全 文 ：此文于 1995 年 11 月 12 日收到。
苹果叶片离体培养中秋水仙素
加倍效应的研究
王长泉　李雅志　崔德才　束怀瑞
(山东农业大学　泰安　271018)
用不同浓度的秋水仙素与 2 %二甲基亚砜的复合溶液处理苹果栽培品种嗄拉和
千秋的试管苗离体叶片。结果表明 , 以 0. 5 %秋水仙素溶液处理 4 天的效果最佳 ,诱
变频率达 5611 %。诱变后获得的四倍体植株在形态学和细胞学上均发生了明显变
异 ,与对照相比 ,变异株茎矮、粗壮、节间短 ,叶色浓厚 ,单位面积气孔数目减少 ,气孔
体积增大 , 染色体数目加倍 ,2n = 4x = 68 (对照为 2n = 2x = 34) ,核仁数目增加。梢
端组织学切片证实 ,获得的同质四倍体频率为 86 %。
关键词 : 　苹果 　叶片 　多倍体 　秋水仙素
前 　　言
苹果的多倍体在自然界中早已存在 , 但自然突变产生四倍体的频率很低 ,而且变异株常
以嵌合体的形式存在 ,在繁殖过程中不稳定 ,很难进一步利用[6 ] 。自从 1937 年 Dsstin 等报道
秋水仙素能够诱导植物产生多倍体以来 ,果树育种工作者相继开展了果树秋水仙素诱变研
究[2 ,5 ,7 - 9 ] 。用秋水仙素诱导获得的苹果同质四倍体有非常重要的意义 :11 作为育种亲本与二
倍体亲本杂交 ,提高三倍体的频率 ;21 用其配子和二倍体的配子进行细胞融合 ,直接得到三倍
体 ;31 可能从中选出优良的四倍体植株直接应用于生产。国内外有关苹果多倍体研究的报道
不多 ,石荫坪用不同浓度的秋水仙素处理苹果的杂种胚 ,通过离体培养抑制胚芽成梢 ,促使不
定芽的分化 ,获得同质四倍体的频率为 88. 9 %[2 ] , 为果树多倍体育种提供了有益借鉴。为了
克服杂种胚本身变异较大的缺点 ,近年来 ,我们致力于秋水仙素处理苹果离体营养器官 ,获得
了单细胞或少数细胞起源的不定芽 ,既保持了原品种的优良性状 ,又可获得高频同质四倍体 ,
并且对变异株进行了形态学和细胞学的初步鉴定。
材 料 与 方 法
试材　苹果栽培品种嗄啦和千秋的试管苗 ,由本校原子能利用教研室提供。
将试管苗叶片接种于 MS 附加 BA 210ppm、NAA 0. 2ppm、3 %蔗糖 ,p H5. 8 的琼脂固体培
养基上。暗培养 1 个月后转入光培养 , 光照时间 16h/ d , 光强 1500lx ,温度 25 ℃±2 ℃[3 ] 。
秋水仙素处理 　用抽滤灭菌后的 0. 1 %、0. 5 %和 1 %秋水仙素溶液 (附加 2 %二甲基亚
砜) , 在无菌条件下浸泡嗄啦和千秋的离体叶片 ,处理时间为 2、4、6d , 对照用无菌水浸泡。处
12　核 农 学 报　1997 ,11 (1) :21～25Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
理后用无菌水反复冲洗 ,再将叶片接种于培养基上诱导不定芽。培养基和培养条件同上。
形态学鉴定　接种后 , 每天记录叶片受害及恢复情况。根据茎粗、节间短、叶色浓厚等形
态特征 , 选择变异株 ,多次切割 , 继代培养。所用培养基和培养条件同上。
细胞学鉴定　11 染色体数目 :上午 9 时 ,取试管苗幼叶、茎尖 ,用“去壁低渗法”制片观察
染色体数目[4 ] , 每个样品观察 20 个以上的中期细胞。Olympus 显微镜观察、拍照 ;21 核仁数
目 :细胞分裂间期取试管苗的幼叶、茎尖 ,用“去壁低渗法”制片[4 ] , 显微镜下统计每个细胞核
仁数目 ;31 同质四倍体 : 经染色体数目鉴定为四倍体的植株及对照 ,分别进行梢端组织学切
片 ,观察梢端 3 个组织发生层 (L1 、L2 、L3) 细胞的大小 ,筛选出同质四倍体 ;41 气孔及叶背茸
毛 :取试管苗的伸展叶 ,无色指甲油膜印叶背面的气孔 , 显微镜观察 ,显微测量尺测量计数 ,并
作统计分析 ,与对照比较 ;扫描电镜观察变异株和对照的叶背面气孔及茸毛 ,并拍照。
结 果 与 分 析
(一)苹果离体叶片不定芽的诱导
嗄啦和千秋试管苗的离体叶片接种到培养基上暗培养 1 个月后 ,叶片表面、叶柄切口处产
生乳白色的质地松软的愈伤组织或直接产生不定芽 ,转入光培养 ,陆续有不定芽分化或长大成
苗 , 不定芽分化率达 83 %(表 1) 。此程序为秋水仙素诱导多倍体植株提供了经验。
表 1 　苹果离体叶片不定芽的诱导
Table 1 　Adventitious buds induction from leaves i n vit ro of apple t ree
试验材料
Materials
　
接种叶数
No. of leaves
treated
分化叶数
No. of differential
leaves
分化百分数
Differentiation
rate
( %)
嗄啦 Gala 60 50 83
千秋 Senshu 60 48 80
(二) 秋水仙素的加倍效果
多次试验表明 ,秋水仙素对离体叶片的诱变效果 ,因其浓度和处理时间的不同而异。从表
2 可看出 :11 秋水仙素浓度在 011 %～1 %均有加倍效果 , 死叶率则随处理时间的延长而增加。
21 在一定范围内 ,变异率随秋水仙素浓度的增加和处理时间的延长而增加 , 超过一定范围 ,
