶解性 ,但对菌体总蛋白含量和种类没有影响 ;37 ℃下超临界 CO2 处理大肠
杆菌 30min ,压力为 10MPa 时 ,大肠杆菌存活率为 218 % ,菌体碱溶性蛋白的溶解性显著降低 ,当压力增
加到 50MPa 时 ,大肠杆菌存活率和碱溶性蛋白溶解性变化不明显 ;超临界温度和处理时间对菌体碱溶
性蛋白溶解性的影响与大肠杆菌在超临界 CO2 中的存活趋势基本一致 ,随处理时间的延长和温度的增
加大肠杆菌存活率逐渐降低到 0 ,碱溶性蛋白溶解性逐渐降低 ,直至部分蛋白带消失 ,但菌体总蛋白含
量和种类并没有明显变化 ;升高温度比增加压力更能显著地导致菌体碱溶性蛋白变性 ,溶解性
下降。　　
关键词 :超临界 CO2 ;大肠杆菌 ;杀灭作用 ;碱溶性蛋白 ;总蛋白 ;溶解性
THE PROTEIN CHANGE DURING THE INACTIVATION OF
Escherichia coli BY SUPERCRITICAL CO2
RAO Wei2li 　ZHANG De2quan 　LI Shu2rong 　LI Chun2hong 　ZHU Jie
( Institute of Agro2Food Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences ,
Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Quality Control , Ministry of Agriculture , Beijing 　100193)
Abstract :The influences of supercritical CO2 on the total protein and alkali2soluble protein of E. coli was studied by SDS2
PAGE analysis and the inactivation curve of E. coli by supercritical CO2 1 The results showed that the solubility of E. coli
alkali2soluble protein (pH810) significantly decreased when E. coli was inactivated by supercritical CO2 , but there was no
change of the species and content of total protein of E. coli after supercritical CO2 treatment . The solubility of alkali2soluble
protein significantly decreased and the survival rate of E. coli was only 218 % when the E. coli was treated 30min by
supercritical CO2 at 37 ℃ and 10MPa , but the survival rate of E. coli and the solubility of alkali2soluble protein did not
decreased observably when the pressure increased up to 50MPa. The survival trend of E. coli was same as the change of the
solubility of alkali2soluble protein under the different temperature and treating time of supercritical CO2 . The survival rate of
E. coli and the solubility of alkali2soluble protein dropped off with the increase of treating time and temperature , but there
was no change of the species and content of total protein of E. coli . The increasing temperature could strengthen the
denaturalization and the insolubility of E. coli alkali2soluble protein more obviously than increasing pressure.
Key words :supercritical CO2 ; E. coli ; inactivation ; alkali2soluble protein ; total protein ; solubility
