全 文 ：畜牧兽医学报 , 1998, 29( 4) , 332-338
Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica
含羞草素降解途径的研究
汪　儆1　易俊东2　雷祖玉1　冯学勤1　于炎湖2
( 1.中国农科院畜牧研究所 ,北京 100094;
2.华中农业大学牧医系 ,武汉 430070)
摘　要　银合欢 ( Leuceana leucoceph ela )是一种速生高产豆科木本饲料 ,被誉为热带和亚热
带地区的“奇迹树”、和“蛋白质库”。 银合欢所含含羞草素 [β -N-( 3-羟基 -4-吡啶酮 ]-α-苯丙氨酸 ]及
其瘤胃代谢产物 3, 4-DHP [3-羟基 -4( 1氢 )吡啶酮 ]对反刍家畜有毒。 但将“涠洲瘤胃液”灌入反刍
家畜瘤胃后 ,用银合欢饲喂反刍家畜 ,不但不引起中毒 ,而且可取得良好的饲养效果。 本试验对含
羞草素在“涠洲瘤胃液”脱毒细菌作用下的降解途径进行了探讨。结果表明: 含羞草素在“涠洲瘤胃
液”脱毒细菌的作用下 ,首先降解生成 3, 4-DHP,然后转变为 2, 3-DHP( 2, 3-二羟基吡啶酮 )这一中
间代谢产物进一步降解 ,乙酸、丁酸、二氧化碳和氨等无毒化合物可能是 2, 3-DHP的最终降解产
物。
关键词　含羞草素 ,降解途径 ,“涠洲瘤胃液” ,脱毒细菌
银合欢 ( Leuecana leueoecphela)是一种多年生、耐干旱、四季常绿、枝叶繁茂、适口性好、
再生快的速生木本豆科植物 ,其嫩茎叶粗蛋白质含量占干物质的 22～ 29% ,被誉为热带、亚热
带国家、地区的“奇迹树”和“蛋白质库” [1、 2 ]。但银合欢枝叶中含有的含羞草素 [β -N-( 3-羟基-4-
吡啶酮 ) -α-苯丙氨酸 ]及其瘤胃降解产物 3, 4-DHP [3-羟基 -4( 1氢 )吡啶酮 ]引起反刍家畜脱
毛、流涎、甲状腺胛大、生长发育迟缓、生产性能下降、消瘦、步态失调直至死亡等多种毒性反
应 [3～ 5 ]。
汪儆等 ( 1992)首次发现我国广西涠洲岛黄牛、山羊瘤胃液 (“涠洲瘤胃液” )可降解含羞草
素和 3, 4-DHP[6 ]。 谭蓓英等 ( 1994)从“涠洲瘤胃液”中分离出三种脱毒细菌 ,并鉴定为牛链球
菌、生孢梭菌和乳杆菌属的一个种 [7 ]。 将“涠洲瘤胃液”灌入反刍家畜瘤胃后 ,用银合欢饲喂反
刍家畜 ,不但不引起中毒 ,而且可取得良好的饲养效果 (汪儆等 , 1994) [ 8]。
含羞草素在“涠洲瘤胃液”脱毒细菌的作用下的降解途径 ,迄今国内外尚未见详实的报道。
本研究旨在探讨上述问题 ,为银合欢脱毒利用技术提供理论上的说明。
1　材料与方法
1. 1　“涠洲瘤胃液”脱毒细菌
取自一灌注过“涠洲瘤胃液”的健康阉公绵羊。 该羊大量采食银合欢已不中毒。临用前用
胃管抽取其瘤胃液作为脱毒细菌菌源。操作过程尽量迅速 ,注意隔氧。
　　* 　本研究为国家自然科学基金资助项目。
　　* * 　广西畜牧所杨家晃副研究员、广西北海市农牧局黄增法高级兽医师、王运芳兽医师协助采集“涠洲瘤胃液” ,特此
致谢。
　　* * * 　收稿日期　 1997-03-31。
1. 2　厌氧培养基
1. 2. 1　含羞草素降解培养基 (培养基Ⅰ )　成分如表 1。
表 1　含羞草素降解培养基成分
Table 1　 The composition of mimosine-degrading cultrue media
无机盐溶液
Ⅰ *
M ineral
solutionⅠ
( ml /L)
无机盐溶液
Ⅱ *
Mineral
solutionⅡ
( ml /L)
瘤胃液* *
Ruminal
fluid
( ml / L)
含羞草素
* * *
M imosine
( g / L)
半胱氨酸
盐酸盐
Cys· HCl