变异率与时间、浓度呈负相关。这是由于秋水仙素毒害作用加重 ,死叶片数增加、不定芽分化
率降低所致。31 本实验最适秋水仙素浓度为 0. 5 % , 最佳处理时间为 4d。
(三) 细胞学鉴定
11 染色体数目 :细胞学观察表明 ,嗄啦、千秋的染色体数目为 2n = 2x = 34 , 诱变后四倍体
植株的染色体数目为 2n = 4x = 68(图版 Ⅰ21、2) 。通过对多个变异株染色体数目的观察 ,发现
除四倍体细胞外 ,还存在非整倍体细胞 ,而且变异株间也略有差异。
22 核　农　学　报 11 卷
表 2 　秋水仙素对离体苹果叶片的诱变效应
Table 2 　The inducing mutation on leaves i n vit ro of apple plants with colchicine
浓度
Concentration
of colchicine
处理时间
Time
treated (h)
处理叶数
No. of
treated leaves
死叶数
No. of
dead leaves
死叶率
Percent of
dead leaves
变异叶数
No. of leaves
with mutation
变异率
Mutation
rate ( %)
2 30 0 0 0 0
0 4 30 0 0 0 0
6 30 0 0 0 0
2 41 2 4. 9 14 33. 0
0. 1 4 98 17 16. 80 38 38. 6
6 50 21 42. 0 12 24. 0
2 66 4 6. 06 23 34. 85
0. 5 4 139 31 22. 30 78 56. 1
6 106 34 28. 33 31 25. 83
2 50 5 10. 00 10 20. 0
1. 0 4 90 25 27. 78 34 37. 78
6 73 36 49. 51 21 28. 78
　　　注 : 表中统计数据为嗄啦和千秋的平均值。Note :Numbers in table 2 were average of Gala and Senshu.
21 核仁数目 :从表 3 看出 ,变异株与对照相比 ,核仁数目明显增多 ,二倍体植株 (对照) 细
胞核仁数目一般为 1～3 个 ,而四倍体变异株细胞核仁数目最多达 7 个 ,细胞体积也明显增大
(图版 Ⅰ23、4) 。
表 3 　变异株核仁数目
Table 3 　The nucleolus number in variant apple plants
试　材
Materials
观察细胞数目
Observed cell number
每个细胞核仁数目 Nucleolus number/ cell
1 2 3 4 5 6 7
嗄啦 Gala 200 121 70 9
嗄啦变异株 Variant of Gala 200 22 64 56 30 28
千秋 Senshu 200 108 92
千秋变异株 Variant of Senshu 200 18 52 73 40 17
31 同质四倍体 :四倍体植株梢端组织学切片证明 ,变异株梢端 3 个组织发生层的细胞大
小大多均匀一致 , 为同质四倍体 ,频率为 86 % , 同时也存在少量嵌合体。
41 气孔及叶背面茸毛 : 光镜下观察 , 四倍体植株与对照相比 ,单位面积上气孔数目减少 ,
气孔体积明显增大 (表 4) 。扫锚电镜下观察 ,其结果与上述类似 , 而且还看到苹果叶背面的茸
毛全部着生于叶脉 , 变异株叶脉上茸毛增多 , 叶脉加粗 (图版 Ⅰ27、8) 。
讨 　　论
11 苹果叶片诱导产生的不定芽一般是单细胞或少数细胞起源的[1 ] , 从理论上讲 ,诱变后
获得的植株应该是高频的同质突变体。通过对变异株进行梢端组织学切片 ,发现 3 个组织发
32　1 期 苹果叶片离体培养中秋水仙素加倍效应的研究
图版 Ⅰ　苹果叶片经秋水仙素处理后再生苗的加倍效果观察
Plate Ⅰ　The doubling effect of colchicine on regenerated plantlets from leaves in vit ro of apple plants
1. 二倍体植株的染色体数目 (2n = 2x = 34) 。　21 变异株的染色体数目 (2n = 4x = 68) 。
3. 二倍体植株的核仁数目。　41 变异株的核仁数目。　51 二倍体植株的梢端切片。
61 变异株的梢端切片。　71 二倍体植株叶背的白茸毛。　81 变异株叶背的白茸毛。
91 二倍体植株的气孔细胞大小。101 变异株气孔细胞大小。
1. Chromosome number of diploid plants (2n = 2x = 34) . 　2. Chromosome number of
variant plants ( 2n = 4x = 68) . 　3. Nucleolus number of diploid plants. 　4. Nucleolus
number of tetraploid plants. 　5. Section of paraffin2embeded shoot apices of diploid plants.
