全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1314 ～ 1319
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-03-19 接受日期:2010-06-21
基金项目:黑龙江省留学回国基金资助(LC08C35)
作者简介:刘大森(1961-)，男，吉林辽源人，教授，主要从事生物物理及反刍动物营养的研究。Tel:0451-55190706;E-mail:dasenliu@ neau. edu. cn
文章编号:1000-8551(2010)06-1314-06
应用 XANE技术研究瘤胃液中锌的相对浓度和状态
刘大森1，2 隋美霞2 刘海霞2 贺 博3 阎文胜3 任燕锋2
(1. 东北农业大学理学院，黑龙江 哈尔滨 150030;2. 东北农业大学动物营养研究所，黑龙江 哈尔滨 150030;
3. 中国科学技术大学国家同步辐射实验室，安徽 合肥 230029)
摘 要:应用 XANES(X 射线吸收近边结构)技术，研究了体外培养瘤胃上清液中锌的相对浓度和状态。
以 4 头安装永久性瘤胃瘘管的杂交绵羊为供体动物，早饲后 2h 采集瘤胃液，混合后用于体外培养。以
植酸、碳酸钙、微晶纤维素和苜蓿，配制成植酸高钙、植酸低钙、低纤维素和高纤维素 4 种培养底物，在 4
种底物中按 200mg /kg 等量锌分别添加 ZnMet、ZnLys、ZnSO4 和 ZnO，共 16 个处理。体外培养 24h，
3500rpm 离心分离上清液，65℃烘干 24h，应用 XANES(X 射线吸收近边结构)技术测定其中锌浓度和状
态。结果表明:在植酸高钙或不同水平纤维素组中，上清液中锌浓度有机锌明显优于无机锌，但在植酸
低钙组中，有机锌与无机锌差别不大。归一化后，植酸钙组锌的谱线基本相同，吸收边位置也与文献中
的 9 659eV 相同，说明经过 24h 培养的上清液中不同锌源锌的化学状态相同;但纤维素组锌的谱线不
同，说明纤维素改变了上清液中锌的状态。XANES 可作为矿物元素营养研究的新技术。
关键词:XANES;瘤胃液;Zn 浓度及状态;植酸;钙;纤维
SDUDY OF ZNIC RELATIVE CONCENTRATION AND STATE IN RUMEN FLUID BY XANES
LIU Da-sen1，2 SUI Mei-xia2 LIU Hai-xia2 HE Bo3 YAN Wen-sheng3 REN Yan-feng2
(1. College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030;
2. Animal Nutrition Institute，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030;
3. National Synchrotron Radiation Lab，University of Science and Technology of China，Hefei，Anhui 230029)
Abstract:Mixed rumen fluid were collected from 4 sheep with permanent rumen fistula after being fed for 2h，Zn relative
concentration and state in supernatant fluid of the rumen fluid was investigated through in vitro incubation. Four kinds of
culture substances，which had characteristic of phytic acid-higher calcium，phytic acid-lower calcium，higher cellulose
and lower cellulose，was added in 200mg /kg Zn of ZnMet，ZnLys (organic zinc)，ZnSO4 and ZnO (inorganic zinc).
Culture substances were centrifuged at 3500r /min after 24h incubation，and the supernatant fluid was dried for 24h and
then zinc in it was determined by using XANES (X-ray absorption near edge structure). The result is that organic zinc
obviously prevailed inorganic zinc in the treatment of phytic acid with calcium-higher and different level of cellulose in
increasing zinc concentration，but no significant difference was found in the treatment of phytic acid with calcium-lower.
The normalized spectrums of phytic acid with calcium groups were basically similar for 4 kinds of zinc source，indicating
that after being cultured for 24h in vitro，zinc chemical states of all treatments in supernatant fluid were similar with each
other，and absorption edge positions were also 9 659eV as described in the literatures. But the chemical states of zinc
were changed in treatments of different cellulose levels，suggesting that zinc state in the supernatant fluid could be
changed after cellulose was added. It is concluded that XANES could be a new technique for study animal mineral
element nutrition.