( g /L)
酪蛋白胨
Casein
peptone
( g /L )
酵母浸提物
Yeast
ex tract
( g /L )
无水碳酸钠
Na2CO3
( g /L )
75 75 200 0. 4 0. 5 10 2. 0 4. 0
　　注: *无机盐溶液Ⅰ ( g /L ): K2HPO4 , 6;无机盐溶液Ⅱ ( g / L): KH2PO4 , 6; ( N H4 ) 2 SO4 , 12;
CaCl2· 6H2O, 1. 2; NaCl, 12; MgSO4· 7H2O, 1. 2。
* * 瘤胃液:采自河北省大厂县华联屠宰厂黄牛。 宰前饲喂干草和谷物。
* * * 含羞草素: Sigma Chemical Co. USA。
1. 2. 2　 2, 3-DHP( 2, 3-二羟吡啶 )降解培养基 (培养基Ⅱ )　成分如表 2。
表 2　 2, 3-DHP降解培养基成分
Table 2　 The composit ion of 2, 3-DHP degrading culture media
无机盐溶液Ⅰ *
Minera l solutionⅠ
( ml /L)
无机盐溶液Ⅱ *
Mineral so lutionⅡ
( ml /L )
瘤胃液*
Ruminal fluid
( ml /L )
氯化钠
NaCl
( g /L)
无水碳酸钠
Na2 CO3
( g /L )
75 75 300 3. 0 1. 0
　　注: * 无机盐溶液Ⅰ 、Ⅱ和瘤胃液均同表 1。
1. 3　接种培养方法
一切操作均按 Hunga te严格厌氧技术进行 [9 ]。
研究含羞草素降解途径时 ,先将培养基Ⅰ厌氧分装于 6个 100m l血清瓶中 ,每瓶 49. 0ml ,
通好二氧化碳后立即盖严瓶口 ,包扎 , 113℃灭菌 30min。然后厌氧接入脱毒细菌菌源 1. 0ml ,
瓶号依次编为 0～ 5号 ,置 39℃培养箱中培养。
研究 2, 3-DHP降解途径时 ,取 200ml培养基Ⅱ ,按 0、 0. 25、 0. 50、 1. 00、 1. 50mg /ml的浓
度加入 2, 3-DHP( Sigma Chemical Co. U SA)培养基厌氧分装于 4个 100ml血清瓶中 ,每瓶
49ml ,剩余的培养基分装于 1支 10m l试管中。同上灭菌后 ,分别于血清瓶和试管中厌氧接种
1. 0ml和 0. 1ml脱毒细菌菌源 ,同上培养。
1. 4　降解产物监测
1. 4. 1　含羞草素降解产物监测:采用高效液相色谱法进行。先从“ 0”号瓶中间隔 3～ 20h取样 ,
每次 2ml ,取样时注意尽量避免进入气泡。样品 5000r /min离心 10min,上清液通过 0. 45μm微
孔膜过滤 ,高效液相色谱法测定含羞草素、 3, 4-DHP和 2, 3-DHP浓度。 三种化合物中一种或
几种化合物浓度变化较明显时 ,立即分别从 1～ 5号瓶中同上法取样 (即重复数 n= 5) ,测定含
羞草素、 3, 4-DHP和 2, 3-DHP浓度。
3334期 汪　儆等: 含羞草素降解途径的研究
高效液相色谱条件如下: 仪器: Waters 201DC,紫外检测器 M-490型 ,数据处理机 M730
型 ; 色谱柱: μ Bondapdk C18, 30cm× 0. 4cm ( 8～ 10μ) ; 检测波长: 280nm; 流动相: 2%
N H4HPO4水溶液 ,用正磷酸调 pH至 2. 4;流速: 5μl;含羞草素和 2, 3-DHP标准品: Sigma
Chemical Co. USA; 3, 4-DHP:美国 NADC, ARS, USDA, M. J. Al li son博士赠。
1. 4. 2　 2, 3-DHP降解产物监测: 视测定项目不同分别采用气相色谱法、高效液相色谱法和蒸
