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EFFECTS OF PEG-6000 AND EXOGENOUS NITRIC OXIDE DONOR SNP ON THE RELATED
PHYSIOLOGICAL INDICES OF POTATO SEEDLINGS In vitro UNDER LOW TEMPERATURE

PEG与SNP对低温下马铃薯试管苗相关生理指标的影响



全 文 :核 农 学 报 2010,24(3):645 ~ 649
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0645-06
PEG与 SNP对低温下马铃薯试管苗相关生理指标的影响
吴雁斌1 王一航2 张 武2 马荷花3
(1. 甘肃农业大学农学院,甘肃 兰州 730070;2. 甘肃省农业科学院马铃薯研究所,甘肃 兰州 730070;
3. 兰州市第 24 中学,甘肃 兰州 730080)
摘 要:研究了在 4℃低温胁迫下,5%聚乙二醇 PEG-6000 和 0. 10mmol /L SNP 分别处理,5% PEG-6000
与 0. 10mmol /L SNP 同时处理对陇薯 3 号马铃薯试管苗的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、
过氧化氢酶(CAT)活性和对丙二醛(MDA)、可溶性蛋白、游离脯氨酸及叶绿素含量的影响。结果表明,
4℃低温下,PEG-6000 和 0. 10mmol /L SNP 都可以胁迫试管苗,导致其酶活性、MDA、可溶性蛋白、脯氨
酸和叶绿素含量都有所上升,其中 0. 10mmol /L SNP 可以显著提高上述各项生理指标,并在和 5% PEG-
6000 共同处理时缓解 PEG 造成的渗透胁迫。
关键词:聚乙二醇;一氧化氮;低温;马铃薯试管苗;生理特性
EFFECTS OF PEG-6000 AND EXOGENOUS NITRIC OXIDE DONOR SNP ON THE RELATED
PHYSIOLOGICAL INDICES OF POTATO SEEDLINGS In vitro UNDER LOW TEMPERATURE
WU Yan-bin1 WANG Yi-hang2 ZHANG Wu2 MA He-hua3
(1. Collegeof Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070;2. Potato Research Institute,Gansu
Academy of Agricultural Science,Lanzhou,Gansu 730070;3. Lanzhou No. 24 Middle School,Lanzhou,Gansu 730080)
Abstract:In this paper potato seedlings of Longshu Ⅲ in vitro were treated with 5% of polyethylene glycol(PEG-6000),
0. 10mmol /L sodium nitroprussede (SNP),and treated with 5% PEG-6000 and 0. 10mmol /L SNP,the effects of
treatments, on superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD) and catalase (CAT) activity, contents of
malondidehyde(MDA),soluble protein,proline and chlorophyll of the seedlings under low temperature of 4℃ were
studied. Results indicated that,under 4℃ both PEG-6000 and 0. 10mmol /L SNP treatments could cause the increase of
their enzymatic activity and the contents of MDA,soluble protein,free proline and chlorophyll in potato seedlings. Low
concentration of SNP can significantly enhance all measured physiological index,and could alleviate the osmotic stress at
combination treatment with the 5% PEG-6000.