Key words:XANES;rumen fluid;Zn concentration and state;phytic acid;calcium;cellulose
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6 期 应用 XANE 技术研究瘤胃液中锌的相对浓度和状态
锌是动物体内必需的微量元素，因在动物体内具
有广泛的生理生化功能而被称为“生命元素”。不同
锌源锌在动物体内消化、吸收和生物利用率有很大差
异。X 射线吸收精细结构(XAFS)技术是同步辐射应
用的重要领域之一，包括 X 射线吸收近边结构
(XANES)和扩展 X 射线吸收精细结构(EXAFS)。目
前对于锌元素的研究，XAFS 技术仅仅局限于物理学、
化学样品等方面［1］，而对于生物样品中锌元素只是应
用原子吸收光谱进行含量的研究［2］。通过对动物的
饲养试验，众多学者对日粮中添加不同锌源对动物的
影响效果及作用机制进行了大量研究，但对在反刍动
物瘤胃内锌的状态及消化机理研究甚少，一方面是瘤
胃环境比较复杂，另一方面是缺乏有效的测定方法。
本试验拟应用同步辐射 XANES 技术，在体外模拟瘤
胃条件下，探讨不同培养底物中锌相对浓度及状态变
化。
1 材料与方法
1. 1 锌源
饲料级锌标准品(锌含量为实验室测定值):氧化
锌(ZnO)为汕头市金元精细化工有限公司产品，氧化
锌含量≥95. 00%，锌含量 76. 75%;硫酸锌(ZnSO4)，
衡阳市西城中宝饲料原料厂生产，硫酸锌含量≥
97. 00%，锌含量 35. 55%;蛋氨酸锌(ZnMet)和赖氨酸
锌(ZnLys)，哈尔滨市德邦饲料有限公司产品，蛋氨酸
锌含量≥81. 50%，锌含量 18. 97%，赖氨酸锌含量≥
28. 00%，锌含量 5. 31%。
1. 2 试验设计
按钙含量配制 2 种底物:植酸高钙组(植酸 +
0. 012g 钙 + 0. 6g 微晶纤维素)和植酸低钙组(植酸 +
0. 003g 钙 + 0. 6g 微晶纤维素)。
按纤维素含量配制 2 种底物:低纤维素组(0. 6g
苜蓿)和高纤维素组(0. 6g 微晶纤维素)。
按等量锌(200mg /kg)在上述 4 种底物中分别加
入不同锌源(ZnO，ZnSO4，ZnMet 和 ZnLys)，试验共 16
个处理，每个处理 3 次重复。
1. 3 试验动物和日粮
选取 4 只体况良好、年龄相近、体重(45 ± 3)kg 的
绵羊，安装永久性瘤胃瘘管，作为瘤胃液的供体动物，
试验羊单圈饲养，每日 6 ∶ 00、18 ∶ 00 饲喂，先粗粮后精
粮，自由饮水，饲喂一周后采集瘤骨液。日粮精粗比为
40∶ 60。日粮配方及营养水平见表 1。
表 1 日粮组成及营养水平(风干基础)
Table 1 Composition and nutrient
levels of diets (air-dry basis，%)
项目 item 营养成分 nutrient level3)
羊草 chinese wild ray 60. 0 DM 90. 73
玉米 corn 31. 0 DE(MJ /kg) 12. 32
豆粕 soybean meal 6. 5 CP 11. 61
食盐 salt 0. 5 ADF 25. 58
石粉 limestone 1. 0 NDF 42. 28
磷酸氢钙 CaHPO4 0. 5 Ca 0. 65
维生素预混料 vitamin premix1) 0. 3 P 0. 32
微量元素预混料 trace-mineral premix2) 0. 2
合计 total 100
注:1)每 kg 维生素预混料提供:VA 1 000 000IU;VD 500 000IU;VE
10 000IU;2)每 kg 微量元素预混料提供:FeSO4·H2 O 54. 7g;CuSO4·
5H2 O 15. 7g;MnSO4·H2 O 27. 7g ;CoCl2·10H2 O 393mg;KI 393mg;
Na2 SeO3 146mg;3)计算值。
Note:1)Supplied per kg vitamin premix:VA 1 000 000IU;VD 500
000IU;VE 10 000IU;2)Note:Supplied per kg trace － mineral premix:
FeSO4·H2 O 54. 7g;CuSO4·5H2 O 15. 7g;MnSO4·H2 O 27. 7g ;CoCl2·
10H2 O 393mg;KI 393mg ;Na2 SeO3 146mg;3)Calculated values.
