全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，1 4(4)：327—332
Journa／ofTropical and Subtropical Botany
大豆初生幼苗多胺氧化酶活性的细胞化学定位
覃广泉，何生根 ，王明祖，
(仲恺农业技术学院，广州 510225)
林启彬
摘要：对大 (GZycine mox(L-)Merril1)“垦农 4号”萌发种子和初生幼苗中的多胺氧化酶 (polyamine oxidase，PAO，
EC 1．4．3．6)的活性和分布进行了研究。结果表明，PAO活性仅在种子萌发起始后 (吸胀后 24 h)才检测到，然后随着
种子萌发进程，PAO活性快速升高。但是，在萌发种子 (吸胀后 72 h)和初生幼苗 (吸胀后 120 h)中，PAO活性在各器
官中的分布有明 差异。在萌发种子中，PAO活性在胚根最高 (5．17-*0．91 Ug-iFW)，胚轴次之，胚芽再次之，子叶活性
最低 (O．12~0．03U FW)；在初生幼苗中，PAO活性在下胚轴中最高 (5．47+_0．66U glFW)，幼根次之，顶芽再次之，子
叶最低 (0．10+_0．03 U g‘TW)。这种差异对种子萌发和幼苗形态建成有积极意义。运用细胞化学定位在透射电镜下观察
初生幼苗 PAO在各部位的分布，发现 PAO主要定位在顶芽细胞的液泡膜上、子叶细胞的细胞壁及其外侧表面、下胚
轴细胞的细胞壁及其表而，且 PAO与细胞壁表面结合较紧；根细胞的细胞壁、细胞间隙、细胞膜、液膜上均有分布，但
以液泡膜分布居多。本研究结果进⋯步证实了 PAO在细胞壁和细胞间隙有着较广泛的分布。首次报道 PAO在细胞膜
和液泡膜上有分布。
关键词：大豆；多胺氧化酶；幼苗；细胞化学定位
中图分类号：Q946．54 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2006)04—0327—06
Activity and Cytochemical Localization of Polyamine Oxidase
in Soybean Seedlings during Early Growth
QIN Guang—quan， HE Sheng-gen ， WANG Ming-zu， LIN Oi-bin
(Zhon~a／University ofAgriculture and Technology，Guangzhou 510225，China)
Abstract：Activity and cytochemical localization of polyamine oxidase(PAO，EC 1．4．3．4)were studied in the
young seedlings of Kennong 4 of Glycine r／zo~ (L．)Meril1．PAO activity was undetected in the seeds until 24 h
after imbibition，and increased during seed germination．However，the activity in various organs was significantly
diferent in distribution between the germinating seeds(after 72 h of imbibition)and the young seedlings(after
120 h of imbibition)． In the germ inating seeds，PAO had the highest activity in radicles (5．17+_0．91 u g-,FW)，
folowed by embryonal axis，embryonic bud，and lowest in cotyledons(0．1 2+_0．03 U g-’rW)．In the young seedlings，
PAO showed the maximum activty in hypocotyls(5．47+_0．66 U gIFW)，folowed by juvenile root，apical bud，and