Key words:polyethylene glycol;nitric oxide;low temperature;potato seedlings in vitro;physiological characteristics
收稿日期:2009-09-21 接受日期:2009-10-29
基金项目:国家科技支撑计划农林动植物育种工程项目(2006BAD01A06-1-7)
作者简介:吴雁斌(1982-),男,甘肃兰州人,硕士研究生,主要从事马铃薯育种研究。E-mail:yanbin19822002@ yahoo. com. cn
通讯作者:王一航(1948 -),男,甘肃渭源人,研究员,硕士生导师,主要从事马铃薯育种研究。E-mail:gsmlswyh@ 126. com
张 武(1966 -),男,甘肃庆阳人,副研究员,主要从事马铃薯育种研究。E-mail:zhwu586@ sina. com
一氧化氮(nitricoxide,NO)是一种参与植物生理
代谢过程并对植物抗逆性具一定作用的生长调节信号
分子[1 ~ 4],它 通 过 反 馈 调 节 硝 酸 还 原 酶 (nitrate
reductase,NR)活性来调节植物氮代谢产物[5]。有研
究显示,NO 可提高超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide
dismutase,SOD)活性,降低膜脂过氧化作用,减缓缺
水造成的离体水稻叶片的衰老[6,7],中和植物细胞中
活性氧自由基[8]。外源 NO 预处理也可以提高干旱胁
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迫下田间植物叶片的保水性、降低离子渗透、诱导气孔
关闭,从而提高植株的耐旱性[9]。硝普钠(SNP)作为
外源 NO 供体,低浓度下对活性氧具有清除作用[10]。
聚乙二醇(PEG)作为渗透剂,被广泛用于植物渗
透胁迫研究[11,12]。它在水中有很高的溶解度,分子量
范围广泛,当其分子量大于 4000 时(如本试验使用的
PEG-6000,分子量为 6000),不能被植物吸收,也不对
植物造成毒害,只降低培养基中的水势[13],夺取水分
对植物造成渗透胁迫。虽然硝普钠及聚乙二醇对植物
的影响都有人研究过,但是它们共同作用于马铃薯试
管苗的生理调控机制未见报道。
马铃薯是世界第 4 大作物,我国西北地区是马铃
薯主产区,因土质疏松,富含钾素,日照充裕,昼夜温差
大,生产的马铃薯块大,干物质含量高,淀粉含量一般
高于国内其他产区 2 ~ 3 个百分点,食味上乘,在国内
市场上享有盛誉。马铃薯产业不仅是西北地区保障粮
食安全的特色优势产业,而且也是促进农村经济发展
的支柱产业。多年来,春末夏初晚霜冻害和干旱是制
约马铃薯生长发育的关键因素,也严重制约西北马铃
薯产业的发展。本文报道 4℃ 低温下 SNP 与 PEG-
6000 胁迫对马铃薯试管苗中叶绿素、游离脯氨酸、丙
二醛、可溶性蛋白质含量以及抗氧化酶类活性的影响,
初步探讨马铃薯相关生理机制,以为西北地区马铃薯
生产提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料培养与处理
供试马铃薯品种为中晚熟品种陇薯 3 号的试管
苗。PEG 和 SNP 均为天津市光复精细化工研究所生
产。
以 MS 基本培养基为对照,在对照的基础上再设
置 3 个处理:外理 1,加入 0. 10mmol /L SNP(前期试验
显示,0. 10mmol /L SNP 最有利于马铃薯试管苗的生
长);处理 2,加入 5% PEG-6000;处理 3,同时加入 5%
PEG-6000 和 0. 10mmol /L SNP。各处理均设 3 次重
复。在超净工作台上接种试管苗(每瓶接种 15 株,各
处理均接 15 瓶),置于光照培养箱内(温度控制在
4℃,光照为 2500lx),观察其生长情况,待试管苗有株
高达到 4cm 时开始首次测量,每隔 7d 测 1 次相关生理
指标,共测定 5 次。
1. 2 测定方法
1. 2. 1 酶液的制备及活性测定 取 0. 2g 新鲜马铃薯
组培苗叶片和嫩茎混合于冰浴研钵中,加少许石英砂
和 5ml 预冷的酶提取液(用 pH 7. 8 的磷酸缓冲液配
制,内含 5mmol /L EDTA,2mmol /L AsA,2% PVP),迅
速匀浆,4℃,4000g 离心 15min,取上清液,用于测定
POD、SOD、CAT 和可溶性蛋白。
POD 活性的测定采用 0. 3% 愈创木酚法[14],以
470nm 吸光值每 min 增加 1 为 1 个酶活性单位(U)。
SOD 活性的测定采用 NBT 光还原法[15],以抑制氮蓝
四唑(NBT)在光照下被还原到 50% 的酶量为 1 个酶
活性单位(U)。CAT 活性的测定采用 240nm 比色