收稿日期 :2008210206 　接受日期 :2009201208
基金项目 :863 计划重点项目 (2007AA100405) ,中国农业科学院院长基金项目
作者简介 :饶伟丽 (19832) ,女 ,河北张家口人 ,在读硕士 ,主要从事食品非热加工技术研究。E2mail :iamraoweili @1261com
通讯作者 :张德权 (19722) ,男 ,河南信阳人 ,研究员 ,主要从事肉品科学与非热加工技术研究。Tel : 010262818740 ; E2mail dqzhang0118 @1261com
174　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :471～476Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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　　加热处理是食品工业传统的杀菌方式 ,但它有不
可避免的缺陷。对于热敏性食品 ,加热可引起感观品
质下降 ,比如汁液流失、加速褐变、质地变软、营养和风
味成分损失等。随着生活水平的提高 ,人们对食品的
营养品质、感观品质、新鲜程度要求越来越高 ,对食品
的货架期要求更长 ,一些食品经过热处理很难达到要
求 ,所以非热力杀菌技术逐渐受到人们的重视。目前 ,
非热力杀菌技术主要有辐照、超高压、高压脉冲电场、
超声波和超临界 CO2 等[1 ,2 ] 。
CO2 用于抑制微生物已有 100 多年的历史 ,常压
的 CO2 就可大大抑制食品中细菌的生长 ,对细菌的迟
滞期、指数生长期和稳定生长期都有影响[3 ] 。但把超
临界 CO2 作为一种非热力杀菌技术用于食品杀菌却
是近年来的事 ,众多学者的研究都证实了其具有良好
的杀菌效果[4～7 ] 。与其他非热力杀菌技术一样 ,超临
界 CO2 非热力杀菌技术具有处理温度底、无残留、无
污染、营养损失少等优点 ,因此 ,自 1987 年 Kamihira 等
人[8 ]首次研究了超临界 CO2 的杀菌效果以来 ,超临界
CO2 作为一种新型的非热力杀菌技术日益受到国内外
学者的广泛关注 ,研究日益增多。目前 ,有关超临界
CO2 杀菌技术的研究主要集中在不同介质的杀菌效果
研究上 ,而有关其杀菌机理的研究报道却较少。有人
认为 ,超临界 CO2 杀菌机理在于卸压时超临界 CO2 急
速膨胀导致的细胞破裂[2 ] ;也有人认为超临界 CO2 虽
能引起细胞变形 ,细胞膜通透性增加 ,但超临界 CO2
引起微生物新陈代谢紊乱才是致死的主要原因[9 ] 。蛋
白质是细胞组分中含量最为丰富、功能最多的高分子
物质 ,是微生物新陈代谢的物质基础。超临界 CO2 对
微生物新陈代谢的影响很大程度上是对蛋白质的影
响 ,因此 ,阐明超临界 CO2 对微生物蛋白的影响规律 ,
对于揭示超临界 CO2 的杀菌机理至关重要。为此 ,本
文以遗传背景清楚、技术操作和培养条件简单的大肠
杆菌为对象 ,对超临界 CO2 处理前后菌体蛋白 SDS2
PAGE图谱的改变进行研究 ,旨在从蛋白质组角度探
明超临界 CO2 对大肠杆菌菌体蛋白的影响规律 ,为探
索超临界 CO2 的杀菌机理提供参考。
1 　材料与方法
111 　材料和仪器
菌种 : Escherichia coli CICC 10003 从中国工业微生
物菌种保藏中心购得。
培养基 :蒸馏水 1000ml、牛肉膏 10g、蛋白胨 10g、
葡萄糖 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、调 pH值 710。
葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、硫脲、尿素、丙烯酰胺
等购于北京化学试剂公司 ,过硫酸铵、溴酚蓝购于国药
集团化学试剂有限公司 , Tris Base、SDS、考马斯亮兰
R250 和甲叉双丙烯酰胺 Fluka 进口分装 ,低分子量蛋
白标准购于北京索莱宝公司 , GLYCINE、DTT、chaps、溶
菌酶 Amresco 进口分装。
超临界 CO2 装置为美国 ISCO 公司产品 ,LDZX2
40B2 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器为上海申安医
疗器械厂产品 ,HH. B11 420 型电热恒温培养箱为天津
市中环实验电炉有限公司产品 ,BG2easy PZPET S1000
移液器为北京百晶生物技术有限公司产品 ,DT2100A
电子分析天平为唐山光学仪器厂产品 ,超声波细胞破
碎仪 J Y922II为宁波新芝生物科技股份有限公司产品 ,
AE28130 型电泳仪为日本 Atto 公司产品。
112 　方法
