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此文于 1997 年 3 月 11 日收到。
国家自然科学基金资助项目。
小麦根质膜微囊的制备及水分胁迫
对45Ca2 + 转运活性的影响
吕金印　高俊凤 3 　曹翠玲 3
(西北农业大学同位素室　3 基础科学系　杨陵　712100)
利用蔗糖密度梯度离心法制备小麦根质膜微囊 ,研究结果表明 :郑引 1 号小麦根
质膜 H +2A TPase 潜在活性为 24 % ,内翻外型质膜囊泡占 76 %。 - 110MPa PEG胁
迫处理 24h ,两种定向的小麦根质膜 Ca2 +2A TPase 活性均增加 ,正常水分条件下和
PEG胁迫处理后 ,EGTA 对该酶活性抑制率分别为 62 %和 53 % ,内翻外型质膜微囊
对放射性核素45 Ca2 + 的转运量分别为 22109nmol/ mg pro 和 4117nmol/ mg pro , PEG
胁迫处理后 ,小麦根质膜微囊45Ca2 + 转运量下降了 81 %。
关键词 :小麦 　水分胁迫 　质膜 　钙转运
前 言
质膜 ( PM)是细胞中物质交流的一个通透性屏障 ,也是细胞与外界环境进行信息交流的媒
介[1 ,2 ] 。自 Hodges 等首先利用蔗糖密度梯度离心法纯化燕麦根细胞质膜后 ,对高等植物细胞
质膜的研究受到人们的重视[3 ,4 ] 。由于对质膜结构、功能与活性研究的侧重点不同 ,而采用的
质膜微囊定向不同 ,所用的分离制备方法也不尽相同。内翻外型质膜微囊 ( PM2IOV) 可用于
物质转运研究 ,它避免了细胞内其它物质与代谢的相互影响 ,简化了研究对象[5 ,6 ] 。
钙不仅是植物矿质营养的大量元素 ,而且是植物生长发育和代谢的调控者[7～9 ] 。若细胞
质中钙浓度过高 ,将会同磷酸反应生成沉淀而影响以磷为基础的能量代谢[9 ] 。作为主动 Ca2 +
转运系统之一的 PMCa2 +2A TPase (钙泵) ,在主动排除细胞质中过量钙过程中起着重要的作
用[6 ,10 ] 。前人在这方面做了一定工作[6 ,11 ,12 ] ,但关于逆境条件下质膜钙转运的报道甚少。本
研究采用蔗糖密度梯度离心法制备质膜微囊 ,结合放射性核素示踪技术 ,对小麦根 PMH+2
A TPase 潜在活性和水分胁迫下 PMCa2 +2A TPase 与跨膜 Ca2 + 转运活性的变化进行了探讨。
材 料 与 方 法
材料与处理　以对水分敏感的冬小麦 ( T riticum aestiv um L . ) 郑引 1 号为材料 ,种子经
012 %HgCl2 消毒 10min 后 ,自来水冲洗数次 ,培养 16～20h ,露白后播于尼龙网上 ,在 25 ±1 ℃
下培养 5d ,用 - 015MPa (只测 Ca2 +2A TPase 活性) 和 - 110MPa PEG液根际处理 24h ,剪取根
尖端 1cm 部位提取质膜。
质膜提取 　取小麦根 ,按 1∶215 ( W/ V) 加入 75ml 匀浆液 [含 0125mmol/ L Suc ,3mmol/ L
87　 核 农 学 报　1998 ,12 (2) :78～82Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
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ED TA , 50mmol/ L Tris2HCl ( p H718 ) , 015 % PVP ( W/ V ) , 013mmol/ L PMSF , 2mmol/ L
Na2MoO4 ,1mmol/ L D TT , 011 %BSA ( W/ V ) , 5mmol/ L Vc ] 匀浆 5min ,用 4 层纱布过滤。
12000g离心 20min , 上清液再在 100000g 离心 1h , 沉淀用 110ml 悬浮液 ( SM I) (内含
0125mmol/ L Suc in 5mmol/ L K2Pi buffer)悬浮 ,即为粗膜制剂 ,以上操作在 4 ℃下进行。
质膜微囊的制备　11 两相法 :同吕金印、高俊凤前文[13 ] 。21 蔗糖密度梯度离心法 :参照
张　等、郝鲁宁等、Kasamo 的方法[4 ,6 ,14 ] ,并略加改进。将粗膜制剂铺在不连续蔗糖密度液面
上 ,蔗糖浓度为 19 %～29 %～34 %～42 %(w/ w) ,100000g 离心 2h ,取 34 %～42 %界面的膜制
剂 ,以不含 Suc 的悬浮液 ( SM Ⅱ) ( 120mmol/ L KCl , 215mmol/ L Tris2MES ( p H715 ) ,
