全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(3)：229—232
Journa／ofTropical and Subtropical Botany
灵芝浸出液在香蕉组织培养中的抑菌作用
蘑踊淑
(遵义医学院珠海校区生物化学及细胞分子生物学教研室，广东珠海 519000)
摘要：设计不同浓度的灵芝浸出液培养基，以香蕉 (Musa sapientum L．)作为培养材料，通过定量接种不同种类的细菌及
真菌以观察灵芝浸出液的抑菌效果。结果表明，采用野生灵芝 l0 g于 l 000 ml蒸馏水中煮 2 h的浸出液配制的培养
基．不仅能使香蕉正常生长，而且已感染细菌的材料经一段时间培养后，细菌污染消失，恢复正常。研究结果对于香蕉
转基因操作以及完善组织培养技术具有重要的参考意义。
关键词：真菌：灵芝：香蕉；组织培养；抑菌作用
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2006)03—0229一o4
Inhibitory Efects of Ganoderma lucidum Extraction in
Tissue Culture of Common Banana
TANG LI—bO
(Biochemical and Cel Molecular四 姆 cnf St吗 Room,Zunyl Med&d Colege Zhuhai Campus，Zhuhai 519000，China)
Abstract：The experiments ofthe efects of Ganode几舰 lucidum(Leyss．ex Fr．1 Karst．extract(GLE)on bacterial
inhibition in tissue culture of common banana was carried out by adding various concentrmions of GLE into MS
medium containing 2 mg L～BA and 0．1 mg L～NAA．Explants from absorptive buds of com on banana(Musa
sapientum L．) were used to observe the inhibition of bacteria (Escherichia col I， Saccharomyces cerevisiae，
Staphylococcus ol,reus，Streptomyces griseus andAgrobacterium tumefacieus)，the shooting andthe growth of
plan tlets． It WaS indicated that best bacterialinhibition concentrations of GLE in primary culture an d subcultures
were 5 or 1 0 g Ganode pieces boiled in 1 000 ml distilled water for two hours．However．GLE showed certain
inhibitory effect on shooting，but there was no influence on rooting．
Key words：Fungus；Ganoderma lucidum；Com on banana；Tissue culture；Bacterial inhibition
香蕉(Musa sapientum L．)可作为重要的转基因
植物载体，在香蕉转基因操作中，一般利用农杆菌
作为载体在离体培养条件下转移外源基因．而后添
加抗生素以消除农杆菌的影响，常导致培养材料的
生长受到抑制。
香蕉苗的工厂化生产已成为香蕉育苗的主要
方式，其初代培养外植体主要采用吸芽消毒培养方
式，但吸芽消毒较为困难【 】，而采用常规的升汞处
理，又因内源性的细菌感染常导致消毒不彻底。此
外，在继代培养过程中，如操作不慎，也易导致细菌
收稿 日期 ：2005—11-07 接受 日期 ：2006—02—28
性感染而给种苗生产造成损失。近期有研究表明，
可通过抑菌剂抑制组织培养中的污染 。我们在试
验中发现野生灵芝浸出液具有强烈的抑制细菌作
用，为此，设计了单因子对比试验，对灵芝浸出液的
抑菌效果作一个系统比较，为香蕉组织培养和工厂
化生产提供科学依据。
1材料和方法
1．1灵芝浸出液的制备
采用野生的灵芝 (采于海口市金牛岭公园枯萎
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热带亚热带植物学报 第 l4卷
的马占相思树上)，经形态学及细胞学鉴定，属热带
灵芝 (Ganode lucidum(Leyss．ex Fr)Karst．)。自
然风干 (含水量 l1．2％)，实验分 5个处理：A：灵芝
组织块 1 g，浸于 1 000 ml蒸馏水，煮 2 h，滤去残
渣，用于配制培养基；处理 B、C、D分别称取灵芝组
织块 5、10、15 g，其他过程同处理 A；处理 E：称取灵
芝组织块 10 g，浸于 1 000 ml蒸馏水，浸泡过夜，用