11211 　E. coli 的培养 　将冻干管中菌体溶解后转入
盛有 5ml 液体培养基的试管中 ,放入保温箱中 37 ℃培
养 2d。用接种环蘸取少许液体接种于斜面培养基 ,培
养 24h ,将长好的 E. coli 置于 4 ℃冰箱中保藏 ,1 个月
移植 1 次。每次试验前挑取菌体 ,接种到 20ml 液体培
养基中 ,37 ℃培养 14h ,吸取 20ml 菌液于 400ml 培养基
中 ,37 ℃培养 515h ,达到对数生长期后期备用。
11212 　超临界 CO2 处理 　取 50ml 对数期后期的菌
液 ,在 4 ℃下 5000rΠmin 离心 10min ,菌体沉淀重悬于生
理盐水中洗 2 遍。菌体悬浮于 Tris2HCl 缓冲液 (pH7)
中 ,进行超临界 CO2 处理 ,处理条件为 : 压力 10～
50MPa ,温度 37 ℃～57 ℃,处理时间 20～120min ,重复 3
次。超临界 CO2 处理结束后 ,立即进行生理活性和
SDS2PAGE电泳分析。
11213 　菌落记数 　采用倾注平板计数法 ,将待测菌液
用振荡器摇匀 ,适当稀释菌液 ,用移液枪吸取稀释液于
无菌培养皿中 ,每个梯度 3 个重复 ,倒入 50 ℃左右的
琼脂培养基 ,凝固后倒置于培养箱中 37 ℃恒温培养
48h ,计数并计算存活率。存活率 ( %) = (处理后大肠
杆菌数Π对照组大肠杆菌数) ×100 %。
11214 　菌体碱溶性蛋白的提取 　菌悬液于 4 ℃下
5000rΠmin 离心 10min ,收集菌体 ,悬浮于 2ml TE缓冲液
(2mmolΠL Tris2HCl、10mmolΠL EDTA、1mgΠml 溶菌酶 ,pH
810)中 ,超声波裂解细胞 ,超声波功率为 80W ,时间
15min。裂解液在 4 ℃下以 14000rΠmin 离心 30min ,上清
即为碱溶性蛋白。
11215 　菌体总蛋白的提取 　菌悬液于 4 ℃下 5000rΠ
min 离心 10min ,收集菌体 ,菌体沉淀悬于裂解液 (7molΠ
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L 尿素、2molΠL 硫尿、2 %chaps、40mmolΠL Tris、40mmolΠL
DTT)中 ,超声波裂解细胞 ,超声波功率为 80W ,时间
15min。裂解液在 4 ℃下以 14000rΠmin 离心 30min ,上清
即为菌体总蛋白。
11216 　聚丙烯酰胺凝胶电泳 　将蛋白样品与等体积
样品缓冲液混合 ,沸水浴 5min ,吸取 10μl 进行电泳。
电泳条件 :5 %浓缩胶 ,80V 电压 ;15 %分离胶 ,120V 电
压。电泳完毕 ,将凝胶置于考马斯亮蓝染液中染色 ,脱
色至背景干净为止 ,观察结果。
2 　结果与分析
211 　超临界压力对 E. coli 菌体蛋白的影响
不同压力的超临界 CO2 处理 E. coli 30min ,存活
曲线见图 1 ,菌体碱溶性蛋白和总蛋白变化见图 2。从
图 1 和图 2 可以看出 ,超临界 CO2 处理后 , E. coli 的
存活率和碱溶性蛋白含量显著下降 (图 22A) ,且两者
变化趋势基本一致 ,但不同压力的超临界 CO2 处理后
E. coli 蛋白的种类、含量并没有发生明显变化 (图 22
B) 。37 ℃下超临界压力达到 10MPa 时 , E. coli 碱溶性
蛋白溶解性显著降低 ,此时 E. coli 存活率为 218 % ;
但 10MPa 以后 ,随压力增加 , E. coli 碱溶性蛋白的溶
解性降低并不明显 ,存活率变化也不大 ,50MPa 时 ,存
活率为 117 % ,与 10MPa 时的 218 %差异不显著。表明
超临界压力对 E. coli 碱溶性蛋白溶解性的影响 ,与其
对 E. coli 杀菌效果的影响规律基本一致 ,说明超临界
CO2 杀菌的原因之一可能在于超临界 CO2 降低了 E.
coli 菌体蛋白的溶解性 ,使碱溶性蛋白变成不溶性蛋
白 ,导致菌体死亡。
图 1 　不同压力下超临界 CO2 (37 ℃,30min)
对 E. coli 的杀灭作用
Fig. 1 　The inactivation of E. coli by supercritical
CO2 at different pressure
　　从图 2 亦可看出 ,超临界 CO2 处理后 , E. coli 的
所有碱溶性蛋白溶解性均下降 ,但下降幅度并不相同 ,
大分子蛋白比小分子蛋白更容易受超临界 CO2 的影
响 ,分子量大于 3110 kDa 的菌体蛋白经超临界 CO2 处
理后明显减少 ,而小于 3110kDa 的菌体蛋白溶解性变
化较小 ,如 9812kDa 的蛋白条带在超临界 CO2 处理后
消失 ,1810kDa 的蛋白条带变化较小 (图 22A) ;同时还
发现 ,尽管超临界 CO2 可显著降低 E. coli 碱溶性蛋白