lowest in cotyledons f0．1 0+0．03 U g．1FW)．The diferences of PAO activity in distribution presum ably had positive
efects on seed germ ination as wel as seedling morphogenesis． PAO localization was determ ined in various parts
of the youn g seedlings by using a cytochemical technique and tran smission electron microscope．PAO was present
mainly on vacuole membrane in apical bud cells， cell wal of both coty ledons and hypocotyls as wel as on its
surface．In hypocotyls，PAO closely attached to the surface of cel wall，while in root cells，it appeared in cell wall，
intercellular space， on cell membrane， an d especialy on vacuole membran e． Th e results confirm ed that PAO
收稿日期：2006—05—17 接受日期：2006—06．09
基金项目：广东省自然科学基金项目(001425)：广东省教育厅优秀人才培养基金项目(QO2041)资助
}通讯作者 Coresponding author
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328 热带亚热带植物学报 第 14卷
widely spread in cel wall and intercellular space．M oreover，to the author’S best knowledge，PAO was found on
cel membrane and vacuole membrane for the first time．
Key words：Soybean(Glycine max)；Polyamine oxidase；Seedlings；Cytochemical localization
多胺 (polyamines，PAs)是生物体代谢过程中产
生的具有较高生物活性的低分子量脂肪族含氮碱，
常见的有腐胺 (putrescine)、尸胺 (cadaverine)、亚
精胺 (spermidine)和精胺 (spermine)等【”。二十世
纪 60年代美国耶鲁大学的 Galston研究小组率先
开展植物 PAs的生理效应研究，迄今国内外已有不
少研究结果证实多胺与植物的生长发育有着密切
的关系，认为 PAs是一类新型的植物生长调节物
质，但对其确切的生理功能和作用机制目前仍不清
楚【 。
值得注意的是，一些研究者报告种子萌发和幼
苗形态建成过程存在着活跃的多胺氧化代谢过程，
具体表现在催化 PAs降解的关键酶一多胺氧化酶
(polyamine oxidase，PAO)活性在此阶段有着非
常明显的变化[5-7]。在吸胀而未萌发的水稻 (Oryza
sat&aL．)[81、小扁豆 (Lens culinaris Medic．)[9]、豇豆
(Vigna unguiculata L．)【 明和花生 (A rachis hypogaea
L．)【”】等种子中缺乏PAO活性，萌发起始后 PAO活
性即出现并随着幼苗的形态建成过程快速提高，达
到峰值后又逐渐下降。关于种子萌发过程中多胺氧
化代谢的生理功能，目前尚无明确的结论，归纳起
来，主要有 4个方面：(1)催化 PAs氧化降解 ，调
节种子萌发过程中细胞 PAs水平【 I56】；(2)催化 PAs
氧化时产生的 H2o：参与细胞壁建成【 ，4]；(3)动用
种子中贮存的 PAs作为种子萌发和幼苗生长阶段
的氮源和碳架，即：PAs经 PAO氧化代谢转变成 y^．
氨基丁酸(_y．aminobutyric acid)，后者可进一步转变
成琥珀酸和丙氨酸 ，5】；(4)催化 PAs氧化时产生
的H2o：和氨基醛抵御病原微生物 【，．-61。