012mmol/ L D TT)稀释后 ,100000g 离心 1h ,沉淀用少量等体积的 SM Ⅰ和 SM Ⅲ[250mmol/ L
山梨醇 ,215mmol/ L Tris2MES(p H715) ,012mmol/ L D TT]混合液处理 ,再用 SM Ⅲ稀释 ,得到
密闭质膜微囊 ,立即用于45Ca2 + 转运测定或贮存在液氮中。
质膜 Ca2 +2ATPase 活性测定 　参照李杨瑞、Klotz 等的方法[15 ,16 ] ,并略加改进。015ml 反
应介质含 (mmol/ L) [ Tris2MES 200 (p H715) ,NaCl 50 ,ED TA2Na2 01005 ,D TT 10 ,CaCl2 4 ,A TP
5 , 0. 01 % Triton X2100 (w/ v) ] ,加入适量 PM (含 10～30μg 膜蛋白制剂) 。36 ℃反应 20min ,
加 10 %TCA 终止反应 ,测定释放无机磷含量 ,反应介质中加与不加 Ca2 + 引起的酶活之差即为
Ca2 +2A TPase 活性。
质膜 45 Ca2 + 转运测定 　参照郝鲁宁、Giannini 等的方法 [6 ,17 ] 。015ml 反应介质含
(mmol/ L) [山梨醇 250 , Tris2MES 30 (p H715) , KNO3 50 ,NaN3 015 ,MgSO4 3 , ED TA 013 ,A TP
5 ,CaCl2为 100μmol/ L (含 210μCi 45CaCl2) ]。加入适量 IOV 膜制剂 (含 20～40μg 膜蛋白) ,启
动反应 ,36 ℃反应 20min。迅速加入 110ml 终止液 (mmol/ L) [ Suc 250 , Tris2MES 30 (p H715) ,
MgSO4 5 ,EGTA 5 ]终止反应 ,准确吸取反应液 110ml ,加至 0122μm 孔径的微孔滤膜上真空超
滤。用 2ml 终止液清洗滤膜 ,自然风干。滤膜浸入 6ml 闪烁液中 ,在Beckman L S29800 液体闪
烁计数器上测定45Ca2 + 放射性。减去不加 A TP 时滤膜对45 Ca2 + 的被动吸附量 ,即为 PM2IOV
微囊对45Ca2 + 的主动转运量。
结 果 与 分 析
(一) 蔗糖梯度离心法纯化 PM2IOV H+2ATPase 潜在活性
镶嵌于质膜中的 A TPase 与底物 A TP 的结合位点位于胞质一侧 ,利用蔗糖梯度离心法可
得到内翻外型质膜微囊 ,此微囊可直接用于酶活性测定。对于原位膜 ( ROV) 需加非离子型去
垢剂 Triton X2100 ,增加底物 A TP 的通透性。向 PM2IOV 制剂中加入 Triton X2100 后 ,所增
加的酶活性是由 ROV 囊泡产生的。将加减 Triton 之后酶活之差值与存在 Triton 时 A TPase
活性的百分比称为潜在酶活。它可以代表质膜制剂中 ROV 所占比例[17 ] 。由表 1 可看出 ,若
将质膜制剂近似看作由 ROV 和 IOV 组成 (100 %) 。郑引 1 号小麦根 H+2A TPase 潜在活性为
24 % ,内翻外型囊泡占 76 %。表明蔗糖梯度离心法制备的质膜制剂富含内翻外型囊泡。
(二) 水分胁迫下原位质膜 Ca2 +2ATPase 活性的变化
由图 1 可看出 , - 015MPa PEG处理时 ,PM2ROV Ca2 +2A TPase 活性变化不大 ,略有下降 ,
而 - 110MPa 处理时 ,该酶活性增加 ,比对照约净增 40 %。
97　2 期 小麦根质膜微囊的制备及水分胁迫对45Ca2 +转运活性的影响
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表 1 　蔗糖梯度离心法纯化质膜 H+ 2ATPase 潜在活性
Table 1 　Latent activity of PMH +2A TPase purified with sucrose gradient centrifugation
品　种
Cultivar
比活性 Specific activity (μmol Pi/ mg pro. min)
- Triton + Triton
潜在活性
Latent activity ( %)
郑引 1 号
Zhengyin No. 1
01834 11091 24
图 1 　水分胁迫下 PM2ROV Ca2 + 2A TP 酶活性的变化
Fig. 1 　The changes of PM2ROV Ca2 + 2A TPase activity under water stress
(三) 水分胁迫对 PMCa2 +2ATPase 与45Ca2 +转运活性的影响
表 2 为 - 110MPa 胁迫处理下 ,内翻外型质膜 Ca2 +2A TPase 活性、EGTA 抑制率及 20min
