全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):548 ～ 554
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2009-12-21 接受日期:2010-04-28
基金项目:国家自然科学基金项目(30470999)，农业部农业公益性行业科研专项经费项目“核技术农业应用”(200803034)
作者简介:董晓颖(1983-)，女，辽宁鞍山人，硕士研究生，研究方向为食品辐照。E-mail:sndxy@ 126. com
通讯作者:高美须(1965-)，女，河北藁城人，副研究员，从事食品辐照研究。E-mail:meixugao@ 21cn. com
文章编号:1000-8551(2010)03-0548-07
不同处理方法对虾过敏蛋白分子量及抗原性的影响
董晓颖1，2 高美须2 潘家荣2 张春红1 王志东2 李淑荣2
(1. 沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110161;2. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)
摘 要:本文研究不同处理方法对虾过敏蛋白分子量及抗原性的影响。利用酶解、超高压、微波 3 种方法
处理虾过敏蛋白，利用 SDS-PAGE 对虾过敏蛋白分子量大小进行测定，用 OPA 法对各种酶解条件下蛋
白质的水解度进行测定，间接竞争 ELISA 法测定各种处理后过敏蛋白抗原性的变化。结果表明蛋白酶
处理后虾过敏蛋白特征条带消失，而经超高压和微波处理的分子量大小没有变化;间接竞争 ELISA 检
测表明三种处理均会导致虾过敏蛋白致敏性不同程度降低或消失。
关键词:虾过敏原;超高压;微波;酶解;分子量;抗原性
EFFECTS OF DIFFERENT TREATMENTS ON MOLECULAR WEIGHT
AND ANTIGENICITY OF SHRIMP ALLERGENIC PROTEIN
DONG Xiao-ying1，2 GAO Mei-xu2 PAN Jia-rong2 ZHANG Chun-hong1 WANG Zhi-dong2 LI Shu-rong2
(1. Shenyang Agricultural University，Liaoning，Shenyang 110161;
2. Institute of Agro-food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193)
Abstract:The effects of different treatments on molecular weight and antigenicity of shrimp allergy protein were studied.
Enzymolysis，ultra-high pressure and microwave treatments were used to process the shrimp allergenic protein. Molecular
weight，hydrolysis degree and the change of allergenic protein antigenicity were investigated by SDS-PAGE，OPA
method and indirect competitive ELISA，respectively. The results showed that molecular weight does not change after
ultra-high pressure and microwave treatment，but shrimp allergy protein band disappeared after protease treatment. The
indirect competitive ELISA analysis showed that the antigenicity of protein decreased or disappeared after the all three
treatments.
Key words:shrimp allergenic protein; ultra-high pressure; microwave; enzyme hydrolysis; molecular weight;