馏滴定法进行。培养 2d后 ,每间隔 24h ,分别从各试管中抽取 0. 2ml培养基液 ,加入 0. 06% Fe-
Cl3· 6H2O的 0. 02mol /LHCl溶液 2. 0m l,进行目视比色 ,如呈无色 ,立即停止各血清瓶培养。
并取各血清瓶样品进行分析测试 ,测试方法如下。
　　挥发性脂肪酸 (乙酸、丙酸、丁酸 )测定: 采用气相色谱法测定。 吸取 5ml样品 , 1000r /min
离心 10min,取上清液 3. 0ml,加入 3mol /L H2 SO4 2滴 ,甲酸 0. 15m l,进样。气相色谱条件如下:
仪器: SP-2305型 ,北京分析仪器厂 ;检测器: 氢火焰检测器 ;柱长: 1m× 3mm;固定相: GDX-
103,经 2% H3 PO4处理 , 60～ 80目 ;载气: N2 ;载气流速: 30ml /min;氢气流速: 50m l /min;空气
流速: 350m l /min;柱温: 170℃ ;进样口温度: 160℃ ;检测口温度: 180℃ ;进样体积: 2μl。
气体检测:用气相色谱法测定血清瓶上部空间中 CO2和 CH4的摩尔浓度数。 气相色谱条
件如下: 仪器 SP-2304A型 ,北京分析仪器厂 ;检测器: 热导检测器 ;柱长: 2m× 5mm;柱温:
40℃ ;固定相: GDX-104, 60～ 80目 ;载气: H2;载气流速: 40ml /min;进样体积: 50μl。
2, 3-DHP测定:从血清瓶中取 2m l培养液 ,同 1. 4. 1方法测定。
氨态氮: 蒸馏滴定法。从血清瓶中取 2ml培养液注入消化管中 ,加 2g轻质氧化镁 ( 500℃锻
烧 )和 25ml蒸馏水 ,蒸馏。 用 2%硼酸吸收 ,再用稀 HCl(浓度约为 0. 025mol /L滴定 )。
1. 5　数据处理　采用 SGW IN软件进行显著性检验及线性回归相关分析。
2　结果与讨论
2. 1　含羞草素降解中间产物　不同培养时间含羞草素、 3, 4-DHP、 2, 3-DHP浓度的变化见图
1。
图 1　不同培养时间含羞草素、 3, 4-DHP、 2, 3-DHP浓度的变化
Fig. 1　 The change of concentra tion o f mimosine, 3, 4-DHP and 2, 3-DHP
in differ ent cultiv ation time
334 畜　牧　兽　医　学　报 29卷
含羞草素的降解途径 ,国内外报道甚少 ,一般认为含羞草素可以在银合欢叶片中与之共存
的酶或反刍动物一般瘤胃微生物的作用下 ,脱去丙氨酸 ,生成 3, 4-DHP。 Ford等 ( 1984) [ 10]报
道 ,接种 DHP降解细菌的反刍家畜瘤胃中 ,既可检测到 3, 4-DHP,又可检测到 2, 3-DHP,此两
种产物究竟孰先孰后 ,还是同时产生 ,现有文献只见一些相互矛盾的报道 ,有的报道还仅仅是
推测或假设 [11 ]。
由图 1可以看出 , 0～ 60h,含羞草素浓度从 20. 07mmol /L降至 0. 4mmol /L,而 3, 4-DHP
则从 0mmol /L升至最高点 16. 86mmol /L。 60～ 120h, 3, 4-DHP从最高点 16. 86mmol /L降至
3. 47mmol /L ,而 2, 3-DHP则从 0mmo l /L升至最高点 5. 65mmol /L。 120～ 168h, 3, 4-DHP由
3. 47mmol /L降至最低点 0. 62mmo l /L, 2, 3-DHP也由最高点 5. 65mmo l /L降至 0mmo l /L,该
阶段含羞草素浓度仅维持在 0. 2mmol /L左右。可见 ,含羞草素在降解过程中 ,在 3, 4-DHP生
成的很长一段时间内无 2, 3-DHP产生。 60h,含羞草素降至极微量水平 ,仍未检测到 2, 3-
