全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022197206
离子束介导玉米 DNA 的水稻变异后代 AFLP 分析
姬生栋　陈　鹏　王加传　袁　召　岳春辉　王知丰
(河南师范大学生命科学学院 ,河南 新乡　453007)
摘 　要 :利用离子束介导法将玉米 (郑单 14) DNA 片段转入水稻豫粳 6 号 ,经过 5 年的筛选得到了基本稳
定遗传的水稻变异株系。本研究通过对 64 对 AFLP 选扩引物的筛选 ,优选出了 18 对选扩引物 ,它们能
同时在 2 个变异株系中扩增出大量的 DNA 指纹条带 ,并且同时能扩增出差异带及“目的带”。用 AFLP
分子标记初步分析了 2 个变异株系与对照间的差异 ,变异株系中出现了新带、缺失带和“目的带”等几种
情况 ,这些 DNA 水平上的差异 ,表明离子束介导玉米 DNA 育成的水稻材料可能已经插入了玉米的
DNA。
关键词 :离子束 ;水稻 ;AFLP ;玉米 DNA
AFLP ANALYSIS OF RICE TRANSFORMED WITH MAIZE DNA BY PARTICLE BEAM
J I Sheng2dong 　CHEN Peng 　WANGJia2chuan 　YUAN Zhao 　YUE Chun2hui 　WANG Zhi2feng
( College of Life Science , Henan Normal University , Xinxiang , Henan 　453007)
Abstract :Many stable heritable rice lines were obtained via five years agricultural selection , which were derived from rice
(Oryza stative Japonica) Yujing26 transgened with large fraction DNA of Zhengdan214 ( zea mays L. ) by particle beam
method. 18 pairs optimum selective primers were got by screening from 64 pairs AFLP selective primers via experiment on two
mutant lines , which could amplify many DNA fingerprints and also could amplify polymorphic bands and target bands , both in
this two mutant lines. Then the two mutant lines and two controls were analyzed with AFLP , the results showed that many
polymorphic bands (such as novel bands , target bands , missing bands) were found in mutant lines. The discrepancy in DNA
level indicated that rice , transgened with large fraction DNA of Zhengdan214 by particle beam , might be inserted maize DNA
and inherited steadily in some degree. It also indicated that it was possible to cultivate novel rice variety transformed with wide
DNA by particle beam.
Key words :particle beam ; rice ; AFLP ; maize DNA
收稿日期 :2008207224 　接受日期 :2008210212
基金项目 :河南省自然科学基金 (082300430360) ,河南省国际科技合作项目 (0646620016)