antigenicity
近年来食品安全问题受到越来越多人的重视，食
物过敏这一食源性疾病已引起广大消费者、生产者和
研究者的关注。澳洲每年有 600 例过敏性病症发生，
在 2004 年食品企业召回产品中，过敏食品比例就达
47%。据不完全统计，我国食品过敏的发病率高于发
达国家［1，2］。
虾蟹等甲壳类动物及其制品是联合国粮农组织提
出的 8 大类过敏食物中的重要一类［3 ～ 5］，近年来我国
有关食源性虾过敏的报道屡见不鲜［6，7］，因此虾类过
敏原的研究引起了人们的重视。加热等常规方法难以
使食物中过敏原的致敏性降低。顾可飞等对虾过敏蛋
白进行辐照处理，发现辐照后虾过敏蛋白的结构、浊度
和疏水性都发生了改变［8］，并分析了不同存在状态下
过敏原辐照免疫学效应，发现辐照可有效降低虾过敏
原的致敏性［9］。张明琦等对蟹过敏蛋白进行辐照处
845
3 期 不同处理方法对虾过敏蛋白分子量及抗原性的影响
理，发现辐照可使蟹过敏蛋白的空间结构发生改变，致
敏性降低［10，11］，说明辐照可以破坏过敏原结构，导致
致敏性降低。酶解可使蛋白质的肽链发生断裂，生成
分子量更小的多肽或氨基酸;超高压和微波能影响生
物大分子的结构，改变分子间和分子内的非共价作用
力，因此这些方法也有可能降低食物的过敏性。本试
验用酶解、超高压和微波 3 种方法对纯化后的虾过敏
蛋白进行处理，对其分子量及抗原性进行研究，以期为
脱敏食品的研究和应用提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
冷冻的四道口海白虾购于北京美廉美超市。
制备多克隆抗体所用的新西兰大白兔购于中国科
学院遗传研究所实验动物研究室。丙烯酰胺(Acr)、
甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠(SDS)、β-巯
基乙醇、N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸
(Gly)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)、吐温 － 20、辣根过
氧化物酶标记的羊抗兔 IgG、弗氏完全和不完全佐剂、
8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)均购自 Sigma 公司。96 孔
酶标板购自 Costar 公司，预染的蛋白 Marker(6 ～
175kDa)购自 NEW ENGLAND Biolabs Inc，SephadexTM
G-100 购自 Solarbio 公司，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风
味蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶均购于诺维信公司，
其他试剂均为国产分析纯。
试验所用仪器包括 DYY-6C 型电泳仪(北京六一
仪器厂)、Genesis25XL 冷冻干燥机(美国 Virtis 公司)、
TGL-16A 高速冷冻离心机(长沙平凡仪器厂)、荣华 S-
1 电炉(江苏荣华仪器厂)、78 － 1 磁力搅拌器(国华仪
器公司)、TS-110X 水浴恒温摇床(上海天呈仪器厂)、
Hpp-M1 型超高压处理设备(天津华泰森淼生物工程
技术有限公司)、NN-K5840SF 微波炉(常州荣冠试验
分析仪器厂)、粗脂肪测定仪(Foss 公司)、高速万能粉
碎机(天津泰斯特仪器有限公司)、MK3 酶标仪
(Thermo Multiskan)。
1. 2 虾过敏蛋白的提取与纯化
虾过 敏 蛋 白 的 提 取 和 纯 化 参 考 Myung-Woo
Byun［12］等的方法，略做修改，具体如下:冷冻虾解冻
后，煮沸 10min，去虾壳及背部黑静脉，磨碎后用石油
醚在粗脂肪测定仪中脱脂处理。脱脂后按 1 g 脱脂虾
肉加入 8ml 缓冲液的比例添加浓度为 0. 01mol /L 的磷
酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)，4℃提取 2 d，每天搅拌 2h，
10000r /min 离心 15min，取上清液用 30% 硫酸铵盐析
沉淀，相同条件下再次离心，将沉淀置于 0. 01mol /L
