全 文 ：核 农 学 报 2011，25(1):0053 ～ 0056
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2011)01-0053-04
耐辐射球菌 Rsr增强大肠杆菌抗逆性的研究
杨明坤1 张 颖1，2 侯晓光1 郝艳华1 张 维1 陈 明1
(1. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;2. 中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009)
摘 要:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)Rsr 蛋白(DR_1262 编码)是一种对辐射抗性起重要作用的
RNA 结合蛋白。本研究将完整的 rsr 基因连接到带有 groESL 启动子的 pMD-GroE 载体上，构建了 Rsr
表达菌株。以含空载质粒 pMD-GroE 的大肠杆菌为对照，发现 Rsr 的表达提高了大肠杆菌的 UV 辐射抗
性，并增强了细胞的高温和盐抗性。实时定量 PCR 分析显示在盐胁迫条件下 Rsr 表达菌株海藻糖合成
酶基因的表达上调，暗示 Rsr 提高了大肠杆菌胞内海藻糖的积累，促进了细胞的盐耐受能力。
关键词:耐辐射球菌;大肠杆菌;Rsr;高盐;海藻糖
RADIORESISTANT BACTERIUM Deinococcus radiodurans Rsr PROTEIN
ENHANCES ABIOTIC STRESS TOLERANCE OF Escherichia coli
YANG Ming-kun1 ZHANG Ying1，2 HOU Xiao-guang1 HAO Yan-hua1 ZHANG Wei1 CHEN Ming1
(1 . Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081;
2 . Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450009)
Abstract:The Deinococcus radiodurans Rsr protein (encoded by DR _1262)，an RNA-binding protein contributes to
radiation resistance. To study the effect of Rsr in Escherichia coli，we compared the abiotic stress response in an E. coli
control strain carrying only the pMD-GroE plasmid and a transformant strain expressing Rsr under control of the groESL
promoter. The results indicated that D. radiodurans Rsr not only improved the resistance of E. coli to ultraviolet
irradiation，but also confered enhanced temperature and salt tolerance in E. coli. Quantitative real-Time PCR analysis
showed that the expression of trehalose synthase genes was upregulated under salt stress in the Rsr-expressing strain，
suggesting that the accumulation of high levels of the trehalose leads to the improved salt tolerance.
Key words:Deinococcus radiodurans;Escherichia coli;Rsr;salt;trehalose
收稿日期:2010-07-07 接受日期:2010-09-27
基金项目:国家高技术研究发展计划项目(2007AA021305)，国家自然科学基金项目(30970069)，农业部公益性行业科研专项(200803034)