作者简介 :姬生栋 (19632) ,男 ,河南焦作人 ,副教授 ,从事作物分子育种研究。E2mail :jisd99 @126. com　　扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment LengthPolymorphism ,AFLP) ,是 1993 年由荷兰科学家 Zabeau发明 ,并由 Vos 发展起来的一项专利技术[1 ] 。AFLP 实质上是 RFLP 和 RAPD 相结合的产物 ,既有 RFLP 的稳定性 ,又有 RAPD 的灵敏性。它多态性极其丰富 ,DNA用量少 ,检测效率高 ,可靠性好 ,重复性高 ,是一种十分理想的分子标记。目前已广泛应用于遗传图谱构建[2 ,3 ] 、轮回选择育种、杂种优势分析、QTL 分析、遗传多样性分析[4 ,5 ]及品种鉴定等领域 ,利用 AFLP 分离差 异条带并回收、克隆、测序进行基因定位 ,构建遗传标记应用于MAS[6 ,7 ] 。不足之处是该技术费用比较昂贵 ,而且对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。许多基于 AFLP 的新技术如 MITE2AFLP[8 ] ,AFLP2SCAR[9 ] ,STS2AFLP[10 ]等已广泛应用于水稻各方面的研究。离子束介导外源基因的遗传转化技术是由我国科学家余增亮等[11～13 ] 在 20 世纪 90 年代初原创的新技术 ,这门新颖的边缘学科技术一经面世就在全世界引起了轰动 ,该技术在诱变育种和介导远缘大片段外源
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DNA 转基因育种上有很大优势 ,目前已广泛应用于水
稻、小麦、玉米等农作物育种中 ,并且在微生物、花卉育
种等方面也取得了重要成果。经过 10 多年的发展 ,目
前利用该技术已育成很多具有优良性状并稳定遗传的
新品种。我们实验室在 2003 年利用该技术介导玉米
大片段 DNA 转化水稻豫粳 6 号得到了大量的变异材
料 ,经过连续 5 代田间筛选 ,得到了一批具有玉米某些
特征且稳定遗传的水稻新材料 ,这些变异材料丰富了
水稻的种质资源库。但这些转化后代的变异性状究竟
是由于外源 DNA 片断整合到受体基因组中互作表达 ,
还是外源 DNA 的插入引发了受体的自身突变 ? 其中
的原理还不清楚。我们实验室利用蛋白质指纹和同工
酶标记技术对这些新材料开展了研究 ,发现了变异株
系的一些新蛋白质 ,这很可能是由于外源 DNA 片段整
合到水稻基因组中导致了在蛋白质水平上的差异表
达 ,有必要进一步对变异材料进行 DNA 水平研究。在
前人 RAPD 研究[14 ,15 ] 的基础上 ,本试验采用了多态性
好、技术较稳定的 AFLP 技术来深入研究 ,以期为离子
束介导远缘外源大片段 DNA 提供分子依据 ,为基因的
克隆、定位和功能研究提供数据。
1 　材料与方法
111 　材料
阳性对照为玉米 ( Zea mays L. ) 郑单 14 ;阴性对照
为水稻 ( Oryza Stative Japonica) 豫粳 6 号 ,变异株系为
072421212324323 (已遗传 5 代 , 株高 121cm , 剑叶长
42cm ,剑叶宽 214cm ,深紫色叶鞘 ,颖尖和 1Π3 颖壳为深
紫色) 和 0724212124212329 (已遗传 5 代 ,株高 150cm ,剑
叶长 38cm ,剑叶宽 216cm ,紫色叶鞘 ,颖尖紫色 ,大量分
蘖 ,均为有效分蘖) ,分别以 A、B、C和 D 表示。各材料
于 29 ℃恒温黑暗培养成三叶黄化苗供 DNA 提取。
112 　方法
11211 　基因组DNA 提取 　每个材料取 30 株三叶期黄
化苗嫩叶 ,按照植物基因组 DNA 快速提取试剂盒 (北
京鼎国) 操作步骤提取 DNA 制成 30 株混样。提取的
DNA 经 018 %琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量 ,再经
752 型紫外分光光度计测得 OD260ΠOD280 = 118 ±0101 ,
据标样计算其浓度 ,稀释到 100～200ngΠL 作为 AFLP
分析的模板。
11212 　AFLP 反应体系及扩增条件 　参照焦浈[16 ] 、李
娜[17 ]优化的 AFLP 分析体系 ,稍有调整。
1121211 　基因组 DNA 的酶切反应体系　每个 DNA 样
品的酶切混合液包括 : 灭菌 ddH2O 1219μl , Pst Ⅰ
Buffer H 1μl , BSA (100 ×) 011μl , Mse ⅠBuffer R 1μl ,
Pst Ⅰ (12UΠμl ) 015μl , Mse Ⅰ (10UΠμl ) 015μl , 模板
DNA 4μl , 共 20μl 体系。混匀离心数秒 ,37 ℃3h 酶切 ,
80 ℃灭活 10min。
1121212 　DNA 片段接头的连接反应体系　连接反应
体系总体积为 20μl ,包括 :灭菌 ddH2O 615μl , Pst Ⅰ接
头 (5μmolΠL) 1μl , Mse Ⅰ接头 (50μmolΠL) 1μl ,10 ×T4
Ligase Buffer 1μl , T4 Ligase ( 3UΠμl ) 015μl , 酶切产物