PBS(pH 7. 4)中透析 3 次，每次 6h。对透析后的蛋白
进行电泳检测［13］，冷冻干燥后 － 20℃保存备用。
1. 3 蛋白酶处理虾过敏蛋白
1. 3. 1 蛋白酶的优选 如表 1 所示，初选 5 种蛋白酶
用于本试验。首先测定各种酶的酶活性。在相同酶活
力条件下根据蛋白酶对过敏蛋白的水解能力进行选
择，过程如下:取一定量上述纯化冻干的虾过敏蛋白，
用 0. 01mol /L PBS(pH 7. 4)缓冲液溶解至浓度为
10mg /ml，然后按酶活性与底物的比为 3000 U / g 的比
例加入相应的酶，在最适反应条件下(表 1)进行水解。
样品在水域摇床中水解 4h 后，100℃沸水浴 15min 使
酶失活，测定蛋白质分子量和水解度。
表 1 5 种蛋白酶的最适反应条件
Table 1 The optimal reaction conditions of five proteases
蛋白酶 protease pH 温度 temperature(℃)
碱性蛋白酶 alcalase 8 55
中性蛋白酶 neutrase 7 55
木瓜蛋白酶 papain 7 55
风味蛋白酶 flavourzyme 7 50
胃蛋白酶 pepsin 2 37
1. 3. 2 蛋白酶反应条件的优化 对优选出的蛋白酶
进行酶解条件优化，即在底物浓度为 10mg /ml 的条件
下，对加酶量(3000、2000、1000、500 和 200U / g)、pH
(6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5 和 9. 0)、温度(35℃、
45℃、50℃、55℃、60℃、65℃ 和 75℃)及酶解时间
(0. 5、1、2、3、4、5 和 6h)4 个条件逐一进行优化，过程
同 1. 3. 1。
1. 3. 3 测定方法 蛋白酶活性的测定采用福林酚
法［14］。蛋白质分子量大小的测定采用 SDS-PAGE 法，
步骤见 1. 6。水解度(DH)的测定采用 OPA 法［15，16］。
1. 4 超高压处理虾过敏蛋白
将纯化冻干的虾过敏蛋白溶于 0. 01mol /L PBS
(pH 7. 4)中，浓度为 2mg /ml，装在超高压袋(聚乙烯)
中，排气泡后封口，在室温下进行超高压处理，分别设
定压强为 100、200、300、400 和 500MPa，每处理作用
45min，重复 2 次。超高压处理后样品立即置于 － 20℃
冰箱中保存。
1. 5 微波处理虾过敏蛋白
将纯化冻干的虾过敏蛋白溶于 0. 01mol /L PBS
(pH 7. 4)中，浓度为 2mg /ml，分别在 849W、35℃作用
15min，849W、50℃ 作用 15min，999W、100℃ 作用 2h，
每处理重复 2 次。处理后样品立即置于 － 20℃冰箱中
保存。
945
核 农 学 报 24 卷
1. 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
采用不连续凝胶垂直板电泳法检测［17］，分离胶浓
度为 15%，浓缩胶浓度为 5%。蛋白质样品与样品缓
冲液 1∶ 1混合后，煮沸，加样量为 15μl，电泳完毕，考马
斯亮兰 R-250 染色，凝胶成相系统照相。
1. 7 处理后的过敏蛋白免疫学效应
1. 7. 1 多克隆抗体的制备［18］ 将 0. 5mg /ml 纯化后
的虾过敏蛋白与弗氏完全佐剂混合，皮下多点注射于
2 只雄性新西兰大白兔中，每只 1ml，2 周后加强免疫，
浓度为 2mg /ml，佐剂为弗氏不完全佐剂，每隔 1 周加
强免疫 1 次，用间接 ELISA 法测兔血清效价，达到要
求后，抗原液耳静脉冲击免疫 1 次，1 周后心脏采血，
取血清于 － 20℃下保存备用。
1. 7. 2 间接竞争 ELISA(Ci-ELISA)法测定虾过敏蛋
白抑制率 (1)用未处理的虾过敏蛋白做抗原，包被
液稀释浓度为 10μg /ml，每孔 100μl，4℃ 包被过夜;
(2)次日取出，PBST 洗涤 3 次，每次 5min;(3)每孔加
入 5%脱脂奶粉 100μl，37℃封闭 2h;(4)同(2);(5)
每孔加入 50μl 稀释 50 倍的处理后的虾过敏蛋白和
50μl 用洗涤液稀释一定倍数的兔多克隆抗体，不加抗
原或样品的反应孔为无竞争反应体系，37℃孵育 1h;
(6)同(2);(7)每孔加入 100μl 用洗涤液稀释的酶标