作者简介:杨明坤(1985-)，男，湖北襄樊人，硕士研究生，从事极端环境微生物遗传工程的研究。Tel:010-82109861;E-mail:copyymk@ 126. com
通讯作者:陈 明(1962-)，男，广东兴宁人，研究员，从事分子生物学研究。Tel:010-82106106;E-mail:chenmingbio@ hotmail. com
耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是最初由
Anderson 等人［1］于 1956 年从辐照灭菌处理后仍有腐
败的肉罐中分离到的一株红色、无孢子的革兰氏阳性
球菌，该菌具有对电离辐射、紫外线、强氧化剂和化学
诱变剂极端抗性，同时具有极强的耐旱能力［2，3，4］。其
超强的 DNA 损伤修复能力及在辐射污染物生物治理
方面的应用一直倍受生物界、医学界和环境工程界的
关注和重视［5 ～ 7］。已公布的 D. radiodurans 全基因组
序列［8］显示基因组中有许多与胁迫反应相关的基因
以及功能未知具有种属特异性的基因，如海藻糖合成
酶基 因 (DR0933 和 DR0463)，过 氧 化 氢 酶 基 因
(DR1998，DRA0259 和 DRA0146)，干燥抗性相关同源
基因(DR1372，DR1172，DRB0118 和 DR0105)等，这些
基因在细胞抗旱等胁迫抗性中起到重要作用［9］。再
如 irrE 基因(又称 pprI)，被认为是耐辐射球菌辐射抗
性的开关基因［10，11］，在大肠杆菌(E. coli)中表达后能
显著提高细胞的辐射抗性以及清除氧自由基的能
力［11］，同时还能显著增强细胞的耐盐抗旱等多种胁迫
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抗性，以及赋予植物极高的耐盐性状［12］。耐辐射球菌
DR1262 基因亦编码一种同源的 Ro 抗原蛋白(Rsr)，
Ro 抗原蛋白是类似于细胞角蛋白(中间丝系统)的一
种纤维网络，属于小分子胞浆核糖核蛋白颗粒
(RNP)，由多肽分子和一族小 RNA(Y-RNA)组成［13］，
大多数存在于高等真核细胞中。已有研究表明，Rsr
蛋白能够结合 UV 辐射后细胞中产生的某些小 RNA，
提高细胞 UV 辐射抗性［14］。目前，该基因的其他非生
物胁迫抗性还未见报道。本研究选用遗传背景清楚的
E. coli 作为研究对象，通过构建 rsr 基因表达的 E. coli
菌株，研究和探讨 rsr 对增强细胞耐盐能力等非生物胁
迫抗性的生物学功能。
1 材料与方法
1. 1 供试材料和试剂
供试菌株及质粒见表 1。大肠杆菌(Escherichia
coli)于 LB 培养基(1% Typtone，0. 5% Yeast extract，
1% NaCl， pH7. 0)中，37℃ 培 养。耐 辐 射 球 菌
(Deinococcus radiodurans)于 TGY 培 养 基 (0. 5%
Typtone，0. 3% Yeast extract，0. 1% glucose)中 30℃培
养。试验所用限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购于
NEB 公司，TaqDNA 聚合酶、dNTP 购于 TaKaRa 公司。
引物合成由北京擎科生物技术公司完成。
表 1 菌株和质粒的特性与来源
Table 1 Characteristics and sources of strains and plasmids
菌株和质粒
strain and plasmid
特性
characteristic
来源
source
Deinococcus radiodurans R1 野生型 中科院微生物所菌保中心
E. coli JM109 高频转化受体菌 购于 TransGen Biotech 公司
pMD18T 克隆载体，Apr，携带 lacZ 基因 TaKaRa 公司
pMD-GroE pMD18T 插入含 groESL 启动子 本实验室保存
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR 方法与条件 D. radiodurans 基因组
DNA 的提取和纯化参见文献［15］;质粒 DNA 的提取
采用碱裂解法;DNA 片段回收采用 OMEGA 公司 Gel
Extraction Kit (目录号 D2500-01)。大肠杆菌转化方
法采用电穿孔转化法;根据 D. radiodurans R1 基因组