10μl。混匀离心数秒 ,16 ℃连接 12h ,70 ℃灭活 10min ,
4 ℃保存 ,用 112 %琼脂糖电泳 ,紫外光下检测酶切、连
接情况。
1121213 　DNA 片段的预扩增与选择性扩增反应体系
　取连接产物 2μl , 加入灭菌 ddH2O 1418μl , 10 ×
Ex Taq Buffer 215μl ,dNTPs (各 215mmolΠL) 2μl ,MgCl2
(25mmolΠL) 115μl , Pst Ⅰ预扩引物 (5μmolΠL) 1μl , Mse Ⅰ
预扩引物 (5μmolΠL) 1μl , ExTaq (5UΠμl ) 012μl ,混匀离
心数秒 , 94 ℃预变性 2min , 94 ℃ 30s , 56 ℃ 30s , 72 ℃
80s ,30 个循环 , 72 ℃5min 进行预扩增 ,产物 4 ℃保存 ,
取 5μl 在 112 %琼脂糖胶中检测扩增效果。
预扩增产物用灭菌双蒸水稀释 10 倍 ,作为选择性
扩增的模板。取 2μl 预扩增 10 倍稀释液 ,加入灭菌
ddH2O 1218μl , 10 ×ExTaq Buffer 215μl , dNTPs (各
215mmolΠL) 2μl , MgCl2 (25mmolΠL) 115μl , Pst Ⅰ选扩引
物 (5μmolΠL) 2μl , Mse Ⅰ选扩引物 (5μmolΠL) 2μl , ExTaq
(5UΠμl) 012μl , 混匀离心数秒 ,94 ℃预变性 2min ,94 ℃
30s ,65 ℃ 30s ( - 017 ℃Π循环 ) , 72 ℃ 80s , 12 个循环 ,
94 ℃30s ,56 ℃30s ,72 ℃80s ,23 个循环 ,72 ℃5min , 选
择扩增 ,产物 4 ℃保存 ,取 5μl 在 112 %琼脂糖凝胶中检
测扩增效果。接头和引物见表 1。
表 1 　AFLP接头和引物序列
Table 1 　The sequences of AFLP adapters and primers
Pst Ⅰ接头 (adapter) :
　　　5′2CTCGTAGACTGCGTACATGCACATCTGACGCATGT25′
Mse Ⅰ接头 (adapter) :
　　　5′2GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT25′
预扩增引物 (pre2amplication primer) :
Pst Ⅰ预扩引物 : 5′2GAC TGC GTA CAT GCA GA23′
Mse Ⅰ预扩引物 : 5′2GAT GAG TCC TGA GTA AC23′
选择性引物 (selective primer)
　　　Po :5′2GAC TGC GTA CAT GCA G
　　　Mo :5′2GAT GAG TCC TGA GTA A
Pst Ⅰ选扩引物 (含 3 个选择性碱基) :
P1 :Po2AAC　P2 : Po2AAG　P3 : Po2ACA 　P4 : Po2ACC
P5 : Po2ACG　P6 : Po2ACT　P7 : Po2AGC　P8 : Po2AGG
Mse Ⅰ选扩引物 (含 3 个选择性碱基) :
M1 : Mo2CAA 　M2 : Mo2CAC　M3 : Mo2CAG　M4 :Mo2CAT
M5 : Mo2CTA 　M6 :Mo2CTC　M7 : Mo2CTG　M8 :Mo2CTT
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114 　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
配制 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶 (6 %丙烯酰胺 ,
0132 %甲叉丙烯酰胺 , 7molΠL 尿素 , 1 ×TBE) ,稳压
200V 预电泳 30min ,扩增产物中加入一半体积的上样
缓冲液 (98 %去离子甲酰胺 ,10mmolΠL EDTA , 0125 %溴
酚蓝 ,0125 %二甲苯菁) 95 ℃变性 5min 后 ,立即转移至
冰浴中冷却 5min ,取 8μl 样品上样 ,稳压 300V 电泳 5h
左右至二甲苯菁离胶下沿 1cm 处停止电泳。
115 　银染
小心取下胶于 10 %乙酸中固定 30min 左右至前沿
颜色褪尽 ,用双蒸水洗 2 次 ,10minΠ次 ,转至染色液 (1g
硝酸银溶于 1000ml 双蒸水中 ,用时加入 115ml 37 %甲
醛)染色 30min ,经双蒸水快速漂洗 6～8s ,转至预冷处
理的显影液 (30g 无水碳酸钠溶于 1000ml 双蒸水中 ,用