二抗(羊抗兔 IgG- HRP，稀释倍数 1 ∶ 800)，37℃孵育
1h;(8)同(2);(9)每孔加入 100μl 新鲜配制的底物缓
冲液，37℃孵育 15min;(10)每孔加入 2mol /L H2 SO4
50 μl，终止反应，然后于酶标仪 450nm 处测定 OD 值，
绘制曲线。过敏蛋白抑制率的计算公式为:
抑制率 =(1 － B /B0)× 100%
=(OD空白对照 － OD待测样品)/ OD空白对照 × 100%
2 结果与分析
2. 1 酶解对虾过敏蛋白的影响
2. 1. 1 5 种蛋白酶对虾过敏蛋白酶解效果比较 由
图 1 可知，5 种蛋白酶均可将分子量为 36kD 的虾过敏
蛋白全部水解。其中，水解效果最好的是碱性蛋白酶
和木瓜蛋白酶，除虾过敏蛋白外，其他蛋白质也几乎全
部被水解掉，说明这 2 种蛋白酶能使过敏蛋白的肽链
发生断裂，生成分子量更小的多肽或氨基酸，可能对虾
过敏蛋白的致敏性产生影响;风味蛋白酶和中性蛋白
酶酶解效果次之，胃蛋白酶的水解效果最差，经这 3 种
蛋白酶处理后，虾过敏蛋白降解生成分子量更小的蛋
白质或多肽。5 种蛋白酶对虾过敏蛋白的水解效果不
同，这可能是由于酶的专一性不同，对虾过敏蛋白的水
解能力不同所致。
图 2 证明了在相同的酶活力作用下，碱性蛋白酶
的水解度最大。其次是木瓜蛋白酶，风味蛋白酶和中
性蛋白酶，胃蛋白酶的水解度最低。
图 1 5 种蛋白酶水解效果电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of five kinds of
protease hydrolysis results
1:风味蛋白酶;2:碱性蛋白酶;3:木瓜蛋白酶;
4:胃蛋白酶;5:中性蛋白酶
1:flavourzyme;2:alcalase;3:papain;4:pepsin;5:neutrase
箭头所示为过敏蛋白，下图同。Shrimp allergenic protein
was marked by the arrow，the same as following figures.
图 2 5 种蛋白酶水解度
Fig. 2 Hydrolysis results of five kinds of proteases
综上所述，碱性蛋白酶对虾过敏蛋白水解效果最
好，蛋白质分解最彻底，水解度最大，且由酶活力测定
结果可知，碱性蛋白酶酶活力最大，在相同酶活力作用
下用酶量最少，因此选择碱性蛋白酶进行后续试验。
2. 1. 2 碱性蛋白酶作用条件的优化
2. 1. 2. 1 电泳法 碱性蛋白酶水解条件优化结果见
图 3。当加酶量为 3000、2000 和 1000U / g 时，经过 4h
持续水解，电泳谱带中主要致敏蛋白已消失，说明过敏
蛋白质水解的比较彻底，当加酶量为 500 和 200U / g
时，虾过敏蛋白水解不完全(图 3 － A)。从降低试验
成本的角度考虑，确定适宜的加酶量为 1000 U / g。当
pH 值为 6. 0 和 6. 5 时，过敏蛋白质水解不彻底，pH 在
055
3 期 不同处理方法对虾过敏蛋白分子量及抗原性的影响
7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0 的条件下，蛋白质水解效果都
很好(图 3 － B)。考虑到碱性蛋白酶最适 pH 值为
8. 0，所以本试验选取的条件为 pH 8. 0。图 3 － C 中各
电泳条带中主要致敏蛋白都已被水解掉，但样品在
60℃的酶解温度下蛋白质水解的最彻底，残存蛋白质
最少，所以确定最适酶解温度为 60℃。图 3 － D 中各
电泳条带中主要致敏蛋白都已被完全水解，但作用时
间在 0. 5、1、2 和 3h 时电泳条带中残存的蛋白质较多，
而作用时间分别为 4、5 和 6h 时电泳条带中蛋白质分
解的较彻底，最终确定最适酶解时间为 4h。
图 3 碱性蛋白酶水解条件的优化
Fig. 3 Optimization of alcalase hydrolysis conditions
A:加酶量对酶解效果的影响，1 ～ 5 表示加酶量 3000、2000、1000、500 和 200U / g;
B:pH 对酶解效果的影响，1 ～ 7 表示 pH 6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5 和 9. 0;