的溶解性 ,但对 E. coli 菌体蛋白的种类、含量没有影
响 (图 22B) ,表明超临界 CO2 既不会引起蛋白的降解 ,
也不会诱导某种蛋白的合成 ,超临界 CO2 杀菌的原因
可能仅仅在于引起了蛋白溶解性下降 ,而导致菌体死
亡。有研究表明 ,超临界 CO2 处理后 ,由于 pH 的改
变 ,可导致蛋白质中精氨酸残基和 CO2 反应 ,形成蛋
白质重碳酸盐复合物而引起蛋白质溶解性下降[10 ] ,但
菌体蛋白多达千万种 ,是每一种蛋白质均形成了蛋白
　　
图 2 　不同压力下超临界 CO2 (37 ℃,30min)对 E. coli 菌体蛋白的影响
Fig. 2 　The effect of supercritical CO2 at different pressure (37 ℃,30min)on the protein of E. coli
A :碱溶性蛋白 ;B :总蛋白 ;M:Marker ;0 :对照 ;1 :10MPa ;2 :20MPa ;3 :30MPa ;4 :40MPa ;5 :50MPa
A : alkali2soluble protein ; B : total protein ; M:Marker ;0 :control ;1 :10MPa ;2 :20MPa ;3 :30MPa ;4 :40MPa ;5 :50MPa
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质重碳酸盐复合物 ,还是其他原因导致蛋白质溶解性
下降 ,尚需进一步研究。廖小军等[11 ]认为 ,超临界 CO2
处理可以改变蛋白的二级结构而使其溶解性下降 ,他
们在利用超临界 CO2 处理辣根过氧化物酶时发现 ,α2
螺旋在二级结构中的比重随超临界 CO2 压力的增加
而降低 ,酶活变化趋势与α2螺旋结构变化的趋势基本
一致 ,但超临界 CO2 又是如何影响蛋白质二级结构的
变化 ,还有待进一步研究。
212 　超临界温度对 E. coli 菌体蛋白的影响
不同温度的超临界 CO2 处理 E. coli 20min ,存活
曲线见图 32A ,菌体碱溶性蛋白和总蛋白变化见图 4。
从图 3 和图 4 可以看出 ,随超临界温度的增加 , E. coli
菌体碱溶性蛋白逐渐减少 ,62 ℃时碱溶性蛋白带几乎
全部消失 (图 42A) ,与超临界温度对 E. coli 存活的影
响趋势一致 (图 32A) ,但不同温度的超临界 CO2 对菌
体蛋白种类、含量的影响与超临界压力的影响基本一
致 ,即菌体总蛋白含量、种类不随超临界条件的改变而
发生变化 (图 42B) 。37 ℃时 20MPa 的超临界 CO2 处理
E. coli 20min , E. coli 存活率为 1112 % (图 32A) ,菌体
碱溶性蛋白溶解性较对照显著降低 (图 42A) ;随温度
的增加 , E. coli 存活率和菌体碱溶性蛋白溶解性逐渐
降低 ,52 ℃时 , E. coli 的存活率降低到 0102 % ,此时
E. coli 碱溶性蛋白带大部分消失 ;57 ℃时 , E. coli 全
部被杀死 ,此时菌体碱溶性蛋白带进一步减少 ,62 ℃时
几乎全部消失 (图 42A) 。
从图 4 亦可看出 ,在超临界 CO2 中改变温度 (图 42
图 3 　不同温度下超临界 CO2 (20MPa ,20min)和热处理对 E. coli 的杀灭作用
Fig. 3 　The inactivation of E. coli by supercritical CO2 (20MPa ,20min) and heat at different temperature
A :超临界 CO2 处理 ;B :热处理 A : supercritical CO2 treatment ;B : heat treatment
图 4 　不同温度下超临界 CO2 (20MPa ,20min)对 E. coli 菌体蛋白的影响
Fig. 4 　The effect of supercritical CO2 (20 MPa ,20 min) at different temperature on the protein of E. coli
A :碱溶性蛋白 ;B :总蛋白 ;M:Marker ;0 :对照 ;1 :37 ℃;2 :42 ℃;3 :47 ℃;4 :52 ℃;5 :57 ℃;6 :62 ℃;7 :TE缓冲液
A :alkali2soluble protein ;B :total protein ;M:Marker ;0 :control ;1 :37 ℃;2 :42 ℃;3 :47 ℃;4 :52 ℃;5 :57 ℃;6 :62 ℃;7 :TE Buffer
A) 比压力 (图 22A) 更能显著地影响 E. coli 菌体碱溶
性蛋白的溶解性 ,20 MPa 下随超临界温度的增加 , E.