时加入 115ml 37 %甲醛和 200μl 10mgΠml 硫代硫酸钠)
中轻摇显色 ,至电泳条带清晰 ,倾去显影液 ,加入固定
时用过的 10 %乙酸停影 2min ,倒去停影液将凝胶用双
蒸水洗 2 次后 ,照相或制成干胶保存。
116 　相似率计算
根据 Nei [16 ]等人的酶带相似率计算公式进行数据
分析。相似率 = (2 ×Nab)Π(Na + Nb) ×100 %。其中
Nab 为样品 a 和 b 之间共有的 DNA 扩增带数目 ,Na 为
样品 a 具有的 DNA 扩增带数目 ,Nb 为样品 b 的 DNA
扩增带数目。
2 　结果与分析
211 　AFLP 扩增引物的筛选
试验选用 64 对引物 (8 个 Pst Ⅰ选扩引物和 8 个
Mse Ⅰ选扩引物的组合)对 2 个变异株系及对照的基因
组 DNA 进行了 AFLP 分析 (表 2 ,图 1) 。结果表明 :除
P5 和 M1～8 引物组合对的扩增条带稍差些 ,其他引物
表 2 　64 对引物在材料 A、B、C、D 中的扩增条带数情况统计
Table 2 　The statistics of bands in line A ,B ,C and D amplified with 64 pairs of selective primers
引物
primer
扩增条带总数
total number of
amplified bands
扩增差异
条带数
total number of
polymorphic
bands
扩增差异
条带比例
the ration of
polymorphic
bands
A B C D C D C D
引物
primer
扩增条带总数
total number of
amplified bands
扩增差异
条带数
total number of
polymorphic
bands
扩增差异
条带比例
the ration of
polymorphic
bands
A B C D C D C D
P1M1 35 38 26 29 3 1 0112 0103 P5M1 11 7 12 8 0 0 0100 0100
P1M2 17 20 13 20 1 0 0108 0100 P5M2 13 10 8 9 0 0 0100 0100
P1M3 21 23 19 24 4 5 0121 0121 P5M3 12 14 14 11 2 1 0114 0109
P1M4 24 26 26 30 1 3 0104 0110 P5M4 11 10 4 6 0 1 0100 0117
P1M5 16 19 16 17 0 0 0100 0100 P5M5 6 10 8 3 0 0 0100 0100
P1M6 6 21 20 21 1 1 0105 0105 P5M6 6 12 9 7 0 0 0100 0100
P1M7 7 20 15 26 0 5 0100 0119 P5M7 8 11 12 6 0 0 0100 0100
P1M8 27 19 20 15 0 2 0100 0113 P5M8 7 14 17 12 1 0 0106 0100
P2M1 19 28 28 26 1 0 0104 0100 P6M1 30 28 24 24 1 1 0104 0104
P2M2 22 24 28 29 1 1 0104 0103 P6M2 24 19 21 23 1 2 0105 0109
P2M3 22 26 24 25 2 1 0108 0104 P6M3 23 18 19 19 3 2 0116 0111
P2M4 25 25 23 30 1 1 0104 0103 P6M4 18 18 19 16 0 0 0100 0100
P2M5 23 25 27 28 2 4 0107 0114 P6M5 17 21 22 25 1 4 0105 0116
P2M6 21 28 19 24 0 4 0100 0117 P6M6 15 16 17 15 0 1 0100 0107
P2M7 23 25 23 24 1 1 0104 0104 P6M7 15 14 16 16 2 1 0113 0106
P2M8 16 23 24 27 2 2 0108 0107 P6M8 21 19 19 22 0 1 0100 0105
P3M1 15 16 16 17 1 1 0106 0106 P7M1 13 18 19 18 0 0 0100 0100
P3M2 15 19 22 18 4 3 0118 0117 P7M2 14 14 15 15 1 1 0107 0107
P3M3 22 20 18 18 1 1 0106 0106 P7M3 14 18 17 18 0 1 0100 0106
P3M4 14 19 18 18 1 2 0106 0111 P7M4 16 16 15 15 0 0 0100 0100