1. 4 瘤胃液采集
于饲喂后 2h，从每只绵羊的瘤胃中分别抽取
250ml 瘤胃液，放入同一保温瓶混匀，用 4 层纱布过
滤，将过滤后的瘤胃液注入持续通入 CO2 的 2L 玻璃
瓶中，并保持在 39℃水浴中备用。
1. 5 缓冲液配制
配制方法见 Wedekind ［9］。充入 CO2 驱除氧，以
刃天青的粉红色消失视为无氧。
1. 6 体外发酵装置
主体为 HZS-H 型恒温水浴摇床，其水浴温度和振
荡速度可调;发酵瓶为容积约 100ml 的培养瓶。在培
养瓶中加入底物和 60ml 混合培养液(20ml 瘤胃液 +
40ml 缓冲液)，将培养瓶置于 39℃恒温水浴摇床中振
荡，20r /min 培养 24h。
1. 7 样品制备
体外培养 24h 后，将发酵瓶内容物 3500rpm 离心
15min，用酸度计测定上清液 pH 值。于 65℃下干燥上
清液，制成粉末样品(直径约 50μm)。
1. 8 XANES 谱测定方法
将粉末样品涂在胶带上，涂层厚度 5 ～ 6μm，用于
测定 XANES 谱。XANES 谱测定在(合肥)国家同步
辐射实验室 U7C 光束线的 XAFS 实验站进行。储存
环电子能量 800MeV，平均流强 100 ～ 300mA，使用平
面 Si(111)双晶单色器，样品处光斑大小(H × V)为:
15m × 1m。进行样品 Zn 元素 K 边的 XAFS 分析，荧光
模式测量，荧光测定仪器为电离室。
1. 9 数据处理
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试验数据采用 origin(6. 1)软件进行整理后，运用
该软件的归一化程序进行分析。
2 结果与分析
2. 1 不同锌源对培养液 pH 值变化的影响
体外培养 24h 后，不同处理组培养液的 pH 值见
图 1。
图 1 体外培养 24h 培养液 pH 值变化
Fig. 1 pH value of culture fluid after
for 24h in vitro culture
由图 1 可以看出，体外培养 24h 后，4 种锌源下培
养液的 pH 值差异均不显著，其趋势为高纤维组 < 植
酸高钙组 <植酸低钙组 < 低纤维组。但各处理组 pH
值都在 5. 7 ～ 7. 1 之间，适合瘤胃微生物生长［4］。
2. 2 4 种锌源标准品的 XANES 谱
4 种标准品锌源 Zn 的 K 边 XANES 谱线见图 2。
图 2 4 种标准品锌的 K 边 XANES 谱线
Fig. 2 XANES spectrum of Zn K edge of 4 kinds
of zinc standard substance
在 XANES 图谱中，Zn 的 K 边吸收值为 9659eV，
边前取 20 ～ 30eV 范围，边后取 70 ～ 80eV 范围，总能
量区间在 100eV 内。虽然同为等量锌，但 4 种锌源锌
XANES 谱线吸收值差距较大，有机锌较无机锌 K 边吸
收值小。ZnO 与其他 3 种锌源明显不同，表现为主吸
收峰位置较高，其次在主吸收峰低结合能侧有一肩峰，
说明该 ZnO 样品中的 Zn 元素可能存在 2 种化学状
态，但是主化学状态为 ZnO，可能是锌周围氧原子数目
不同所致。其他 3 种锌源谱线大致相同，表明基本都
只有 1 种化学状态。由图 2 可知，锌元素在这 4 种标
准品中所处环境是不同的，结构存在较大差异。
2. 3 植酸与钙组合对 4 种锌源锌浓度和结构的影响
由图 3 可以看出，植酸高钙组加入 4 种锌源锌
ZnLys 突变最大，即 ZnLys 组上清液中 Zn 浓度最高，而
ZnO 浓度最低。此外，4 种锌源吸收峰后的曲线形状
非常相似。由图 4 可以看出，植酸低钙组加入 4 种锌
源锌后，ZnO 突变最小，即 ZnO 组上清液中 Zn 浓度最
低，这与其在植酸高钙组是相同的，但 ZnSO4 组几乎
与 ZnMet 组相同，且高于有机锌源 ZnLys 组。此外，4
种锌源吸收峰后曲线形状也是非常相似。
图 3 植酸高钙组 4 种锌源 Zn 的 K 边 XANES 谱线
Fig. 3 XANES spectrum of Zn K edge of
phytic acid -higher calcium
图 4 植酸低钙组 4 种锌源 Zn 的 K 边 XANES 谱线