coli 碱溶性蛋白溶解性逐渐降低 ,直至 62 ℃碱溶性蛋
白带几乎全部消失 (图 42A) ;而 37 ℃下超临界压力即
使增加到 50MPa , E. coli 碱溶性蛋白带也未大量减少
(图 22A) 。此外 ,从图 42A 还可以看出 ,大分子蛋白较
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小分子蛋白更易受超临界温度的影响 ,分子量大于
2011 kDa 的菌体蛋白经超临界 CO2 处理后明显减少 ,
而小于 2011kDa 的菌体蛋白溶解性变化较小 ,直至
62 ℃时 1810kDa 的蛋白带仍很清晰 (图 42A) 。说明超
临界 CO2 处理虽能使所有的碱溶性蛋白均发生变性
而溶解性下降 ,但对不同的碱溶性蛋白其影响程度不
同。
本试验发现 ,在同样的杀菌效果下 ,超临界 CO2
杀菌需要的温度较热杀菌低 ,52 ℃、20 MPa 的超临界
CO2 处理 E. coli 20min 后 , E. coli 的存活率为 0102 %
(图 32A) ,与 57 ℃热处理 30 min 效果基本一致 (图 32
B) 。现有研究证明蛋白、核酸变性是热杀菌的主要机
理[12 ] ,但 52 ℃、20MPa 超临界 CO2 处理 20min 后 ,大肠
杆菌的碱溶性蛋白带并未完全消失 (图 42A) ,说明蛋
白变性可能并不是超临界 CO2 导致菌体死亡的唯一
原因 ,与热杀菌机理有所不同。
213 　超临界处理时间对 E. coli 菌体蛋白的影响
不同时间的超临界 CO2 处理 E. coli ,存活曲线见
图 5 ,菌体碱溶性蛋白和总蛋白变化见图 6。从图 5、图
6 可以看出 ,随超临界 CO2 处理时间的延长 , E. coli 碱
溶性蛋白溶解性逐渐降低 ,存活率逐渐减小 ,二者变化
趋势基本一致。37 ℃、20MPa 的超临界 CO2 处理
　　　　
E. coli 20min 时 ,与对照相比 ,部分 E. coli 碱溶性蛋
白条带明显变弱 ,其存活率也显著下降 ,仅有 1112 % ;
80min 时 , E. coli 碱溶性蛋白含量进一步减少 ,部分碱
溶性蛋白完全变性 ,如 98122kDa 的碱溶性蛋白在超临
界 CO2 处理 80min 后消失 ,此时 E. coli 完全死亡。由
此可见 ,延长超临界处理时间可加剧菌体碱溶性蛋白
变性 ,成为菌体细胞死亡的重要原因之一。从图 62B
还可看出 , E. coli 菌体总蛋白含量和种类并不随超临
界处理时间的延长而有所变化 ,结合图 62A 可以认为 ,
延长超临界处理时间仅能加速菌体碱溶性蛋白的变
性 ,而不会引起菌体蛋白的降解。
图 5 　不同时间的超临界 CO2 处理 (37 ℃,20MPa)
对 E. coli 的杀灭作用
Fig. 5 　The inactivation of E. coli by supercritical
CO2 (37 ℃,20MPa) at different treating time
图 6 　不同时间的超临界 CO2 (37 ℃,20 MPa)处理对 E. coli 菌体蛋白的影响
Fig. 6 　The effect of supercritical CO2 (37 ℃,20 MPa) at different treating time on the protein of E. coli
A :碱溶性蛋白 ;B :总蛋白 ;M:Marker ;0 :对照 ;1 :20min ,2 :40min ,3 :60min ,4 :80min ,5 :100min ,6 :120min
A :alkali2soluble protein ;B :total protein ;M:Marker ;0 :control ;1 :20min ,2 :40min ,3 :60min ,4 :80min ,5 :100min ,6 :120min
3 　结论
311 　超临界 CO2 可使 E. coli 菌体碱溶性蛋白变性 , 引起其溶解性下降而导致 E. coli 死亡 ,这种作用随超临界 CO2 处理时间的延长、温度的增加而加剧 ,增加温度比增加压力更能显著地导致 E. coli 碱溶蛋白变性 ,溶解性下降。但超临界 CO2 杀菌后 , E. coli 碱溶
574　3 期 超临界 CO2 杀灭大肠杆菌过程中菌体蛋白的变化
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性蛋白并未完全变性 ,说明蛋白变性可能并不是超临
界 CO2 导致菌体死亡的唯一原因 ,与热杀菌机理有所
不同。
312 　超临界 CO2 处理可使所有的 E. coli 碱溶性蛋白
变性而溶解性下降 ,但蛋白的溶解性下降幅度并不相
同 ,大分子蛋白比小分子蛋白更容易受到超临界 CO2
的影响。
313 　超临界 CO2 处理对 E. coli 菌体总蛋白含量和种
类没有影响 ,超临界 CO2 处理后 , E. coli 菌体蛋白含
量和种类既没有增加也没有减少 ,说明超临界 CO2 杀
菌的机理并不在于其破坏菌体蛋白的一级结构 ,导致
蛋白降解或新蛋白质合成 ,可能在于超临界 CO2 引起
了菌体蛋白二、三或四级结构的变化而发生变性 ,溶解
性下降 ,进而影响了 E. coli 的正常新陈代谢 ,导致死
亡。
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