　6. Section of paraffin2embeded shoot apices of tetraploid plants. 　7. White hairs on leaf
back of diploid plants. 　8. White hairs on leaf back of variant plants. 　9. Stomatal cell
size of diploid plants. 　10. Stomatal cell size of variant plants.
生层的细胞大小一致的同质突变体的频率高达 86 %。这样可大大简化分离、筛选工作 ,使四倍
体的利用尽快成为可能。
表 4 　变异株气孔大小及单位面积的数目
Table 4 　The stomata size and the number in mutants of apple plants
试　材
Materials
观察气孔数
Observed stomata
number
气孔大小
Stomata size
(μm)
单位面积气孔数
Stomata number/ mm2
嗄啦 Gala 200 22. 3 ×14. 2 173
嗄啦变异株 Variant of Gala 200 32. 2 ×17. 4 117
千秋 Senshu 200 20. 42 ×15. 1 168
千秋变异株 Variant of Senshu 200 34. 6 ×18. 4 103
21 本实验采用离体培养苹果叶片的方法 , 结合秋水仙素处理 ,加倍的目的性明确 ,所以 ,
获得的四倍体植株继承了母本的许多优良性状 ,不必进一步改良 ,就有希望选育出生产上直接
应用的品种。虽然生产上尚无直接应用四倍体苹果的成功先例 , 但这是一个值得探索的领
42 核　农　学　报 11 卷
域。
31 本实验用适宜的秋水仙素溶液浸泡苹果离体叶片 ,结合组织培养得到了多倍体变异
株。然而 ,在培养基中加入秋水仙素 ,或用秋水仙素溶液浸泡叶片分化成的愈伤组织等诱变方
法 ,还有待进一步研究 ,摸索出最有效的途径。
41 秋水仙素对离体叶片有较强的毒害作用 , 能明显抑制不定芽的分化 ,处理后必须用无
菌水反复冲洗。秋水仙素的毒害作用使叶片分化成的植株生长缓慢 ,继代几次后 ,在培养中逐
渐褐化死亡 , 其作用机理仍需进一步研究。
参 考 文 献
1 　李雅志 1 无性繁殖植物辐射育种的新方法 1 北京 :原子能出版社 ,1991 ,128
2 　石荫坪 ,王强生 ,周光芳等 1 苹果试管染色体组工程育种 1 落叶果树 ,1993 , (4) :1～6
3 　达克东 ,李雅志 ,束怀端 1 苹果叶片愈伤组织植株再生的研究 1 核农学报 ,1995 ,9 (3) :139～143
4 　林盛华 1 我国苹果品种 (系)染色体数目的观察 1 中国果树 ,1985 ,25 (3) :33～35
5 　Derman H. Inducing polyploidy in peach varieties. J Hered , 1947 , 38 (3) :77～88
6 　Einset J . Spontaneous polyploidy in cultivated apples. Soc Hort Sci , 1952 , 59 :291～302
7 　Gmitter FG , Ling XB , Cai CY. Colchicine2induced polypoidy in citrus embryogenic culture , somatic embryos , and regenerated
plantlets. Plant Science , 1991 , 74 (1) :135～141
8 　Lapins KO. Polyploidy and mutations induced in apricot by colchicine treatment . Can J Gnet Cytol , 1975 , 17 (4) :591～599
9 　Ronald GG , Paul ML . In vit ro colchicine treatment of 4x blueberries. J Amer Soc Hort Sci , 1984 , 109 (3) :336～338
STUDY ON THE DOUBL ING EFFECT OF COLCHICINE ON L EAVES in vit ro
OF APPL E SEEDL INGS
Wang Changquan 　Li Yazhi 　Cui Decai 　Su Huairui
( S handong A gricult ural U niversity , Taian 271018)
ABSTRACT
　　Leaves in vit ro of t wo diploid apple cultivars were treated with different concentrations of
colchicine and 2 % DMSO solution. Among all treatments , 0. 5 % of colchicine treating for 4
days showed the best effect with variation frequency of 56. 1 %. Obvious changes occured in the
morphological and cytological aspects of the induced tetraploid apple plants. In comparison with
normal plants , variant plants showed the following features :the stem became dwarf and think;
node was shorten ; the leaves’colour appeared dark green. The stomatal cell size was larger than
that of diploid plants. The number of the stomata per unit area of the leaves in variant plants
distinctly reduced. The chromosome number were determined to be 2n = 2x = 34 for diploid
plants and 2n = 4x = 68 for variant plants. The nucleolus number of variant plants increased. By
the means of section of paraff in2embeded shoot apices , 86 % of variant plants have been identi2
f ied as sol id tetraploid.
　　 Key words : Apple , leaves , polyploid , colchicine
52Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1997 ,11 (1) :21～25