P3M5 12 20 19 18 0 0 0100 0100 P7M5 22 20 21 19 0 0 0100 0100
P3M6 14 14 16 16 1 1 0106 0106 P7M6 20 21 19 21 1 1 0105 0105
P3M7 13 16 19 17 2 3 0111 0118 P7M7 24 18 16 16 0 0 0100 0100
P3M8 12 20 14 15 3 2 0121 0113 P7M8 19 21 21 20 0 0 0100 0100
P4M1 20 15 14 13 1 2 0107 0115 P8M1 20 23 23 20 0 0 0100 0100
P4M2 10 16 15 12 0 0 0100 0100 P8M2 18 17 16 22 3 2 0119 0109
P4M3 13 12 13 13 3 2 0123 0115 P8M3 15 16 12 11 1 2 0108 0118
P4M4 16 16 15 15 1 1 0107 0107 P8M4 12 16 14 13 0 2 0100 0115
P4M5 11 17 15 14 2 3 0113 0121 P8M5 22 21 23 24 3 3 0113 0113
P4M6 15 11 10 9 2 2 0120 0122 P8M6 24 21 20 20 1 2 0105 0110
P4M7 8 7 8 6 0 0 0100 0100 P8M7 23 24 26 24 1 2 0104 0108
P4M8 9 13 12 14 0 0 0100 0100 P8M8 23 21 22 18 2 5 0109 0128
991　2 期 离子束介导玉米 DNA 的水稻变异后代 AFLP 分析
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对均能扩增出较清晰的带。各样品基因组 DNA 扩增
出的带总数在 1079～1187 之间 ,平均 1136 条 ,玉米扩
增的带较水稻的要少 ,其中大多数带在 200bp～3000bp
之间。各对引物在各材料中的扩增条带总数如表 2 所
示 ,扩增出较多条带的引物对主要为 P1 ,P2 ,P6 ,P7 ,P8
和 M1～8 的引物组合对。64 对引物在材料 C、D 中的
扩增差异条带数和差异比例如表 2 所示 ,各对引物在
材料 C ,D 中扩增出的差异带在 0～5 条左右 ,以 1～3
条居多 ,差异比例在 0～0128 之间 ,以 0105～0115 占大
多数。通过分析 ,变异株系 C和D 在以下 36 对引物中
能同时扩增出差异带 : P1M1、P1M3、P1M4、P1M6、
P2M2、P2M3、P2M4、P2M5、P2M7、P2M8、P3M1、P3M2、
P3M3、P3M4、P3M6、P3M7、P3M8、P4M1、P4M3、P4M4、
P4M5、P4M6、P5M3、P6M1、P6M2、P6M3、P6M5、P6M7、
P7M2、P7M6、P8M2、P8M3、P8M5、P8M6、P8M7、
P8M8。　　
图 1 　64 对引物的部分银染结果
Fig. 1 　Some silver stained results amplified with 64 pairs of selective primers
注 :图中框出的为差异片段。A 为引物对 :P2M1 ,P2M2 ,P2M3 和 P2M4 ;B 为引物对 :P4M1 ,P4M2 ,P4M3 和 P4M4 ;
C为引物对 :P6M5 ,P6M6 ,P6M7 和 P6M9 ; (泳道从左到右 ,分别为材料 A ,B ,C和 D ,每四个泳道为一对引物对 ,第一泳道为 marker2DL2000。)
Notes :The panes in the figure are polymorphic bands. A are amplify with selective primer P2M1 ,P2M2 ,P2M3 and P2M4 respectively ; B are amplify wih
selective primer P4M1 ,P4M2 ,P4M3 and P4M4 respectively ; C are amplify with selective primer P6M5 ,P6M6 ,P6M7 and P6M9 respectively ;
(the first lane is marker D12000 ,from left to right of the lanes are A ,B ,C and D and the same selectiv primer in per four lanes.