种子萌发和幼苗形态发生是植物个体发育的
重要阶段，前人虽然对该过程中多胺氧化代谢进行
了一些研究，但目前还仅限于极少数的植物种类，
而且不同植物种子萌发过程中PAO的时空特点存
在较大差异flJ。对此阶段 PAO生理功能的认识还基
本上处于推测阶段，缺乏令人信服的证据。另外，大
豆是世界上栽培面积最大的食用豆类作物，也是我
国一种重要的经济作物。本试验拟研究其种子萌发
和早期生长阶段 PAO活性的时空特点，并首次运
用酶组织化学法对其初生幼苗中的PAO进行了细
胞化学定位，旨在为阐明该酶在种子萌发生长过程
中的时空规律和生理功能提供参考。
1材料和方法
试验材料 所用材料为当年收获的“垦农 4
号”大豆 (Glycine，麟 (LI)Merri1)，由黑龙江八一
农垦大学提供。
种子萌发 将大豆种子 (每组 30粒，3个重
复)用 1％(w／w)的NaCIO消毒 15 min，蒸馏水冲
洗 5次，浸泡 12 h，然后置于蒸馏水润湿的滤纸
上，在光照培养箱中萌发，温度 28+1 oc，8 h光照
(90 mol m-2s- )，以胚根突破种皮约为5 rnln作为
萌发标准。
种子和幼苗各部位 PAO的提取 按照何生
根等【 o]的方法并略作修改，在大豆种子吸胀 (吸胀
时间为 12 h)和吸胀后 72 h取胚芽、子叶、胚轴和
胚根，吸胀后 120 h取顶芽、子叶、胚轴和根等部位，
各称取一定量，按 1 g(FW)：5的比例加入磷酸缓
冲液 (PBS，0．I mol／L，pH7．0)，冰浴条件下充分研
磨，用 g层脱脂纱布过滤，取滤液离心 (10 000xg，
20 min，4~C)，上清液为PAO粗提液，置于冰浴中保
存备用。
PAO活性测定 按照 Angelini等【 2]的方法
并略作修改，反应混合液含 1．2 ml PBS(0．I mol／L，
pH7．O)，0．2 ml愈创木酚 (25 mmol／L)，0．2 ml过氧
化物酶溶液 (500 Ixg L- )及 0．2 ml酶提取液 (测定
子叶时为0．5 ml酶提取液)。混合液在 30℃水浴中
保温 5min，加入 0．2ml腐胺 (Put，10mmol／L)启动
反应，并用Beckman DU640 UV分光光度计连续测定
波长 470nnl处光密度值的变化，以0．01／IOD4 min-1
为 1个酶活力单位 (U)。
PAO细胞化学定位 参照 Maini等【，7】的方
法，按以下步骤操作：1)取萌发 5 d的大豆初生幼
苗，用刀片切取顶芽、子叶、胚轴和根立即放入 戊二
醛中固定 24 h；2)用 0．1 mol／L磷酸缓冲液 (pH7．0)
洗涤 5次，每次 20 min；3)洗涤后孵育 30—60 min
(孵育液组成 ：10 mmol／L CeCI3(氯化铈 )2 ml，
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第4期 覃广泉等：大豆初生幼苗多胺氧化酶活性及细胞化学定位 329
10 mmol／L腐胺 2 ml，0．1 mol／L pH7．0磷酸缓冲液
1 ml，设置对照不加腐胺，内含磷酸缓冲液 3 m1)；
4)用磷酸缓冲液 (同上)洗涤 2次，每次 15 min；
5)用 1％锇酸固定 3h；6)再洗涤 1 h，每次 10min：
7)系列酒精脱水，环氧丙烷过渡，Epon812包埋
过夜 ；8)LKB ll800 pyramitome修片，Reichert
Ultracut超薄切片；9)醋酸双氧铀与柠檬酸铅双染，
JEM1010透射电镜观察拍照。
2结果和分析
2．1大豆种子萌发生长过程中PAO活性的变化
吸胀而未萌发的种子测不到 PAO活性，直到
萌发起始 (胚根突破种皮)后才开始检测到 PAO活
性。分别测定萌发种子 (吸胀后 72 h)和初生幼苗
(吸胀后 120h)各部位的PAO活性表明(表 1)：在
萌 发 种 子 中 ，PAO 活 性 在 胚 根 最 高 (5．17-t
O．91 U g- FW)，胚轴次之，胚芽再次之，子叶活性最
低 (0．12+0．03 U g-·FW)；在初生幼苗中，PAO活性
在胚轴中最高 (5．47~0．66 U g-·FW)，根次之，项芽
再次之，子叶最低 (0．10~0．03 U g-·FW)。
裹 1大豆萌发种子(吸胀后 72 h)和初生幼苗
(吸胀后121h)中PAo的活性