C:温度对酶解效果的影响，1 ～ 6 表示 35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和 75℃;
D:反应时间对酶解效果的影响，1 ～ 7 表示 0. 5、1、2、3、4、5 和 6h
A:Effect of the enzyme amount on enzymatic hydrolysis，1 ～ 5 means enzyme amounts of 3000，
2000，1000，500 and 200U / g;B:Effect of pH on enzymatic hydrolysis，1 ～ 7 means pH 6. 0，6. 5，7. 0，
7. 5，8. 0，8. 5 and 9. 0;C:Effect of temperature on enzymatic hydrolysis，1 ～ 6 means 35℃，45℃，
50℃，55℃，60℃，65℃ and 75℃;D:Effect of reaction time on enzymatic hydrolysis，1 ～ 7 means 0. 5，1，2，3，4，5 and 6h
2. 1. 2. 2 水解度法 从图 4 酶解条件对碱性蛋白酶
水解度的影响可以看出，加酶量为 3000、2000 和
1000U / g 时，蛋白质的水解度基本相同。当加酶量降
到 500 和 200U / g 时，蛋白质的水解度明显降低。当
pH 从 6. 0 增大到 7. 0 时，水解度不断增加，继续增大
pH 值到 9. 0，水解度无明显变化。当温度从 35℃增加
到 60℃时，水解度逐渐增加，在 60℃时达到最大，温度
继续增加到 75℃时，水解度随温度升高而降低。当作
用时间为 0. 5 和 1h 时，水解度相同，之后随时间的延
长，水解度逐渐增大，4h 时达到最大，之后随时间延
长，水解度变化不大。因此，确定适宜的碱性蛋白酶反
应条件为加酶量 1000U / g、pH 8. 0、60℃作用 4h。水解
度法的结果与电泳分析结果一致。
2. 2 超高压对虾过敏蛋白的影响
由图 5 可知，虾过敏蛋白经过不同压力处理后，分
子量大小没有发生变化，这说明超高压对虾过敏蛋白
分子量没有影响。这可能是由于超高压不能使虾肌纤
维中的这种原肌球蛋白的四级结构发生解聚、交联或
裂解，从而不能生成一些小颗粒的亚基单位或者分子
量更大的蛋白质。
2. 3 微波对虾过敏蛋白的影响
从图 6 可以看出，对照与微波处理后虾致敏蛋白
155
核 农 学 报 24 卷
电泳条带基本相同，说明功率为 849W，温度为 35℃和
50℃时对虾过敏蛋白分子量大小没有影响。当功率升
高到 999W、温度升高到 100℃作用 120min 时，蛋白质
溶液的颜色变成褐色，这可能是由于微波功率过高或
者辐照时间过长，引起蛋白质热变性，但该处理对虾过
敏蛋白分子量大小仍没有发生变化，说明微波对虾过
敏蛋白分子量大小无影响。
图 4 碱性蛋白酶水解条件的优化
Fig. 4 Optimization of alcalase hydrolysis conditions
A:加酶量对水解度影响;B:pH 对水解度影响;C:温度对水解度影响;D:反应时间对水解度影响
A:Effect of enzyme amount on hydrolysis degree;B:Effect of pH on hydrolysis degree;
C:Effect of temperature on hydrolysis degree;D:Effect of reaction time on hydrolysis degree
图 5 超高压对虾过敏蛋白的影响
Fig. 5 Effect of ultra-high pressure
on shrimp allergy protein
1:100MPa;2:200MPa;3:300MPa;4:400MPa;5:500MPa
2. 4 酶解、超高压和微波处理后过敏蛋白的免疫学效
应
用风味蛋白酶等 5 种酶对虾过敏蛋白进行处理，
发现风味蛋白酶和中性蛋白酶对虾过敏蛋白的降敏效
果最好，处理后的抑制率接近 0，致敏性几乎完全消
图 6 微波对虾过敏蛋白的影响
Fig. 6 Effect of microwave treatment on
shrimp allergic protein
1:849W /35℃ /15min;2:849W /50℃ /15min;