Fig. 4 XANES spectrum of Zn K edge of
phytic acid-lower calcium
由不同植酸钙组归一化后的图 5 和图 6 可以看
出，上清液中 Zn 的谱线基本相同，吸收边位置与文献
中的 9659eV 相同，说明经过体外培养 24h，上清液中
Zn 的化学状态未发生变化。
2. 4 纤维素对 4 种锌源锌浓度及结构的影响
图 7 显示，高纤维素组中 ZnO 在主吸收峰之前仍
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6 期 应用 XANE 技术研究瘤胃液中锌的相对浓度和状态
图 5 植酸高钙组 4 种锌源 Zn 的 K 边归一化后 XANES 谱线
Fig. 5 Normalized XANES spectrum of Zn K edge
of phytic acid-higher calcium
图 6 植酸低钙组 4 种锌源 Zn 的 K 边归一化后 XANES 谱线
Fig. 6 Normalized XANES spectrum of Zn K edge
of phytic acid-lower calcium
有一小肩峰，ZnMet 突变最大，表明 ZnMet 组 Zn 浓度
最高，而 ZnSO4 组中 Zn 浓度最低。此外，ZnO、ZnSO4
和 ZnLys 组中锌吸收峰后曲线形状非常相似。图 8
中，低纤维素组中 ZnO 突变最小，即 ZnO 组 Zn 的浓度
最低，这与高纤维素组不同。低纤维素组加入 4 种锌
源后，其相对锌浓度依次为 ZnO < ZnSO4 < ZnLys <
ZnMet，与高纤维素组相同的是 ZnMet 组锌浓度最高。
不同纤维素含量组归一化后(图 9，图 10)，各组
锌源的谱线不相同，但吸收边位置与文献中的 9 659
eV 基本相同。高纤维素组中的 ZnMet 的吸收峰后曲
线形状明显与其他组不同，说明经过 24h 培养后，锌源
中 Zn 的化学状态有所变化。
3 讨 论
3. 1 同步辐射 XAFS 技术测定元素含量的优越性
同步辐射 XAFS 技术不只是限于结晶物质结构和
物质电子结构研究，对吸收原子的化合态和几何结构
也特别敏感，不但能够定性定量测定微量元素，而且能
够检测出微量元素与何种元素结合及其氧化状态，此
图 7 高纤维素组 4 种锌源 Zn 的 K 边 XANES 谱线
Fig. 7 XANES spectrum of Zn K edge
of higher cellulose
图 8 低纤维素组 4 种锌源 Zn 的 K 边 XANES 谱线
Fig. 8 XANES spectrum of Zn K edge
of lower cellulose
技术已在物理、化学和材料等各领域被广泛应用，并解
决许多重要问题。XAFS 技术是生命科学研究的重要
手段［5］，生物大分子中金属离子的浓度一般在千分之
几甚至更低，但对其生物活性往往起决定性作用。目
前 XAFS 技术在营养学研究中应用较少，仅有一篇文
章报道了应用 XAFS 技术测定饲料中微量元素硒［6］。
该研究选择了 5 种无机硒(+ 4 价或 + 6 价硒)和蛋氨
酸硒(0 价硒)样品，测定了硒的 XAFS 谱，结果显示，
XAFS 谱峰值对硒的价态(0、+ 4 和 + 6)极为敏感，不
同价态硒的 XAFS 谱可以很好地分开。
3. 2 矿物元素的不同状态与其利用率
不同化学形式的锌其吸收与利用率不同。目前，
许多资料报道，有机锌优于无机锌，机理是有机锌独特
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图 9 高纤维素组 4 种锌源的 K 边归一
化后 XANES 谱线
Fig. 9 Normalized XANES spectrum of K
edge of higher cellulose
图 10 低纤维素组 4 种锌源的 K 边归一化后 XANES 谱线
Fig. 10 Normalized XANES spectrum of
K edge of lower cellulose
的螯合物结构中元素处于不活泼状态，有机矿物元素
更稳定，不易与其他物质发生交互作用，可以免除瘤胃
微生物对它作用，同时可以免受化学因素或被日粮成
分(如植酸及钙等)结合的影响［7］，直接进入到小肠，