DHP。随后在 3, 4-DHP浓度逐渐下降的过程中 , 2, 3-DHP浓度才逐渐增加 ,在 144h后基本上
只有 2, 3-DHP存在 ,最后三者均消失。因此可清楚地说明 ,含羞草素首先全部水解生成 3, 4-
DHP,然后 3, 4-DHP再转变为 2, 3-DHP。推测脱毒细菌产生的变位酶 ,使 3, 4-DHP分子发生
异构化重组 ,生成 2, 3-DHP,即:
含羞草素 脱毒细菌或一般瘤胃细菌
(水解酶 ) 3, 4-DHP
脱毒细菌
(变位酶 ) 2, 3-DHP
2. 2　 2, 3-DHP降解终产物　由厌氧试管逐日取样分析发现 ,培养 5d后 ,各试管培养基目视
比色均呈无色 ,显示其中 2, 3-DHP已全部被降解 ,此时用高效液相色谱检测 ,培养基中 2, 3-
DHP的浓度也均为 0,此时各降解产物平均摩尔数如表 3。
表 3　不同处理血清瓶中各物质的摩尔浓度
Table 3　 The concentration of compounds in culture media
with dif f erent 2, 3-DHP concentration (mmol /L)
处理 , T reatment
[2, 3-DHP( mg /mL ) ]
0 0. 25 0. 50 1. 00
1. 50
乙酸 , Acetic acid 1. 281bCDE 1. 547aCDE 1. 794ABDE 2. 185ABCE 2. 764ABCD
丙酸 , Propionic acid 0. 346DE 0. 403 0. 420 0. 501A 0. 487A
丁酸 , But yric a cid 0. 198bCDE 0. 244aDE 0. 291aDE 0. 413ABCe 0. 487ABCd
　　　 NH3 0. 306CDE 0. 324CDE 0. 357ABDE 0. 417ABCE 0. 500ABCD
　　　 CO2 0. 000bCDE 0. 016ACDE 0. 038ABDE 0. 051ABCE 0. 080ABCD
　　　 CH4 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
　　注: 1. 规定各处理代号: 0: a ( A)、 0. 25: b( B)、 0. 50: c( C)、 1. 00: d( D)、 1. 50: e ( E) ;平均数右上角标有某组
代号时 ,表明某组与本组之间有差异:小写代号 P < 0. 05,大写代号 P < 0. 01,未标某组代号表明该
组与某组之间无明显差异 ( P> 0. 05)。
2. 各处理重复数 n= 4。
No te: 1. The code o f each t reatment: 0: a ( A)　 0. 25: b( B)　 0. 50: c ( C)　 1. 00: d( D )　 1. 50: e ( E); If
ther e is a code o f a tr ea tment in the superscript o f a v alue, ther e is significant differ ence betw een
the tw o treatments: sma ll let ter code P < 0. 05, capita l letter code P< 0. 01. If there is no code of
3354期 汪　儆等: 含羞草素降解途径的研究
a treatment in the superscript o f a v alue, ther e is no significant differ ence be tween the tw o tr ea t-
ments( P> 0. 05) .