212 　变异株系与对照的 AFLP 图谱相似性分析
如表 3 所示 ,水稻变异株系 C、D 和阴性对照B (豫
粳 6 号) 相比 ,相似性分别达到 84 %和 77131 % ,其中
变异株系 0724212124212329 (D) 较 072421212324323 (C) 变
异大。变异株系 C、D 与阳性对照 A (郑单 14) 相比 ,相
似性分别达 36113 %和 32157 % ,对照水稻豫粳 6 号和玉
米之间的相似性为 28186 %。可以看出 ,离子束介导的
转基因玉米稻和玉米之间的相似性明显增大 ,说明可能
是由外源的玉米 DNA 整合进入水稻核基因组引起的。
213 　变异株系与对照的 AFLP 图谱差异性分析
由表 2、表 4 和图 1 可以看出 ,变异株 07242121232
4323 (C)共 25 个引物对没有扩增出差异的条带 ,变异
株系 0724212124212329 (D)共 20 个引物对中没扩增出差
异带 ,其他引物对在两变异株系中均扩增出了差异条
带。变异株系 C总共出现 66 条差异带 ,与对照的差异
比例为 5181 % ,其中新带 23 条 ,缺失带 16 条 , 目的带 表 3 　变异株系与对照( A、B) DNA 的 AFLP图谱相似性Table 3 　The similarity of AFLP patterns of mutant lines ,positive control and negative controlvariety(line) A B C DTo 1079 1187 1135 1144Tb 971 901Sb % 84100 77131Ta 327 400 362Sa % 28186 36113 32157注 :A :阳性对照2郑单 14 ;B :阴性对照2豫粳 6 号 ;C :变异株系 072421212324323 ;D :变异株系 0724212124212329 ; To :64 对 AFLP 扩增条带总数 ; Tb :与豫粳 6 号 (B)相同的条带总数 ;Sb % :与豫 6 (B)的相似率 ;Ta :与玉米 (A)相同的条带总数 ;Sa % :与玉米 (A)的相似率。Notes :A is positive control Zhendan 14 ; B is negative control Yujing 6 ; C ismutant line of 07242121232423 ;D is mutant line of 07242121242329 ; To is the totalnumber of amplified bands ; Tb is the total number of bands shared with negativecontrol (B) ;Sb % is the ratio of similarity with negative control ; Ta is the totalnumber of bands shared with positive control (A) ; Sa % is the ratio of similaritywith positive control (A) .
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27 条 (目的带为阴性对照豫粳 6 号中没有 , 但变异株
系和阳性对照玉米均出现的带) 。变异株系 D 出现 89
条差异带 ,与对照的差异比例为 7178 % ,其中新带 49
条 ,缺失带 16 条 ,目的带 24 条。在变异株系 C和 D 中
能扩增出新带、缺失带和目的带等差异条带的选扩引
物对以及扩增出无差异条带的选扩引物对如表 5 所
示。实验结果中扩增出的目的条带 ,是供体玉米和变
异株系共有的带 ,而阴性对照豫粳未检测到 ,说明变异
株系中可能整合有玉米 DNA。
表 4 　变异株系中各类扩增带的数目
Table 4 　The numbers of various amplified bands is line C and D.