序列［8］设计 rsr 基因引物:5′-ACTAGTATGAAGAACTT-
GCTCCGT-3′ 和 5′-CATATGGTCGTTAGAGATGGTGC-
3′;PCR 反应条件是:94℃ 5min;94℃ 30s，56℃ 30s，
72℃ 45s，30 个循环;72℃ 10min。
1. 2. 2 重组质粒的构建与验证 通过 PCR 扩增完整
的 rsr 基因产物，连接到载体 pMD18T-vector，构建成
pMD-Rsr。用 Nde I 和 Spe I 消化质粒 pMD-Rsr，并用琼
脂糖凝胶回收 300bp 的 rsr 基因片段;同时将质粒
pMD-GroE 用 Nde I 和 Spe I 消化，再将其与回收得到
的 rsr 基因片段连接，转化 E. coli JM109，在含有
50μg /ml Ap 的 LB 平板上进行筛选，获得的质粒命名
为 pTGroE-Rsr。重组质粒 DNA 序列 Nde I 和 Spe I 酶
切验证。
1. 2. 3 UV 辐射后菌株生存率的测定 将保存的菌液
活化后，转接至 20ml LB 液体培养基中。培养到稳定
期后离心收集菌体，用 10ml 磷酸缓冲液(10mmol /L，
pH 7. 0)洗涤菌体 2 次，重悬于等体积磷酸缓冲液中。
在 2J /m2·s 的 UV 下辐射，在照射剂量达 60 和 130 J /
m2 时取样，样品经稀释后涂板，培养 1 ～ 2 天后计算菌
落数。
1. 2. 4 热冲击试验 取 2ml 对数期细胞(OD600约
0. 5)，分别置于 37℃和 53℃水浴中冲击 0. 5h，经稀释
后，每个稀释度各取 10μl 点于 LB 固体培养基上，37℃
培养 16h 后，观察菌落形成情况。
1. 2. 5 盐胁迫下细胞的生长
取 2ml 对数期细胞(OD600约 0. 5)，分别接种在于
LB 液体培养基和含 1mol /L NaCl 的 LB 液体培养基中
37℃培养，每隔 4h 取样，在波长 600nm 下测定培养物
的菌体浓度(OD600值)。
1. 2. 6 盐胁迫条件下的基因表达差异分析 菌株培
养至对数期后，向摇瓶中加入 5mol /L 的 NaCl 使终浓
度为 1mol /L，37℃培养 1h 后，收集菌体，参照 Promega
及 NEB 公司的 RNA 提取试剂盒及反转录试剂盒的说
明提取总 RNA，并反转录出 cDNA，通过实时定量 PCR
分析胁迫条件下的基因表达差异。
2 结果与分析
2. 1 rsr 基因表达质粒 pTGroE-Rsr 的验证
重组表达质粒 pTGroE-Rsr 经 Spe I 和 Nde I 双酶
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1 期 耐辐射球菌 Rsr 增强大肠杆菌抗逆性的研究
切后，电泳图(图 1)显示酶切产物中含有一条 1596bp
的条带，符合设计要求。进一步对该片段进行 DNA 测
序，显示所克隆的 DNA 片段与 Deinococcus radiodurans
R1 基因组序列中的 rsr 基因一致。表明 pTGroE-Rsr
构建的正确性。
图 1 表达质粒酶切验证
Fig. 1 Restriction analysis of expression plasmid
1:λDNA EcoR I and Hind III maker;2:pTGroE-Rsr
图 3 非生物胁迫对 Rsr 表达菌株及对照菌株生长的影响
Fig. 3 Effects of abiotic stresses on growth of Rsr-expressing strain and control strain
A:非生物胁迫处理后，Rsr 表达菌株与对照菌株的生长情况;B:Rsr 表达菌株与对照菌株在 LB 培养基中生长情况;
C:Rsr 表达菌株与对照菌株在含有 1mol / L NaCl 的 LB 培养基中的生长情况
A:Growth of E. coli control strain carrying pMG-GroE (1)and Rsr-expressing strain (2)in LB medium after exposure to various abiotic stresses;
B and C:Growth of the control strain (△)or the Rsr-expressing strain (□)in LB medium and in LB medium containing 1. 0mol / L NaCl.