法[15],以 240nm 吸光值每 min 减小 0. 1 为 1 个酶活性
单位(U)计算 CAT 活性。可溶性蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝 G-250 染色法[15],标准蛋白质溶液由
牛血清白蛋白配成。
1. 2. 2 MDA 含量的测定 采用双组分分光光度计
法[15]。称取 0. 3g 马铃薯试管苗嫩叶和嫩茎,加入 5ml
三氯乙酸(TCA),研磨后在 4000r /min 离心 15min,吸
取 2ml 上清液再加入 2ml 0. 6%硫代巴比妥酸(TBA)
溶液,沸水浴 15min,迅速冷却,测定 532、600 与 450nm
的吸光值,参照邹琦和赵世杰的方法[15,16]计算 MDA
含量。
1. 2. 3 叶绿素含量的测定 无水乙醇与丙酮(1 ∶ 1,
V /V)混合液浸泡法[17],0. 1g 嫩叶加 5ml 无水乙醇和
5ml 丙酮,封口,遮光,24h 后测定 649、665 与 470nm
下的吸光值。
1. 2. 4 脯氨酸含量的测定 采用 3% 磺基水杨酸从
叶片中提取,酸性茚三酮比色法[15]测定。
1. 3 数据分析
用 DPS 软件进行方差分析,以 Excel 软件绘制图
表。
2 结果与分析
2. 1 低温下 SNP 和 PEG-6000 对马铃薯试管苗叶绿
素含量和脯氨酸含量的影响
叶绿素的变化与抗性呈负相关[18],是植物遭受渗
透胁迫的重要特征之一。在 4℃ 低温胁迫下,5%
PEG-6000 处理陇薯三号试管苗的叶绿素含量总体并
没有太大的变化,与对照(CK)相似,含量都不高(图
1),说明 4℃低温比 5% PEG-6000 的胁迫作用更大。
但在无 PEG-6000 情况下,SNP 可以显著增加试管苗
叶片中叶绿素含量,缓解低温造成的部分伤害。而当
PEG-6000 与 SNP 同时存在时,叶绿素含量比仅有 SNP
时要低但又高于仅有 PEG-6000 的情况。说明较低浓
度的 SNP 可以同时缓解低温和 PEG-6000 对试管苗叶
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3 期 PEG 与 SNP 对低温下马铃薯试管苗相关生理指标的影响
绿素含量的影响。
图 1 低温下 SNP 和 PEG-6000 对马铃薯
试管苗总叶绿素含量的影响
Fig. 1 Effect of SNP and PEG-6000 on
the total chlorophyll contents in potato
seedlings at 4℃
脯氨酸是细胞内相溶性物质,起着细胞质渗透调
节剂的作用[19],幷能够维持质膜结构的完整性[20]。
植物在正常状况下脯氨酸含量很低,在遇到干旱、低温
等逆境时,游离脯氨酸就会大量积累,从而保护细胞不
受损伤。同时脯氨酸还具有清除活性氧的能力[21]。
其积累指数与植物抗逆性有关,可作为植物抗逆性的
生化指标[15]。从图 2 可以看出,4℃低温下,对照脯氨
酸含量急剧上升,PEG-6000 处理下除第 7 天外,其余
时间的脯氨酸含量均高于对照,说明植株受到了双重
胁迫;SNP 处理时,脯氨酸含量下降明显,说明 SNP 缓
解了低温胁迫造成的影响。PEG-6000 与 SNP 共同作
用时,脯氨酸含量相比对照以及 PEG-6000 作用时都
有一定量的下降,说明 0. 10mmol /L SNP 既能缓解低
温胁迫又能缓解渗透胁迫。
图 2 低温下 SNP 和 PEG-6000 对马铃薯
试管苗游离脯氨酸含量的影响
Fig. 2 Effect of SNP and PEG-6000 on the
free proline contents in potato seedlings at 4℃
2. 2 低温下外源 SNP 和 PEG-6000 处理对马铃薯试
管苗丙二醛和蛋白质含量的影响
植物器官衰老或在逆境下遭到伤害,会发生膜脂
过氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解
产物,其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度[15]。
从图 3 可以看出,4℃低温下的 4 种处理,马铃薯试管
苗早期的 MDA 含量都不是很高,但随着时间推移各
处理的胁迫加重,MDA 含量均有一定的上升,说明
4℃低温﹑ PEG-6000 ﹑ SNP 都造成了试管苗的膜脂
过氧化,且 PEG-6000 处理的 MDA 含量增长最快,对
植株的伤害最大,对照膜脂过氧化最轻。PEG-6000 与
SNP 同时处理的 MDA 含量开始上升很快,但随着时间
推移又逐渐低于同日的 PEG-6000 处理,可能是由于
5% PEG-6000 造成膜脂过氧化比 0. 10 mmol /L SNP 严