Table l PAO activities in germinating seeds(72 h after imbibition)
and in young seedlings(120 h after imbibition)ofsoybean
萌发种子Germ inating seeds 幼苗 Young sedlings
部位
Plantparts
PA0
(U g-lFW)
部位
Plan tparts
PAO
fU g。 FW)
2．2大豆初生幼苗 PAo的细胞化学定位
电镜观察大豆初生幼苗 (吸胀后 120 h)各部
位 PAO的细胞定位表明：在顶芽细胞中，铈沉淀在
液泡膜上分布明显 (图版 I：l，2)，即 PA0主要定
位在液泡膜上；在子叶细胞中，PAO主要定位在细
胞壁及其外侧表面 (图版 I：3，4)；在下胚轴细胞中，
PAO也是定位在细胞壁及其外侧表面 (图版 I：5，6)，
但铈沉淀紧贴在细胞壁表面，且沉淀颗粒较粗即下
胚轴细胞中的PAO与细胞壁表面结合较紧，活性
也高；在根细胞中，铈沉淀在细胞壁、细胞间隙、细
胞膜、液泡膜均有分布，但以液泡膜上最为明显 (图
版 I：7，8)，即PAO在根细胞中分布较广，但以液泡
膜分布居多。
3讨论
已有研究显示，PAO在种子萌发后出现并随着
幼苗的形态建成而快速升 n。本试验用大豆为材
料，吸胀未萌发的大豆无 PAO活性，直至萌发起始
后才检测到活性，这与所报道的其它植物 PAO活
性的发生规律是一致的。本试验还表明，在种子萌
发阶段 (吸胀后 72 h)，PAO活性主要分布在胚根
和胚轴，尤以胚根为最高 (表 1)。但随着萌发的进
行，大豆初生幼苗 (吸胀后 120 h)胚轴 PAO活性
上升最高，其次是根，项芽PAO活性也略有上升，但
子叶的PAO活性变化不大，一直很低 (表 1)。在大豆
萌发阶段 (吸胀后 72 h)，胚根 PAO活性最高，我
们认为这种分布对种子萌发和幼苗形态建成有积
极意义。在萌发之初，胚根最早出现 PAO活性，
PAO可催化多胺生成 H2o ，而 H2o 参与细胞壁木
质化过程[12-14】，有利于胚根扎入土中。随着萌发过程
的进行，胚轴中 PAO活性显著升高，胚轴木质化加
快，从而有利于胚轴出土。
研究 PAO在植物组织和细胞中的定位有助于
探讨该酶的生理功能。从已有文献报道来看，PAO
在细胞壁有着广泛的分布。Kaur．Sawhney等[181报
道，燕麦 (Avena sativaL．)幼叶 PAO活性随着纤维
素酶对细胞壁的溶解而失去活性，并随着细胞壁再
生而恢复活性并逐渐提高。Angelini等【 9】研究表明，
鹰嘴豆 (Cicer arietinum L．)胚轴 PAO主要存在于
经历木质化或胞壁硬化的组织中，如木质部、厚壁
组织和表皮。Slocum和 Fureyt∞】研究豌豆 (Pisum
sativum L．)上胚轴和根中 PAO的亚细胞分布时发
现 ，根中 PAO主要定位于皮层细胞壁的胞间层
(middle lamela)部分，上胚轴 PAO的活性则与维管
组织细胞密切相关。在本试验中，我们采用氯化铈
法分别对大豆初生幼苗 (吸胀后 120 h)的项芽、子
叶、下胚轴和根部的PAO进行细胞化学定位 (图版
I)，在下胚轴细胞和子叶细胞中，PAO主要定位在
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330 热带亚热带植物学报 第 l4卷
细胞壁及其外侧，其中，下胚轴细胞壁外侧的 PAO
与细胞壁表面结合紧密，活性也高，而子叶细胞壁
外侧的 PAO则是松散地分布在细胞壁的表面附
近；在顶芽细胞中，PAO主要定位在液泡膜上；在根
细胞中，PAO在细胞壁、细胞间隙、细胞膜、液泡膜
均有分布，但以液泡膜分布居多。迄今，关于植物
PAO液泡膜上的分布和定位尚未见文献报道。关于
细胞壁上 PAO的生理功能，一些学者认为：胞壁质
外体在生理上需要较高的H2o 产生，以驱动过氧
化物酶 (POD)催化的胞壁多聚体酚类残基的氧化
交联和木质化的形成，而经 PAO催化产生的H2o2
可作为 POD的底物，参与木质素的合成，有助于细
胞壁硬化和幼苗出土 ，另外还可能参与伤口愈
合和抵抗病原体侵入过程[-司；至于液泡膜上 PAO的
生理功能目前尚不清楚，笔者推测可能与其多胺底
物往往贮于液泡[ 3,21】有关。Matilat6~曾提出，经由
PAO催化的多胺氧化代谢途径可动用种子中丰富
