全 文 ：　文章编号 :100028551 (2002) 0620355205
利用油菜单倍体茎尖筛选抗菌核病变异体
王亦菲1 　黄剑华1 3 　陆瑞菊1 　孙月芳1 　周润梅1
周志疆2 　谢祝捷2 　刘成洪3
(11 上海市农业遗传育种重点实验室 ;上海市农业科学院生物技术研究中心 ;
21 上海市农业科学院园艺研究所　201106 ; 31 上海师范大学生命与环境科学学院　200234)
摘 　要 :用平阳霉素 (Pingyangmycin) 对甘蓝型油菜品系 9885 和 9841 的单倍体茎尖进
行诱变处理 ,以草酸作为选择压力 ,获得一批耐草酸性明显比原始品种提高的变异
体。经大田抗菌核病性鉴定 ,筛选出 3 份抗病性比耐病品种显著提高的种质材料。
关键词 :平阳霉素 ;油菜 ;单倍体组织 ;草酸 ;变异体
收稿日期 :2001211230
基金项目 :本研究是上海市科技兴农攻关项目 (农科攻字 (98)第 01～13 号)
作者简介 :王亦菲 (1968～) ,女 ,上海人 ,上海农业科学院助理研究员 ,从事生物技术研究
油菜菌核病是由核盘菌 ( Sclerotinia sclerotiorum Lib de Bary) 引起的 ,该菌为害 75 科 408 种
植物 ,油菜菌核病是其所致主要病害之一[1 ] 。现有油菜品种间的抗菌核病性无明显差异 ,尚未
找到理想的抗病材料[2 ] 。随着双低油菜育种力度的不断加大 ,菌核病的发生和危害也更加严
重 ,主要是双低油菜芥酸和硫甙含量低 ,致使其对病原菌更为敏感。因此 ,寻找抗菌核病新种
质已成为油菜优质育种中亟待解决的重要问题。
平阳霉素是一种新型的诱变剂 ,已在多种植物上证明了其诱变效果。本文报道由平阳霉
素对甘蓝型油菜的单倍体组织进行诱变处理 ,以草酸作为筛选压力 ,获得抗菌核病变异体的有
关研究结果[3～8 ] 。
1 　材料和方法
111 　材料
选用甘蓝型油菜品系 9885 和 9841 的单倍体试管苗茎尖。该试管苗群体来源于游离小孢
子培养中获得的单倍体再生植株 (图版 Ⅰ、图版 Ⅱ) 。取 9885 的单倍体再生植株快繁成群体 ,
用于变异体诱导及筛选条件的确定试验。
112 　方法
将油菜茎尖浸泡在浓度为 80、120 和 160mgΠL 的平阳霉素溶液中 ,分别处理 2、4、8、12h ,用
无菌水冲洗 3 次 ,吸去多余水分后接种于空白的 MS 培养基上统计存活率 ,得出半致死剂量 ,
确定最佳的诱变处理。用平阳霉素诱变后存活的茎尖 ,以单倍体油菜的茎尖作为对照 ,浸泡于
110、310、510、710、1010mM 的草酸溶液中 ,分别处理 30、45min ,用无菌水冲洗 3 次 ,吸去多余水
分后接种于快繁培养基 ,统计存活率。确定最佳筛选条件。培养基为 :MS + 62BA 015mgΠL + KT
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1mgΠL + 蔗糖 30gΠL + 琼脂粉 515gΠL。存活的变异体经染色体加倍后[9 ] ,无性繁殖成株系 ,生根
后移栽至大田 ,进行菌核病抗性的田间鉴定。菌核病抗性的田间鉴定参考周必文等方法[10 ] 进
行。移栽后按 1 粒Πm2 的菌核密度接种于田间距土表 115～2cm 内。调查样本数为 20 株 ,依据
病害调查分级标准 ,调查分析每个油菜抗菌核病新种质的病情指数和发病率。
图版 Ⅰ　单倍体植株根尖染色体 ( n = 9)
Plate Ⅰ　Root tip chromosome in
haplod ( n = 9)
图版 Ⅱ　小孢子来源的单倍体植株
Plate Ⅱ　Haploid plants derived from
microspores culture
2 　结果
211 　诱变及筛选条件的确定
21111 　平阳霉素诱变剂使用浓度及处理时间 　从表 1 可看出 ,平阳霉素对油菜茎尖的损伤较
大 ,油菜茎尖的存活率随平阳霉素处理浓度和时间的增加而下降 ,在 80mgΠL、2h 的处理中 ,茎
尖存活率超过了 98 % ;而在 160mgΠL、12h 处理时 ,存活率下降至 616 % ;茎尖在 120mgΠL 的溶液
中浸泡 4h ,其存活率为 4813 % ,已超过半致死量。在以后的处理中以这个剂量作为油菜变异