重,同时低浓度的 SNP 可以抵制渗透胁迫的伤害,所
以后期 MDA 含量有所下降。
图 3 低温下 SNP 和 PEG-6000 对
马铃薯试管苗丙二醛含量的影响
Fig. 3 Effect of SNP and PEG-6000 on the
MDA contents in potato seedlings at 4℃
图 4 低温下 SNP 和 PEG-6000 对马铃薯
试管苗蛋白质含量的影响
Fig. 4 Effect of SNP and PEG-6000 on the
protein contents in potato seedlings at 4℃
蛋白质含量可以表示植物组织中酶活力的大小及
酶的纯度[15]。从图 4 可以看出,随着时间的推移,除
了对照,其余处理马铃薯试管苗的蛋白质含量在第 7
天时都有不同程度的上升,但上升幅度都不明显。说
明低浓度的 SNP 与 PEG-6000 处理可刺激试管苗中蛋
白质的产生,进而增加相关酶类的合成,提高植物抵御
低温的能力。另外试管苗中可溶性蛋白的含量随着胁
迫时间的延长有所增加。试管苗受到胁迫后,合成了
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一些高度亲水的新蛋白质,以增强原生质的水合度,起
到抗脱水的作用[22]。
2. 3 低温下 PEG 与 SNP 处理对马铃薯试管苗相关酶
活性的影响
表 1 显示,4℃低温下,各处理组 SOD 活性均显著
高于对照,其中 5% PEG-6000 胁迫较 0. 10mmol /L
SNP 胁迫时 SOD 活性小,两者共同作用时则高于 5%
PEG-6000 单独胁迫,说明 4℃低温以及低浓度 SNP 胁
迫可以提高 SOD 活性,增强叶片清除自由基的能力。
POD 与 CAT 活性变化与 SOD 的变化相似(表 1),各处
理的 POD 与 CAT 活性较对照都有所增加,其中 PEG-
6000 处理下 POD 活性最低,低浓度 SNP 处理时 2 种
酶活性最高,而 5% PEG-6000 与 0. 10mmol /LSNP 共
同作用时,SNP 缓解了 PEG-6000 造成的渗透胁迫,使
酶含量有所上升。
表 1 低温下 PEG 与 SNP 处理对马铃薯试管苗
SOD、POD 和 CAT 活性的影响
Table 1 Effects of PEG-6000 and SNP on the
activities of SOD,POD and CAT in
potato seedlings at 4℃
SNP 浓度
SNP
concentration
(mmol / L)
PEG 浓度
PEG
concentration
(%)
SOD
(U)
POD
(U)
CAT
(U)
0 0 160. 821 aA 51. 979 bB 91. 250 aA
140. 354 bB 44. 208 aA 41. 250 cdC
211. 661 aA 60. 708 aA 75. 000 bB
88. 889 bB 56. 555 bB 36. 250 dC
121. 253 aA 92. 875 aA 46. 250 cC
0. 10 0 230. 273 bcB 53. 854 bcAB 192. 500 aA
194. 218 dC 77. 528 cB 102. 500 cC
463. 258 aA 88. 222 abAB 88. 750 dD
136. 781 cBC 88. 875 abAB 102. 500 cC
237. 360 bB 108. 291 aA 128. 750 bB
0 5 164. 947 bcBC 83. 854 bB 137. 500 aAB
188. 539 dC 52. 375 cB 83. 766 aA
420. 926 aA 77. 528 dC 81. 266 bB
98. 467 cdBC 61. 791 eD 85. 000 bB
199. 552 bB 98. 402 aA 117. 500 abAB
0. 10 5 160. 821 bcBC 82. 375 bcB 146. 250 aA
164. 619 dC 88. 166 dC 86. 250 cC
444. 622 aA 81. 541 cB 132. 500 bB
134. 100 cdC 87. 472 bAB 88. 750 cC
222. 371 bB 101. 083 aA 121. 250 bB
注:同一栏内数据后不同小写字母者在 0. 05 水平上差异显著,标
不同大写字母者在 0. 01 水平上差异显著。
Note: Different capital and small letters indicate the significant
difference at the 0. 01and 0. 05 level,respectively.