内对45 Ca2 + 的转运量。表 2 结果显示 : - 110MPa PEG 胁迫后 , PMCa2 +2A TPase 活性增加 ,
EGTA 对 Ca2 +2A TPase 活性有一定的抑制作用 ,分别抑制了 62 %和 53 % ,这与利用原位膜所
测的结果一致。对转运45Ca2 + 的质膜微囊经微孔滤膜超滤 ,对所测45 Ca2 + 放射性值进行换算 ,
结果表明 :水分胁迫下 ,不抗旱的郑引 1 号小麦根质膜具有微弱的45 Ca2 + 转运活性 ,钙转运量
比对照下降了 81 % ,水分胁迫对其影响较大。在正常水分条件下 ,钙转运量与 Gross 等报道玉
米中的转运量相当[11 ] 。
表 2 　水分胁迫对小麦根质膜 Ca2 + 2ATP酶活性与45Ca2 + 转运量的影响
　　Table 2 　Effects of water st ress on PMCa2 +2A TPase activity and 45Ca2 +
t ransporting amount in wheat roots
处　理
Treatment
比活性 Specific activity (μmol Pi/ mg pro·min)
- Triton + Triton + EGTATriton
EGTA 抑制率
EGTA inhibition
rate ( %)
45Ca2 +转运量
45Ca2 + transporting amounts
(nmol·mg - 1pro)
对　照
Control 01898 11327 01501 62 　　　　 22109 (100)
- 110MPa 11667 11840 01866 53 　　　　 4117 (19)
08 核　农　学　报 12 卷
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讨 论
研究细胞膜的结构与功能 ,获得高纯度的质膜微囊制剂是至关重要的。与相分配法不同
的是 ,密度梯度离心法纯化的质膜制剂中内翻外型 ( IOV) 质膜微囊占大多数[3 ,5 ] ,本研究中利
用蔗糖梯度离心法制备小麦根质膜内翻外型微囊占 76 %(表 1) 。
存在于质膜和内质网膜上的 Ca2 + - A TPase ,在 Ca2 + 的主动转运过程中起重要作用[12 ] 。
Ca2 + - A TPase 是驱动 Ca2 + 跨膜转运的动力[10 ] 。作为信使和具有调节作用的 Ca2 + ,只占细胞
中总钙量的很少一部分 ,大量的钙以某种结合方式存在于储钙体中 (胞壁、液泡、内质网等) 。
许多研究表明 ,在细胞膜内外两侧存在相差几个数量级的 Ca2 + 浓度梯度。不断维持钙稳态是
Ca2 +发挥信使作用的前提 ,胞液中持续的高浓度 Ca2 + 对细胞有害 ,并导致细胞正常代谢的紊
乱。在本研究中 ,无论是采用制备的 PM2ROV 或 IOV , - 110MPa PEG胁迫下 ,小麦 PMCa2 +
- A TPase 活性均升高 ,并且增加幅度相近 (40 %左右) (图 1 ,表 2) 。PEG胁迫后 , IOV 微囊对
45Ca + 转运量下降 ( - 81 %) ,可能是水分胁迫下 PMCa2 + - A TPase 对底物 A TP 的水解与 Ca2 +
转运解偶联 ,质膜泵钙能力下降。目前对干旱条件下质膜的钙转运报道较少 ,深入研究干旱逆
境对细胞膜伤害、以及与之相关的钙信使系统调控机理 ,无疑对于植物抗性生理机制的研究具
有重要意义。
参 考 文 献
1 　汤章城 1 植物磷脂及其作用 1 植物生理学通讯 ,1981 ,3 :8～14
2 　王洪春 1 植物抗性生理 1 植物生理学通讯 ,1981 ,6 :72～81
3 　Hodges TK ,Leonard RT ,Brackre CE et al. Purification of an ion2stimulated ATPase from plant root :association with plasma
membrane. Proc Natl Acad Sci USA ,1972 ,69 :3307
4 　张　　 ,冯秀香 ,倪晋山 1 不连续蔗糖梯度离心和两相分配法纯化的小麦根细胞质膜的特性 1 科学通报 ,1988 ,14 :1101
～1104
5 　王建华 ,陈　珈 ,吴显荣 1 玉米细胞两种质膜囊泡的制备和鉴别 1 植物生理学通讯 ,1994 ,30 (5) :443～445
6 　郝鲁宁 ,余淑文 1 大麦根质膜微囊的制备及其 H+ 、Ca2 +转运活性 1 植物生理学报 ,1992 ,18 (4) :383～392
7 　薛　刚 ,高俊凤 ,刘凤霞 1 水分胁迫下钙螯合剂与 CPZ抑制剂对棉花根和下胚轴两种 ATPase 的效应 1 植物生理学通