体诱导的适宜剂量。
表 1 　平阳霉素处理浓度及时间对油菜茎尖存活率的影响
Tabel 1 　Effect of Pingyangmycin concentration and treating time on
survival percentage of the haploid stem apexes
处理时间
treating time (h)
80mgΠL 120mgΠL 160mgΠL
接种数
No. of
explants
存活数
No. of
surviving
explants
存活率
surviving
rate ( %)
接种数
No. of
explants
存活数
No. of
surviving
explants
存活率
surviving
rate ( %)
接种数
No. of
explants
存活数
No. of
surviving
explants
存活率
surviving
rate ( %)
2 60 59 9813 59 47 7917 59 43 7219
4 60 41 6813 60 29 4813 60 26 4313
8 58 31 5314 62 24 3817 60 20 3313
12 55 24 4316 62 20 3213 61 4 616
21112 　草酸筛选剂使用浓度及处理时间 　将平阳霉素 120mgΠL、4h 处理后存活的单倍体茎尖
及对照用不同浓度的草酸溶液、经不同时间处理后 ,茎尖存活率随草酸浓度增加、处理时间延
长而降低 ,经平阳霉素处理的茎尖与未经处理的对照相比 ,在同一草酸浓度及处理时间上 ,其
·653· 核　农　学　报 16 卷
存活率均比对照高。从表 2 可看出 ,当草酸浓度为 710mM、处理时间为 45min 时或草酸浓度为
1010mM、处理时间为 30min 时 ,茎尖全部死亡 ;当草酸浓度为 510mM、处理时间为 30min 时 ,没
有经过平阳霉素处理的对照已全部死亡 ,而经平阳霉素 120mgΠL、4h 处理过的茎尖还有 1114 %
的存活率。因此本研究以 510mM、30min 作为适宜的草酸筛选剂量。
表 2 　草酸处理浓度及时间对油菜茎尖存活率的影响
Tabel 2 　Effect of oxalic acid concentration and treating time on
survival percentage of the haploid stem apexes
处理时间 (30min)
treating time 30min
草酸浓度
oxalic acid concentration (mM)
处理时间 (45min)
treating time 45min
草酸浓度
oxalic acid concentration (mM)
110 310 510 710 1010 110 310 510 710 1010
对照
CK
接种数
No. of explants
50 52 49 42 43 50 52 43 41 43
存活数
No. of surviving explants
36 16 0 0 0 24 7 0 0 0
存活率
surviving rate ( %) 7210 3018 0 0 0 4810 1315 0 0 0
处理
treatments
接种数
No. of explants
51 58 35 31 20 49 52 40 38 20
存活数
No. of surviving explants
42 28 4 1 0 32 19 2 0 0
存活率
surviving rate ( %) 8213 5511 1114 312 0 6513 3615 510 0 0
　　注 :对照为未经平阳霉素处理的油菜单倍体茎尖 ;处理为经平阳霉素半致死剂量处理后存活的油菜单倍体茎尖。
　　Note :CK are the haploid stem apexes without Pingyangmycin treatment ; Treatments are the haploid stem apexes treated with Pingyang2
mycin before oxalic acid treatment .