株系
variety
lines
扩增带总数
total number of
amplified bands
与阴性对照豫粳 6 相同的带
bands shared with
negative control Yujing26 新带novelbands 缺失带missingbands 目的带targetbands 差异带总数total number ofpolymorphic bands 差异带比例the ration ofpolymorphic bands( %)
C 1135 971 23 16 27 66 5181
D 1144 900 49 16 24 89 7178
注 :新带2变异株系中有 ,但阳性对照 A(郑单 14)和阴性对照 B(豫 6)中均没有的带 ;缺失带2和阴性对照 B 相比 ,变异株系中缺少的带 ;目的带2阴性对
照 B 中没有 ,但变异株系和阳性对照 A 均出现的带。
Notes :novel bands which are detect in the mutant lines but not in positive control (A) and negative control (B) ; missing bands which are detect in the negative control
but missing in mutant lines ; Target bands which are detect both in mutant lines and positive control but not in negative control .
214 　引物对的筛选
通过 64 对选择引物对离子束介导玉米基因组大
片段 DNA 的水稻变异材料进行 AFLP 比较分析 ,本研
究优选出下列 18 对引物 : P1M3、P2M3、P2M5、P2M7、
P2M8、P3M7、P4M3、P4M4、P5M3、P6M1、P6M2、P6M5、
P6M7、P8M2、P8M3、P8M5、P8M6 和 P8M8。它们能够满足
以下 4 点 : (1)扩增出的条带尽量要多 ; (2) 扩增出的差
异带尽量多 ; (3)最好在变异株系间都能扩增出差异条
带 ; (4)最好能扩增出目的带。这些优选出的选扩引物
对在对其他变异株系进行研究时具有重要的参考价值。
表 5 　变异株系 C和 D 中扩增出各类差异带的引物对
Table 5 　Selective primers that amplified kinds of polymorphic bands in lines C and D
变异株系 C lines C 变异株系 D lines D
无差异条带的引物对
selective primers that amplified
none polymorphic bands
P1M5、P1M7、P1M8、P2M6、P3M5、P4M2、P4M7、P4M8、
P5M1、P5M2、P5M4、P5M5、P5M6、P5M7、P6M4、P6M6、
P6M8、P7M1、P7M3、P7M4、P7M5、P7M7、P7M8、P8M1、P8M4
P1M2、P1M5、P2M1、P3M5、P4M2、P4M8、P5M1、P5M2、
P5M5、P5M6、P5M7、P5M8、P6M4、P7M1、P7M4、P7M5、
P7M7、P7M8、P8M1
出现新带的引物对
selective primers that amplified
novel bands
P1M3、P2M1、P2M2、P2M3、P2M4、P3M2、P3M3、P3M6、
P4M6、P6M3、P7M2、P7M6、P8M2、P8M5、P8M7
P1M1、P1M3、P1M4、P1M6、P1M7、P1M8、P2M2、P2M4、
P2M5、P2M6、P3M2、P3M6、P3M7、P3M8、P4M5、P4M6、
P5M4、P6M2、P6M3、P6M5、P6M6、P6M8、P7M2、P7M3、
P7M6、P8M2、P8M4、P8M5、P8M7、P8M8
出现缺失带的引物对
selective primers that amplified
missing bands
P1M1、P1M2、P1M3、P1M4、P3M1、P3M2、P3M4、P3M8、
P4M1、P4M5