浸出液配制培养基。采用 MS培养基，附加 6-BA
2 mg L-l，NAA 0．1 mg L-l。经常规高温高压灭菌消毒
处理。
1．2菌种
由华南热带植物研究院植保研究所提供，有：
大 肠 埃 希 菌 (Escherichia coli I)，酿 酒 酵 母
(Saccharomyces cerevisiae)， 金 黄 色 葡 萄 球 菌
(Staphylococcus oxtreus)，灰 色 链 霉 菌 (Strepto—
myces griseus)， 根 癌 农 杆 菌 (Agrobacterium
tumefaciens)，接种菌液浓度均为 OD28o：0．5。
1．3方法
采用 3种材料：(1)直接从大田采取香蕉(Musa
sapientum L．)吸芽，用 75％酒精浸泡 10 min进行表
面消毒处理后，接种于不同处理的灵芝浸出液培养
基中，并设置不加灵芝浸出液的MS培养基作为对
照。(2)采用 6代香蕉增殖苗转接在处理 C配制的
培养基中，分别接种上述各种菌种，观察香蕉生长
及抑菌情况。(3)采用第 3代未分化的外植体转接于
处理 C，并设置正常培养基作为对照，以观察灵芝
浸出液对香蕉生长及分化的影响。
所有接种的材料均置于 28~C，光照每天 10—
12 h，pH 5．8，光照强度 2 100 lx下培养。增殖培养
基为 MS+6一BA 2 mg L +NAA 0．1 mg L- +蔗糖 3％+
卡 拉 胶 0．65％ ，根 分 化 培 养 基 为 MS+6-BA
0．1 mg L- +NAA 0．4 mg L- +蔗糖 1．5％+卡拉胶
0．65％+活性炭0．1％。
2结果和分析
2．1空白对照试验结果
直接将各处理及未加灵芝浸出液配制的、不经
过高压灭菌处理的固体培养基各 20瓶置于自然环
境中作空白对照试验，结果表明，未采用灵芝浸出
液的培养基在放置过夜后，就出现 白色的细菌斑
点，处理 A和处理 E在第二天分别有 60％和 70％
出现白色细菌斑点，其他处理均未发现细菌斑(B处
理仅有 5％出现细菌斑)。但在 2 d后所有处理和对
照均出现 白色或绿色霉菌，发生真菌污染。这初步
说明灵芝煮过的浸出液对细菌有一定的抑制作用。
2．2香蕉吸芽初代培养试验结果
将从大田取回的香蕉吸芽用 75％的酒精浸泡
10 min，分别接种于不同的处理中，结果见表 1。
从表 1可见，浸泡过夜的灵芝浸出液(处理 E1
几乎不起作用；处理 B与处理 C效果较好；而处理
A由于灵芝浸出液浓度较低。污染较大；处理 D可
能浓度太高，虽然污染率为 0，但材料经 20 d培养
已经发黑变坏。 因此，灵芝浸出液有一个适宜浓度
范围，即以灵芝风干组织块 5—10 g的浸出液，材料
虽有少量污染，但经过40 d左右的培养，能正常分
化出不定芽，而对照组几乎百分之百污染，其中有
80％是真菌与细菌复合感染。原因可能是香蕉的维
管组织非常发达，采用 75％的乙醇浸泡消毒处理，
表 1 香蕉吸芽初代培养污染率
Table l Infection rate in primary culture for common banana buds
A、B、C和 D处理分别是将 1、5、10和 15 g的灵芝在 1 000ml的蒸馏水中煮 2 h，处理E用 10 g的灵芝在
1 000ml的蒸馏水中浸泡过夜。AB，CandD representtreatmentswith 1，5，10and 15 gofGanodermapieces
boiled in 1 000 ml distilled water for 2 h，respectively，while E represents treatm en
．
t with 10 g Ganoderma pieces
soaking in 1 000 ml distilled water for one night without boiling
． 每个处理接种 20瓶。Twenty culture flasks were
used for inoculation in each treatm ent．
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第 3期 唐历波：灵芝浸出液在香蕉组织培养中的抑茵作用
很难清除维管组织中的内源性细菌感染。本试验结
果表明灵芝浸出液对细菌有强烈的抑制作用，同时
对培养材料也有一定的负面影响。
2．3香蕉增殖苗抑菌效果
将已分化出芽点的组织块转接于处理 C配制
的继代培养基中，每瓶接种 3块 2 cm，左右的组织
块，2 d后，选出无真菌污染的材料 lO0瓶，另选择
未污染的无灵芝浸出液的材料 100瓶作为对照，分
别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、灰色链霉菌、土
壤根癌农杆菌、酿酒酵母。将这些细菌制成细菌悬
液 l0 ml，测定 OD瑚=0．5，接种至培养基中，分别于
第 2天、第 5天、第 7天、第 l0天刮取表面约 1 cm
厚的培养基 ，加入 1O m1无菌水制成悬液 ，静置
5 min滤去固体培养基，在分光光度计中测定其 OD
值，结果见表 2。
通过单因子成对比较试验，将处理与对照进行
比较，除酵母菌以外，其他各种细菌在灵芝浸出液
中均受到显著的抑制作用，紫外分光光度计测定结