212 　耐草酸变异体的诱导及筛选
以双低油菜品系 9885 和 9841 的单倍体茎尖为材料 ,以平阳霉素 120mgΠL、4h 处理作为诱
变剂处理茎尖 ,存活的茎尖用草酸 510mM、30min 筛选 ,结果见表 3。品系 9841 和 9885 单倍体
茎尖经平阳霉素诱变和草酸筛选后 ,存活的株数分别为 16 和 7 ,分别有 7 株和 5 株加倍成功 ,
快繁后各有 5 个株系用于菌核病抗性田间鉴定 (图版 Ⅲ、图版 Ⅳ) 。
表 3 　耐草酸变异体的诱变剂筛选
Tabel 3 　Induction and selection of variants with higher tolerance to oxalic acid
材料
materials
诱变处理的茎尖数
No. of stem apexes for
Pingyangmycin
treatment
筛选的茎尖数
No. of stem apexes
for oxalic acid
selection
存活的茎尖数
No. of
survival
stem apexes
加倍成功的株数
No. of plants
chromosome
doubled
用于菌核病抗性鉴定
的株系数
No. of strains for testing
Sclerotinia sclerotiorum
9841 378 151 16 7 5
9885 90 46 7 5 5
·753·　6 期 利用油菜单倍体茎尖筛选抗菌核病变异体
图版 Ⅲ　耐草酸变异体
Plate Ⅲ　Variants resistant to oxalic acid
图版 Ⅳ　抗菌核病株系套袋自交
Plate Ⅳ　Self2fertilization of lines resistant to
Sclerotinia sclerotiorum
表 4 　耐草酸变异体菌核病抗性的田间鉴定
Tabel 4 　Field identification of resistance to Sclerotinia sclerotiorum for
variants with tolerance to oxalic acid
株系
strains
984121 984122 984123 984124 984125 988521 988522 988523 988524 988525 沪油 12
Huyou 12
沪油 14
Huyou 14
发病率
disease
rate ( %)
1617 2010 2010 1610 3118 1617 2318 1910 3418 3110 3018 1919
病情指数
disease
index
412 1113 1410 610 1710 1014 1119 1515 3014 3514 2310 1015
低芥酸、低硫甙品种或品系
　
　　　小孢子培养
再生植株
　
　　　染色体倍性鉴定
单倍体植株
茎尖
　
　　　平阳霉素 120mgΠL、4h 处理
存活茎尖
　
　　　草酸 510mM、30min 筛选
存活茎尖
　
　　　培养
单倍体植株
　
　　　染色体加倍
二倍体植株
　
　　　快繁、生根
大田植株
　
　　　菌核病抗性鉴定
抗菌核病新种质
213 　耐草酸变异体的大田抗性鉴定
从表 4 可以看出 ,对照沪油 12 和沪油 14 的发
病率分别达 3018 %和 1919 % ,病情指数为 2310 和
1015 ;而耐草酸变异体中除 988524、988525 发病率和
病情指数高于对照外 ,其余均介于两对照间 ,98412
1、984124、988521 这 3 个株系的发病率和病情指数低
于两个对照 ,其中 984121 和 984124 的发病率和病情
指数只有 1617 %、1610 %和 412、610 ,大大低于对照 ,
为抗耐菌核病株系 (图版 Ⅳ) 。
214 　抗菌核病种质创新的技术程序 (见右图)
3 　讨 　论
利用细胞变异手段已育成一批有影响的作物新
品种[1 ] 。Sacristan 用化学诱变剂处理单倍体油菜的
离体细胞 ,筛选出抗黑胫病的再生植株[12 ] 。吴力游
等用草酸毒素作筛选及处理油菜愈伤组织 ,得到 5
·853· 核　农　学　报 16 卷
株成活再生植株 ,经抗性测定均不同程度地提高了对菌核病的抗性[13 ] 。本研究建立了利用油
菜单倍体茎尖经平阳霉素诱变、以草酸作为筛选剂 ,诱导筛选抗耐菌核病材料的新途径。结果
表明 :单倍体变异体经染色体加倍、诱导生根后 ,有很高的田间成活率且长势良好 ,这为创造抗
菌核病新种质打下了基础。田间菌核病抗性鉴定结果表明 ,通过这项技术程序筛选出的变异
体 ,菌核病的发病率和病情指数较低 ,其中一些材料相对对照达中抗水平。由于单倍体细胞的
易变性和染色体加倍后变异性状的遗传稳定性 ,通过进一步的工作将能创造出高抗菌核病的
种质材料。
参考文献 :
[ 1 ] 　Boland GJ ,Index of plant hosts of Sclerotinia Sclerotiorum . Canad J Plant Pathol . ,1994 ,16 :93～108