2. The number o f repeats o f each t reatment: n= 4.
由表 3可以看出: 0、 0. 25、 0. 50mg /ml三组间及 0. 25～ 1. 50mg /m l各组间丙酸的摩尔数
差异均不显著 ,即尽管培养基中 2, 3-DHP浓度不断增加 ,而丙酸的摩尔数不随之增加 ,说明丙
酸不是 2, 3-DHP的降解产物。各瓶中均未检测出甲烷 ,故甲烷也非 2, 3-DHP的降解产物。但
随培养基中 2, 3-DHP浓度和降解量的增加 ,乙酸、丁酸、 NH3、 CO2的摩尔数基本呈一致性变
化 ,表现为显著性 ( P < 0. 05)或极显著性 ( P< 0. 01)增加。对乙酸、丁酸、 NH3、 CO2的摩尔数与
培养液中 2, 3-DHP浓度的变化作回归方程和相关分析 ,并进行显著性检验 ,结果见表 4。
表 4　乙酸、丁酸、 CO2和 NH3随 2, 3-DHP浓度变化的回归方程
Table 4　 The regression equation of acetic acid, butyric acid,NH3 , CO2
concentrat ion with 2, 3-DHP concentration
化合物
Compounds
回归方程
Reg ression equation
相关系数
Cor relation
coefficient
显著性
Significance
乙酸 , Acetic acid Y乙酸 ( mmol ) = 1. 289+ 0. 965X2, 3-DHP( mg /ml) r= 0. 97 p < 0. 001
丁酸 , But yric a cid Y丁酸 ( mmol ) = 0. 196+ 0. 198X2, 3-DHP( mg /ml) r= 0. 95 p < 0. 001
NH3 YNH3( mmol ) = 0. 297+ 0. 131X2, 3-DHP( mg /ml) r= 0. 98 p < 0. 001
CO2 YCO2(mmo l) = 0. 003+ 0. 051X2, 3-DHP( mg /ml ) r= 0. 98 p < 0. 001
　　表 4的结果表明 ,乙酸、丁酸、 NH3、 CO2的摩尔数与 2, 3-DHP浓度变化呈较强的正相关
( r= 0. 95～ 0. 98) ,显著性水平达 P < 0. 001。由此可以初步推论 ,乙酸、丁酸、 NH3和 CO2是 2,
3-DHP在“涠洲瘤胃液”脱毒细菌作用下的终产物 ,即:
O H
OH
+ H2O
脱毒细菌
(裂解酶 ) CH3 COOH
+ CH3 CH2 CH2 COOH+ CO2+ NH3　　　　　　　　 ( 2, 3-DHP)
含羞草素、 3, 4-DHP和 2, 3-DHP被某些微生物降解可能归因于这些微生物分泌产生的
酶的作用。含羞草素、 3, 4-DHP和 2, 3DHP可能是分别被三种不同的酶 (水解酶、变位酶和裂
解酶 )降解或转化。 Tangendja ja等 ( 1985) [12 ]推测这些酶只存在细菌细胞体内 ,而不分泌到培
养液中 ,即胞内酶。 3, 4-DHP首先须在 3, 4-DHP变位酶作用下转化成 2, 3-DHP,再在 2, 3-
DHP裂解酶作用下进一步降解。 3, 4-DHP转化为 2, 3-DHP的异构化作用可能大大降低了
DHP苯环开环降解所需要的活化能 ,因而有利于降解过程的完成。
3　结　论
含羞草素在“涠洲瘤胃液”脱毒细菌的作用下 ,首先降解生成 3, 4-DHP,然后再转变为 2,
3-DHP这一中间代谢产物进一步降解 ,乙酸、丁酸、二氧化碳和氨等无毒化合物可能是 2, 3-
DHP的最终降解产物。
336 畜　牧　兽　医　学　报 29卷
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Wang Jing1 , Yi Jundong2 , Lei Zuyu1 , Feng Xueqing1 , Yu Yianhu2
( 1Inst itute of Animal Science,Chinese Academy of Agricul tural Sciences ,
Beij ing 100094;
2
Department of Animal Science, Huazhong Agricultural
Universi ty ,Wuhan 430070)
Abstract
In this experiment, deg rading route of mimosine in Leuceana leucocephela was studied in
v itro under the action o f“Weizhou rumen fruid” deto xification bacteria. The experimental re-
sul ts are as follows: Under the action of detoxi fica tion bacteria, mimosine is deg raded to 3, 4-
DHP at fi rst; Then, 3, 4-DHP is conver ted to 2, 3-DHP; Non-toxic compounds such as acetic
3374期 汪　儆等: 含羞草素降解途径的研究
acid, buty ric acid, carbon dioxide and ammonia may be the final ma taboli tes o f 2, 3-DHP.
Key words　 Mimosine, Deg rading route,“Weizhou rumen fruid” , Detox ification bacteria
338 畜　牧　兽　医　学　报 29卷