P1M3、P1M8、P2M6、P3M1、P3M2、P3M3、P3M8、P4M1、
P4M5、P8M3、P8M4、P8M7、P8M8
出现目的带的引物对
selective primers that amplified
target bands
P1M3、P1M6、P2M3、P2M5、P2M7、P2M8、P3M7、P4M3、
P4M4、P5M3、P5M8、P6M1、P6M2、P6M5、P6M7、P8M2、
P8M3、P8M5、P8M6、P8M8
P1M3、P1M4、P2M3、P2M5、P2M6、P2M7、P2M8、P3M7、
P4M3、P4M4、P5M3、P6M1、P6M2、P6M5、P6M7、P8M3、
P8M5、P8M6、P8M8
3 　讨论
应用分子标记对植物总 DNA 转化受体进行检测
和分析的研究以前有过报道[18～20 ] 。卞坡[21 ] 对离子束
介导甘蓝全 DNA 转化拟南芥的转化 2 代进行 RAPD
研究表明 ,转化株的 RAPD 结果与对照相比有明显差
异 ,差异条带序列位于 ABC Transporter 结构基因内部。
王秀玲[22 ]等对离子束转大豆 DNA 到小麦的转化 2 代
进行了 RAPD 研究 ,扩增出与供体相同的条带。李
红[14 ]应用 RAPD 方法对离子束介导的“玉米稻”进行遗
传分析 ,结果表明“玉米稻”中出现了受体中没有而供
体中存在的目的条带。焦浈[15 ] 等在离子束介导大豆
DNA 转化小麦后代高蛋白株的 RAPD 标记分析中也出
现了目的带。押辉远[23 ] 等在离子束转大豆的小麦变
异株中发现 ,变异株产生的部分原因是由于转座子的
跳跃造成。本文通过 64 对引物对离子束介导玉米
DNA 获得的 2 个已经稳定遗传的具有玉米某些特征
102　2 期 离子束介导玉米 DNA 的水稻变异后代 AFLP 分析
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的变异株系进行 AFLP 分析 ,结果在很多引物对中检
测到了供体玉米中的目的带 ,另外在 2 个变异株系中
还分别检测到了一些新带和缺失带 ,这些差异带的出
现 ,说明部分玉米 DNA 与水稻基因组的序列可能发生
了配对和交换 ,从而整合到水稻基因组上导致了变异
的发生 ,在受体细胞基因组自身的遗传稳定性和自我
保护之下 ,大部分的外源 DNA 被受体的保护系统排斥
和降解 ,可能有些小的 DNA 片段通过同源重组或转座
子的跳跃造成核苷酸或 DNA 片段的插入、缺失或替换 ,
从而改变了基因的排列、基因表达的开关及强弱 ,导致
在 AFLP 分析中出现了新带、缺失带、目的带。从变异株
系 C和D 的遗传性状看 ,在绝大部分遗传特性保持不变
的情况下 ,转化后代表现出了供体的某些特征。为进一
步了解变异株系产生的原因 ,我们在后续的试验中会对
这些差异条带 ,尤其是目的条带进行回收、测序、比对和
分析 ,进一步验证该差异带是否来自玉米供体。另外结
合相应的性状分析得到的差异片段 ,很可能发掘出跟该
性状相关的基因或新的功能基因。
本研究对 64 对引物的 AFLP 统计分析发现 ,扩增
的总带数在 1079～1187 之间 ,平均 1136 条 ,平均每对
引物扩增出 18 条带 ,变异株系 C和D 与阴性对照豫粳
6 号的差异带数分别为 66 和 89 条 ,平均每对引物分别
达 1103 和 1139 条。这比李红、焦浈等人的 RAPD 分析
得到的总带数 200～300 ,平均每对引物扩增 7 条 ,差异
带数 20～40 条 ,平均每对引物 0156～1111 条的多态性
要好 ,进一步表明 AFLP 具有多态性好的优点。在分
析图谱相似率时还发现 ,虽然对照水稻和玉米分属于
不同的属 ,但二者的图谱仍有 28186 %相似率 ,2 个变
异株系和玉米的图谱相似率却分别达到了 36113 %和
32157 % ,关于水稻和玉米间基因组的相似率 ,有待经
序列分析后进一步报道。这表明离子束介导的转玉米
基因的变异株系和玉米之间的相似性明显增大 ,其原
因可能是外源的玉米 DNA 整合到水稻核基因组引起
的 ,但须进一步研究证实。
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