[ 2 ] 　刘勇 ,刘红雨 ,曾正宜. 利用小孢子培养技术筛选油菜抗菌核病材料. 西南农业学报 ,1997 ,10 :108～112
[ 3 ] 　Maxwell D P ,Lumsden R D ,Oxalic acid production by Sclerotinia Sclerotiorum in infected bean and in culture. Phytopathol . ,1970 ,
60 :1395～1398
[ 4 ] 　刘胜毅 ,周必文 ,于琦 ,等. 影响核盘菌生长和产草酸的营养和环境因素. 微生物学通报 ,1993 ,20 (4) :196～199
[ 5 ] 　刘胜毅 ,周必文 ,等. 草酸的毒性和油菜对草酸的抗性研究. 见刘仪、唐文华主编 ,植物病理学研究进展 ,北京 :中国农
业科技出版社 ,1995 :231～235
[ 6 ] 　朴铁夫 ,原亚萍 ,李国全 ,等. 平阳霉素 (Pingyangmycin)对小麦诱变效应的研究. 核农学报 ,1998 ,12 (3) :139～145
[ 7 ] 　夏英武 ,吴关庭 ,舒庆尧 ,等. 平阳霉素对水稻诱变效应的研究. 核农学报 ,1997 ,11 (1) :26～30
[ 8 ] 　谷爱秋 ,艾先元 ,耿玉轩 ,等. 平阳霉素诱发蚕豆染色体畸变. 科学通报 ,1981 ,26 (15) :941～943
[ 9 ] 　Mathias R , RÊbbelen G. Effective diploidization of microspore2derived haploids of rap ( Brassica napus L. ) by in vitro colchichine
treatment . Plant Breeding ,1991 ,106 :82～84
[10 ] 　周必文 ,陈道炎 ,于琦 ,等. 油菜多抗材料的鉴定和筛选研究. 中国油料 ,1993 ,1 :14～17
[11 ] 　Mohan Jain S ,Tissue culture derived variation in crop improvement . Euphytica ,2001 ,118 :153～166
[12 ] 　Sacristan M D. Resistance responses to phoma Lingam of plant regenerated from selected cell and embryogenic cultures of haploid
Brassica napus ,Theor Appl Genet ,1982 ,61 :193～200
IN VITRO SELECTION OF RAPE VARIANTS RESISTANT TO OXALIC
ACID USING HAPLOID STEM APEXES 3
WANG Yi2fei1 　HUANGJian2hua1 　LU Rui2ju 　SUN Yue2fang1 　ZHOU Run2mei1
ZHOU Zhi2jiang2 　XIE Zhu2jie2 　LIU Cheng2hong3
(1. Shanghai Key Lab. of Agricultural Genetics and Breeding ; Agro2Biotech Research Center ,
Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106 ;
2. Horticulture Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106 ;
3. Life and Environment Science College , Shanghai Teachers University , Shanghai 　200234)
ABSTRACT :Mutagenic treatment was made of the haploid stem apexes rape strain‘9841’and
‘9885’with Pingyangmycin. As a result of positive selection with oxalic acid providing selection
pressure , variants with signif icantly higher tolerance to oxalic acid than the original ones were ob2
tained. 3 germplasm with signif icantly higher resistance to Sclerotinia sclerotiorum than cultivar
Hu You 12 were selected from field test.
Key words :Pingyangmycin; rape ; haploid stem apexes; oxalic acid ; variants
·953·Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (6) :355～359