2. 2 Rsr 表达对大肠杆菌非生物胁迫耐受性影响
为研究 rsr 基因的功能，本研究测定了稳定期 Rsr
表达菌株与对照菌株在 UV 辐射、高温和高盐胁迫下
菌株的生存能力。
如图 2 所示，UV 辐照后，Rsr 表达菌株的生存率
比对照菌株高出 1 个数量级，表明 Rsr 能增强 E. coli
对 UV 辐射的耐受能力。
进一步对菌株在其他胁迫条件下的细胞生存能力
图 2 Rsr 表达菌株(□)与对照菌株(△)
的 UV 辐射生存曲线
Fig. 2 Survival curves of Rsr-expressing
strain (□)and control strain (△)exposed
to UV light
进行分析，发现高温(53℃)冲击 30min、高盐(4mol /L
NaCl)冲击 30min 和 H2O2(1%)冲击 10min 后，Rsr 表
达菌株的细胞生存能力明显高于对照菌株(图 3 －
A)，表明 Rsr 在 E. coli 中表达增强了该菌对高温、高
盐和氧化胁迫的耐受能力。
在正常生长条件(LB 培养基，37℃)下，Rsr 表达
菌株与对照菌株的生长没有明显差异(图 3 － B)。而
当 LB 培养基中的 NaCl 浓度达到 1mol /L 时，对照菌株
的延滞期较长，其生长在 36h 时达到最大值(OD600为
1. 2)。而 Rsr 表达菌株能够较快适应盐胁迫环境，没
有明显的延滞期，在 24h 时细胞生长进入稳定期，其
OD600达 1. 8(图 3 － C)。可见在盐胁迫条件下 Rsr 表
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达菌株的生长显著优于对照菌株。
2. 3 Rsr 表达对海藻糖相关基因表达水平的影响
海藻糖为细胞渗透保护物质，在非生物胁迫(如
高温、饥饿、高渗等)条件下，细胞通过积累海藻糖，取
代生物大分子所失去的水膜或阻止生物膜的相变，在
生物细胞(包括原核生物和真核生物)抵御胁迫逆境
中起重要作用。为此，本研究分析了盐胁迫条件下，
Rsr 表达菌株中海藻糖合成与降解相关基因在转录水
平上的变化。结果显示 Rsr 表达菌株能显著提高海藻
糖合成基因的相对表达水平(图 4)，Rsr 表达菌株相对
于对照菌株，其海藻糖合成途径相关基因(ostA、ostB)
表达水平上调 4 倍以上，而降解途径中的基因(treB、
treC)表达水平基本不变，表明 Rsr 表达可促进胞内海
藻糖的积累，从而有利于大肠杆菌对非生物胁迫抗性
的增强。
图 4 海藻糖合成降解基因的相对表达水平
Fig. 4 Relative expression levels of genes involved
in synthesis and degradation of trehalose
■:Rsr 表达菌株 Rsr-expressing strain;
□:对照菌株 control strain
3 讨论
Ro 抗原蛋白大多数存在于高等真核细胞中，与胞
内小 RNA(Y RNA)形成复合物，有助于稳定小 RNA，
并在核糖体生物合成过程中发挥作用，然而其具体作
用机制仍不清楚［16］。在耐辐射微生物 D. radiodurans
中，也存在同源的 Ro 抗原蛋白［8］，其 rsr 基因缺失突
变株对 UV 辐射敏感，但不影响 D. radiodurans 的电离
辐射抗性［14］。本研究结果显示 Rsr 在大肠杆菌中的
表达能提高细胞的 UV 辐射抗性，而且发现 Rsr 能明
显增强细胞对高温、高盐等非生物胁迫的抗性。
海藻糖是原核生物和真核生物中十分重要的一种
抵御胁迫逆境的非还原性二糖，在细胞中作为相容性
溶质和碳源存在，分别具有相应的合成和分解途径，受
到胁迫的严格调节以避免无用循环的产生。高渗胁迫
下，细胞中积累海藻糖，通过取代水与生物大分子表面
结合，维持蛋白结构与膜高度有序性从而保护细
胞［17］。本研究结果表明在 1mol /L NaCl 胁迫条件下，
Rsr 蛋白在大肠杆菌中的表达导致细胞海藻糖合成途
径相关基因(ostA、ostB)转录表达上调，促进胞内海藻
糖的积累。细胞中海藻糖代谢水平的变化可能是 Rsr
提高大肠杆菌非生物胁迫抗性的路径之一。该蛋白增
强环境胁迫抗性的机制还有待进一步研究。
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