提高其利用率，但是，该结论缺乏有力的相应试验证
据，存在一定争议。
矿物元素的状态可作为评价其利用率的一个参考
依据，对于无机元素来说，必须在小肠内或在吸收位点
处以可溶状态存在时才能被吸收。反刍动物瘤胃是复
杂发酵罐，研究中清楚进入小肠之前不同来源微量元
素锌的浓度及状态，才能从真正意义上明白其消化吸
收的机理，从而指导生产实践。
3. 3 植酸与钙组合对不同锌源的影响
钙是影响锌吸收的重要常量元素，有关钙对锌在
消化吸收上的拮抗作用的机理众说不一:有的认为是
由于钙影响锌与小肠内蛋白结合或钙锌在吸收上的竞
争引起，还有的认为高钙因素不影响锌的吸收，但可加
速锌在体内的循环，使锌通过肝、胰的分泌作用从消化
道内排除，减少锌在体内的滞留。在植酸与钙同时存
在时，其影响机理是形成 Zn-植酸盐-Ca 不溶性螯合
物，从而明显降低锌的吸收。
有研究通过肌注途径给药证明，长期饲喂高钙日
粮的大鼠对65 Zn 滞留分数较高，说明高钙因素能阻碍
锌的吸收，使机体造成缺锌状态［8］。Adham［9］等发现，
低钙对大鼠65 Zn 吸收无影响，而高钙则明显降低65 Zn
的吸收。Wedekind［10］等认为有机锌只在一定的饲粮
条件下有效，饲喂低钙及植酸时可能没有显著改善效
果。用含钙 1. 1%或 1. 6%饲粮饲喂白来航鸡对口服
或肌肉注射的65 Zn 吸收明显低于饲喂含钙 0. 5%饲粮
的鸡，高钙降低锌的吸收［11］;董晓慧［12］研究表明，络
合(螯合)有机锌，尤其是中等及偏极强络合强度有机
锌吸收在动物体内确实好于无机锌，并且这种差异在
十二指肠表现更为明显。Zhou［13］比较了不同大豆加
工产品中植酸与锌及植酸、钙与锌的克分子比，发现后
者比前者能更有效预测锌生物学效价，这也是本试验
选取植酸与钙不同组合，而不选取单一植酸或单一钙
作为影响因子的原因。
本试验植酸高钙组 Zn 浓度依次为 ZnLys > ZnMet
> ZnSO4 > ZnO，即在植酸和高钙存在的条件下，有机
锌优于无机锌，植酸低钙组试验结果中 ZnSO4 组几乎
与 ZnMet 组相同，且高于有机锌来源的 ZnLys 组，这与
Faiweather-Tait［7］和 Spears［14，15］等的研究结果不一致。
其原因可能是动物性别、生长阶段及不同动物的消化
生理特点等条件不同;其次，本试验研究的是瘤胃上清
液中锌的浓度，而有研究表明瘤胃微生物对锌也有一
定的富集作用。因此，这些问题有待深入研究。
3. 4 纤维素对不同锌源的影响
锌的利用受多种因素影响，纤维是其影响因素之
一［16］。纤维对锌元素利用的影响大小(有无)牵涉许
多相关因素，如纤维水平、来源和成分，以及基础日粮
等等，但纤维对不同状态锌利用的影响有无差异尚无
明确的报道。单安山［17］研究报道，高饲粮纤维使各种
化合态锌在组织中的浓度都显著降低，饲喂含小麦麸
及果胶的饲粮可刺激大鼠大肠发酵，促进结肠对锌的
吸收及小肠对锌的贮存，但对小肠的锌吸收无影响。
Mercier［18］报道，富含纤维的日粮能降低人体对锌的吸
收，但饲粮中植酸含量也很高，无法断定是纤维还是植
酸降低了锌吸收。
本试验中，无论高纤维组还是低纤维组，有机锌组
锌浓度高于无机锌组，说明纤维素对无机锌和有机锌
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的相对锌浓度产生影响，含锌化合物结构也发生了变
化。由于本研究是一次探索性试验，故有待深入开展
研究。
4 结论
先进的 XANES 分析方法具有样品制备简单、测
定结果准确、影响因素较少等优点，是矿物元素营养作
用研究的新技术。
当培养底物含有植酸高钙或纤维素时，瘤胃上清
液中有机锌源锌浓度高于无机锌源锌浓度;培养底物
含植酸低钙时，上清液中有机锌源锌浓度和无机锌源
锌浓度没有差异。纤维素改变了上清液中锌的状态。
致谢:本研究 XANES 谱测定是在(合肥)国家同
步辐射实验室 U7C 光束线的 XAFS 实验站完成的。
在此对实验室及工作人员在光谱测定和分析中给予的
帮助表示衷心的感谢!
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(责任编辑 邱爱枝)
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