的PAs作为种子萌发和幼苗生长阶段的氮源和碳
源，即：PAs经 PAO氧化代谢转变成 y^一氨基丁酸
(^y—aminobutyric acid)，后者可进一步转变成琥珀酸
和丙氨酸。
Frebort等 用特异抗体的组织免疫法发现，
黑曲霉 (Aspe唧lus n r)AKU3302的AO(aliline
oxdase，胺氧化酶)定位于细胞壁内部而非外层表
面，并且观察到细胞内分泌泡结构也有 AO存在。
他们指出可能存在两种形式的AO蛋白，无活性的
A()-I存在于细胞内，而有活性的AO—I是定位在
质外体包括细胞间隙。无活性的AO—I可能是 PAO
错误折叠的前体，有氧时在细胞内自动生成并获得
低水平的活性。令人感兴趣的是，组织化学定位的
试验结果显示大豆子叶细胞液泡膜上有较丰富的
PAO存在，但我们实际测得子叶的PAO活性却极
低，这是否意味着子叶细胞液泡膜上的大量 PAO
也是一种无活性或低活性的 PAO前体或原酶形式
呢?另外，Cona等[I4】研究表明，玉米(Zea mays L．)中
胚轴表皮 PAO基因的表达受光的促进，是一个依
赖光敏素转录激发子所介导的过程。可见，PAO的
细胞定位在不同的生理条件下也会存在差异。我们
认为，这种 PAO活性分布的时空差异在一定程度
上显示出PAO生理功能的复杂性。
致谢 在 PAO细胞化学定位及电镜观察中得到了中国科
学院华南植物园徐信兰同志的指导和帮助，在此深表感谢。
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图版说明
图版 I
CM：细胞膜：CW：细胞壁：IS：细胞间隙：v：液泡：VM：液泡膜。
1．对照，顶芽细胞：Bar=200nm
2．顶芽细胞液泡膜的 PAO分布：Bar：200nm
3．对照，子叶细胞壁及细胞间隙：Bar：200nm
4．子叶细胞壁及细胞间隙的 PAO分布：Bar：200mTl
5．对照，下胚轴细胞壁及细胞间隙：Bar：200ntn
6．下胚轴细胞壁及细胞间隙的PAO分布：Bar：200 nln
7．对照，根细胞壁及细胞间隙：Bar：200 nln
8．根细胞壁 、细胞间隙、细胞膜 、液泡膜上 PAO的分布 。 Bar：
500 nln
Explanation ofplate
PlateI
CM ：Cdl membrane；CW ：Cell wall；IS：Intercellular space；
V：Vacuole；VM ：Vacuole memebrane．
1．Contro1．apicalbudcell；Bar：200nrn
2．Distribution of polyam ine oxidase in vacuole memebrane of apical
bud cell；Bar ：200nm
3．Control，cell wall and intercellular space of cotyled on cells；Bar=
2o0nrfl
4．Distribution ofpolyamine oxidase in cell wall and intercellular space
ofcotyledon cels；Bar：200 nln
5．Control，cell wall and intercellular space of hypocotyl cells；Bar=
2o0nln
6．Di stribution ofpolyam ine oxidase in cell wall and intercellular space
ofhypocotyl cels；Bar：200nm
7．Control，cellwallandintercellular spaceofroot cells；Bar：200ILrfl
8．Distribution ofpolyam ine oxidase in cell wall，in intercellular space，
on eell mem brane and on vacuole mem ebrane of ro t eelIs．Bar=
5O0ILrfl
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33：
镛
热。 业热措机物
●
第 l4卷
堕
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