讯 ,1994 ,30 (6) :417～420
8 　焦进安 ,施教耐 1Ca2 +对植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的抑制作用 1 植物生理通讯 ,1987 ,4 :42～45
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10 　郝鲁宁 ,余淑文 1 大麦根细胞质膜 Ca2 +2ATPase 和 Ca2 +转运系统的特性 1 植物生理学报 ,1993 ,19 (2) :172～180
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1236
12 　Dupont FM ,Bush DS , Windle JJ et al. Calcium and proton transport in membrane vesicles from barley roots. Plant Physiol ,
1990 ,94 :179～188
13 　吕金印 ,高俊凤 1 水分胁迫对小麦根质膜透性与质膜组分的影响 1 干旱地区农业研究 ,1996 ,14 (1) :96～100
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15 　李杨瑞 1 甘蔗叶片细胞器的 Mg2 +2ATP 酶和 Ca2 +2ATP 酶活性 1 植物生理通讯 ,1987 ,6 :20～21
16 　Klotz M G ,Berczi A , Erdei L et al. Picomolar concentrations of tentoxin effect Mg2 + and Ca2 +2ATPase activities of plasma
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18　2 期 小麦根质膜微囊的制备及水分胁迫对45Ca2 +转运活性的影响
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PREPARATION OF WHEAT ROOT PLASMA MEMBRANE VESICL ES AND EFFECT
OF WATER STRESS ON 45Ca2 + TRANSPORT ACTIVITY
LüJ inyin1 　　Gao J unfeng2 　　Cao cuiling2
( Isotope L aboratory1 , Basic Science Depart ment 2 , Northwestern A gricult ural U niversity , Yangli ng 712100)
ABSTRACT
The wheat roots plasma membrane( PM) vesicles were obtained by sucrose gradient cen2
trif ugation. The experiment results shows that the wheat roots of Zhengyin No. 1 PM H+2AT2
Pase lantent activity was 24 %,and PM inside2out vesicle( IOV) accounts for 76 %. With - 110
MPa stress of 24h , PM Ca2 +2ATPase activity of both orientation wheat roots were increased. Un2
der normal water condition and PEG stress ,62 %and 53 % of the enzyme activity was inhibited
respectively by EGTA , radioactive calcium245 transport amount was 22109 nmol/ mg pro and
4117 nmol/ mg pro. respectively with PM2IOV. PEG stress results in a decrease of 45Ca2 + trans2
port amount of wheat roots PM2IOV by 81 %.
Key words :Wheat ,water st ress ,plasma membrane ,calcium transport
28 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1998 ,12 (2) :78～82