3 讨论
植物体内主要存在 O - 2,H2O2 和 COOH 等活性
氧,可严重影响生物膜与其他生物大分子的结构和功
能。近年来许多研究表明,低温使植物体内活性氧累
积并超过伤害阀值[23]。因此提高植物清除活性氧的
能力,可有效防止植物低温伤害。SOD 是生物中最重
要的清除活性氧的酶之一,它的主要功能是歧化 O - 2
产生 H2O2 和 O2。CAT 和 POD 具有分解 H2O2 的作
用。因此,Fridovich 等把 SOD、CAT 和 POD 3 种酶统
称为细胞保护酶系统[24]。保护酶在胁迫不超过限度
时,可诱导植物避免活性氧自由基的伤害[25]。据报
道,马铃薯试管苗仅可以在 8℃以上低温保存[26]。本
文采用 4℃低温处理马铃薯试管苗,在保证试管苗存
活的情况下,其 SOD、CAT 和 POD 的活性都有不同程
度的提高,说明了逆境会使保护酶活性上升以抵御低
温对试管苗的伤害。有报道称 SNP 处理可减轻低温
胁迫对黑麦草(Lolium perenne)细胞的氧化损伤程度,
细胞修复较快[27]。本试验加入 SNP 后试管苗内 3 种
酶活性进一步上升。说明本试验条件下 SNP 可能加
快了细胞的修复,但具体原因还有待进一步研究。
PEG 使植物组织和细胞处于类似于干旱的渗透
胁迫之中[28]。本研究表明,5% PEG - 6000 作用时植
株内酶活性增加较低温和 SNP 处理幅度小,产生了渗
透胁迫,但 MDA、可溶性蛋白、脯氨酸含量上升明显。
说明在 PEG 胁迫下植物细胞脱水进而影响渗透调节
物质含量增加并影响抗氧化酶类的生成。
5% PEG-6000 对试管苗产生了渗透胁迫,加入低
浓度的 SNP 后,缓解了渗透胁迫,各种酶活性表现有
明显的提高,这是因为 PEG 造成的胁迫被缓解,结果
MDA 含量有所下降,叶绿素含量也有所上升。
依据国内外相关文献,本文不但首次在马铃薯试
管苗研究中引入 PEG-6000 和 SNP,探讨了它们之间的
相互作用,并针对西北地区低温的实际情况进行低温
胁迫。研究结果显示,4℃低温胁迫下除脯氨酸外,对
其他渗透调节物质的影响不大,但可以提高抗氧化酶
类的活性。对照的存活也说明试管苗的保存温度可以
降低到 4℃,今后要继续研究更低温度下的保存方法。
5% PEG-6000 可造成轻度渗透胁迫,使植物的酶活性
下降,渗透调节物质含量上升。0. 10 mmol /L SNP 可
以缓解逆境胁迫,特别是缓解了 PEG-6000 造成的渗
透胁迫,但造成这一现象的根本原因还不清楚。所以
今后的研究中,在本试验结果基础上需继续完善对其
他相关生理机制的研究,从分子层面对马铃薯试管苗
进行研究,以了解 SNP 缓解 PEG 造成的渗透胁迫的根
本原因。考虑到西北地区干旱及低温环境,本研究结
果为马铃薯适时早播和温室全年工厂化生产提供了一
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定的依据。
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