3:999W /100℃ /120min
失;碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶次之，其处理后的抑制率
分别为 4. 94%和 8. 26%，致敏性有较大程度的降低;
而胃蛋白酶虽也具有部分降敏效果，但不如前者;其中
碱性蛋白酶在优化的酶解条件下对致敏蛋白作用后，
255
3 期 不同处理方法对虾过敏蛋白分子量及抗原性的影响
抑制率为 0，致敏性完全消失(图 7 － A)。
图 7 － B 为不同压强处理后虾过敏蛋白抑制率变
化。从 100 ～ 400MPa 随着压力增大，虾过敏蛋白抑制
率降低，说明适当高压处理对虾过敏蛋白的致敏性有
降低作用，且在 400MPa 时 降 至 最 低，继 续 增 至
500MPa 时抑制率反而有所增加，这可能是由于随着压
力的增加蛋白质的结构不断发生变化，使过敏原表位
被掩盖或破坏，从而使其致敏性降低，当压力增加到
500MPa 时蛋白质的结构进一步发生变化，被掩盖的抗
原表位又表露出来，使过敏蛋白的致敏性增加。
由图 7 － C 可知，在微波频率不变的情况下，随着
温度的增加处理后过敏蛋白的抑制率有所降低，当频
率和温度继续增加时，处理后过敏蛋白的抑制率有略
微降低，这可能是微波使过敏蛋白的空间构型发生改
变，使分子间的连接方式发生改变，导致键的破坏和重
组，使过敏蛋白的致敏性有所降低。
图 7 间接竞争 ELISA 法检测酶解、超高压和微波处理后过敏蛋白的免疫学效应
Fig. 7 Indirect competitive ELISA results of immunological effects of enzymolysis，
ultra-high pressure and microwave treatment on allergic protein
A:不同酶作用后过敏蛋白抑制率;B:不同压强下过敏蛋白抑制率;C:不同微波条件处理后过敏蛋白抑制率
“* ”表示在优化碱性蛋白酶水解条件后虾过敏蛋白抑制率
A:Effects of enzymes on allergic protein inhibition rate;B:Effect of pressures on allergic protein inhibition rate;
C:Effect of microwave treatment conditions on allergic protein inhibition rate
“* ”means inhibition rate of shrimp allergenic protein after optimization of alcalase hydrolysis condition
3 讨论
据报道，虾中存在多种过敏原，但主要过敏原是一
种分子量为 36kD 的原肌球蛋白［19］，目前认为它是虾
中普遍存在的一种主要过敏原。
随着酶学生物技术的发展，酶制剂法因其绿色、环
保、安全等特点被认为是降解抗原蛋白的理想方
法［20］。陈宝宏等报道木瓜蛋白酶能分解大米中的过
敏原，同时也能改善大米的食用品质［21］。Kuniyoshi S
等报道了多种蛋白酶都能对甲壳类动物过敏原起到良
好的降解作用，经过酶解后的甲壳类动物蛋白抽提物
其过敏活性几乎完全消失［22］。
本试验利用酶解、超高压和微波 3 种方法对虾过
敏蛋白进行加工处理，酶解后分子量为 36kD 的虾过
敏蛋白条带消失，且处理后的虾过敏蛋白的致敏性降
低或消失，这与上述文献报道的结果大致相同。超高
压和微波处理后分子量为 36kD 虾过敏蛋白的分子量
大小没有变化，间接竞争酶联免疫检测表明其致敏性
有所降低。Seong-Mi Kim 等报道超高压使虾过敏蛋白
致敏性有所降低而微波处理后致敏性几乎没有降低，
这与我们的结果有所不同，可能是由于虾的品种不同
以及试验仪器不同所至［23］。
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4 结论
超高压和微波处理不能改变 36kD 的虾过敏蛋白
分子量，但能降低其致敏性。酶解，特别是碱性蛋白酶
可有效分解虾过敏蛋白，消除其致敏性。
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(责任编辑 高美须 裴 颖)
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