果显示，OD值差异均达到显著或极显著水平，同时
随着培养时间的延长，抑菌效应愈显著。
． 灵芝浸出液对革兰氏阴性细菌的抑制效果要
强于革兰氏阳性细菌，但对真菌的抑制效果不显
著。尤其值得关注的是灵芝浸出液对土壤根癌农杆
菌有强烈的抑制作用，因此在香蕉的转基因操作过
程中，可消除农杆菌在继代培养过程中的影响。
2．4灵芝浸出液对香蕉生长分化的影响
设计一个对比实验，分别采用处理 C和未加灵
芝浸出液的培养基，从初代培养开始跟踪观察，一
直考察八代并统计最后出苗数。原始接种瓶数均为
30瓶，每瓶接种 3块组织块，25 d后分别统计出芽
数。灵芝浸出液培养基最终出苗为 245 000株，而未
用灵芝浸出液配制的培养基最终出苗 152 000株，
原因主要为污染率问题 ，前者平均每代污染率为
0．2％，且主要为真菌类污染，后者为 1．5％。
从第三代开始，考察每个组织块新的出芽数，在
转入生根培养基后，考察每株生根数，其结果见表 3。
从表 3可见，灵芝浸出液培养基每代的芽点数
要少于对照，并达到 10％的显著水平，说明灵芝浸
出液对芽的生长有一定的抑制作用，但灵芝浸出液
对生根数无任何影响，同时由于降低了污染率，最
终出苗数高于对照，在大规模种苗生产实践中具有
一 定的参考意义。
3讨论
组织培养中降低污染率是工厂化生产种苗的
关键，采用诸如升汞，次氯酸钠等消毒液处理，在处
理浓度及处理时间上较难掌握，而对于一些内源性
污染材料，就更显得无能为力。香蕉是一类维管束
组织非常发达的外植体材料，接种后 20 d都可出现
细菌污染，因此采用灵芝浸出液结合表面消毒处
表2 灵芝浸出液对培养基中微生物的抑制作用
Table2 Efect(ODvalue)ofculturemedium supplementedwithGanodermaextract(OLE)Oninhibitionofmicroorganisms
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus
aureus
灰色链霉菌
Streptomyces
griseus
根癌农杆菌
Agrobacterium
tumefaciens
酿酒酵母
Saccharomyces
cervisiae
0．42+o．03 0．25+0．05 0．21+0．07 0．18+0．04 0．52：t-0．02 0
．64+0．02 0．73+0．05 0．78+0．07
O．45±0．01 O．38：t~0．02 O．32
_+0．02 O．26_+0．04 O．56
_
+0．02 O．62~0．02 0．68~0．03 O．76~0
．04
0．18：t0．02 0．08：t-0．O1 0．02~0．O1 O
．01~-0．O1 0．52~0．02 0．73
_
+0．05 O．8±0．O2 O．8±0
．O2
O．54±0．01 O．63±0．01 O．72士0．02 O．86
_+0．02 0．56~0．01 0．65~0．01 O．71~0
．O1 O．83±0．01
． 丑．荟 c《 丑 一 一 一 一
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232 热带亚热带植物学报 第 l4卷
表3 灵芝浸出液培养基对香蕉生长分化的影响
Table 3 Efect ofculture medium supplemented with G．h_~idum extract(GLE)on shooting and roting in banana
The extract was obtained by 1 0 g of G．1ucidum pieces in l 000 ml distiled water boiled for two hours
每种处理随机抽取 lO瓶进行统计。Ten culture flasks were randomly selected calculation in each treatment．
理，将大大提高组织培养的成功率。
试验表明灵芝浸出液的功能主要是杀灭细菌，
且对培养材料并没有大的影响，继代培养材料能正
常分化出不定芽，同时，由于降低了污染率，最后出
苗数略高于对照。因此灵芝浸出液可用于香蕉工厂
化生产中污染率的控制。金贻郎等【7J的研究表明，灵
芝含有麦角甾醇、有机酸、氨基葡萄糖、多糖类、树
脂、甘露醇等有效成分，对肺炎链球菌、甲型链球
菌、白色葡萄球菌等均有显著的抑制作用，具有广
谱的抗细菌作用，本实验表明灵芝浸出液对革兰氏
阴性及阳性细菌均有显著的抑制作用，因此，可作
为香蕉组织培养中理想的细菌抑制剂。
在香蕉转基因工程操作中，常利用根癌农杆菌
介导外源基因的转移，在后续的继代培养中，常用
抗生素抑制农杆菌的影响，转基因材料的生长受到
一 定的影响 Ⅻ。本实验结果表明灵芝浸出液对根癌
农杆菌有显著的抑制作用，因此，可作为抗生素的
替代材料应用到香蕉的转基因工程中。
灵芝浸出液虽然有强烈的杀灭细菌作用，但对
真菌类抑制效果不显著，因此还有待寻找真菌抑制
剂，这样就能使组织培养在一个开放的系统中进
行，并能够防止封闭式组织培养中常见诸如玻璃化
的现象，使组织培养成为一项更普通的技术而得到
广泛的应用。
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