全 文 ：收稿日期： 2012–05–08　　　　接受日期： 2012–06–11
基金项目： 中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-YW-Z-1024)资助
作者简介：胡兆锋(1985 ~ )，男，硕士研究生，从事四照花亚属的系统发育研究。E-mail: zfhu543@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: huanghw@mail.scbg.ac.cn
四照花亚属的 nrDNA ITS 致同进化不完全
胡兆锋1, 向秋云2, 黄宏文1*
(1. 中国科学院华南植物园，中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室， 广州 510650； 2. 北卡罗来纳州立大学植物生物学系，
NC27695, USA)
摘要： 四照花亚属(Cornus subg. Syncarpea)隶属于山茱萸科山茱萸属(Cornus)，我国该亚属共有 5 种 8 亚种。为探讨四照花亚
属 nrDNA ITS 序列的致同进化不完全现象及假基因产生的可能原因，分析了该亚属 4 种(每种 1 ~ 2 个居群)共 21 个个体的
nrDNA ITS 序列。结果表明，这些类群的 nrDNA ITS 存在多态性，通过分析这些 nrDNA ITS 克隆序列的 G + C 含量、5.8S 保
守基序和二级结构最小自由能，推测其可能存在假基因。系统发育研究结果显示所有 nrDNA ITS 序列分成 5 个分支，同一个
体的不同拷贝被分别置于两个甚至多个分支中，且不同分支显示了不同种间关系。四照花亚属物种个体内部存在 nrDNA ITS
不完全致同进化，可能归咎于不完全的世系分选(incomplete lineage sorting)、种间杂交或多倍化等进化事件，从而导致基因组内
nrITS 区序列出现多态性，同时也导致难以通过外部形态来划分亚属内种间界限。
关键词： 四照花亚属； nrDNA ITS； 致同进化不完全进化； 假基因
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.01.004
Incomplete Concerted Evolution of nrDNA ITS in Cornus subg.
Syncarpea (Cornaceae)
HU Zhao-feng1, XIANG Qiu-yun (Jenny)2, HUANG Hong-wen1*
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,
Guangzhou 510650, China; 2. Department of Plant Biology, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695, USA)
Abstract: The subgenus Syncarpea, which belongs to genus of Cornus (Cornaceae), includes five species and
eight subspecies in China. nrDNA ITS sequences of 21 individuals from 4 species, with 1 to 2 populations for
each species, in the subgenus were amplified and used to test the existence of incomplete concerted evolution
and pseudogenes. Intra-genomic polymorphism was detected in the internal transcribed spacer (including ITS1,
5.8S and ITS2) regions of these species. The analyses of G + C content, 5.8S conserved motifs and minimum free
energy of 5.8S secondary structures suggested that there were putative pseudogenes of nrDNA in these species.
Phylogenetic analyses of the sequences resulted in five clades with variants from the same accession commonly
being placed in two or more clades and species were grouped differently among clades. These results demonstrated
the existence of incomplete concerted evolution of ITS within individuals of Syncarpea, which could be explained
by incomplete lineage sorting, possible hybridization or polyploidy and resulted in the polymorphism of ITS and
the difficulty in morphology-based species delineation in the subgenus.
Key words: Cornus subg. Syncarpea; nrDNA ITS; Incomplete concerted evolution; Pseudogenes
热带亚热带植物学报　2013， 21(1)： 29~37
Journal of Tropical and Subtropical Botany
30 第21卷热带亚热带植物学报
四照花亚属[Cornus subg. Syncarpea (Nakai) Q. Y.
Xiang]隶属于山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属(Cornus
L.)，东亚分布类群，中国是其分布中心 [1]。该亚属
种间的分类和系统发育关系一直没有得到彻底解
决[2]，尤其在基于形态学数据进行分类的过程中，由
于对性状加权的不同，该亚属被分为 4 ~ 14 种 [1,3]。
向秋云 [1]根据形态性状的研究，将四照花亚属原来
的 19 种处理成 4 种 12 亚种及 3 变种；基于对前人
研究及对标本的深入分析，胡文光等 [4] 将四照花亚
属提升为四照花属，并将该属分成 10 种；最近，向
秋云等 [3] 基于分子系统发育学和形态学的研究，最
终将四照花亚属分成 4 种 8 亚种。
向 秋 云 等[2] 利 用 nrDNA ITS 和 叶 绿 体 matK
对整个山茱萸属的物种系统发育关系的研究中，
四照花亚属各物种系统发育关系没有得到有效的
解决，物种系统发育位置比较混乱，香港四照花(C.
hongkongensis)各亚种和四照花(C. kousa)各亚种与
其它物种之间存在交叉，且亚种系统发育关系自展
值都不高。此外，没有该亚属系统发育研究的报道。
由于变异速率较快且不同拷贝之间存在致同
进化，nrDNA ITS 已经被广泛应用于近缘物种的
系统进化研究中[5]。虽然在系统发育分析中存在
一定的问题，但许多研究利用 ITS 区域致同进化不
完全现象发现了其它常用分子片段不能检测到的
进化过程[6]。通常，nrDNA(包括 ITS)基因家族在
致同进化的作用下，拷贝之间序列均一化程度很
高，几乎没有差异[7]。然而近年来，许多研究表明
ITS 在植物基因组内存在着较高的多样性，暗示其
存在致同进化不完全现象。比如，在裸子植物松科
(Pinaceae)[8]和买麻藤属(Gnetum)[9]中，nrDNA ITS
基因组内的多样性不仅仅表现在碱基替换上，其长
度变异也非常明显，超过 100 bp。被子植物基因组
内 nrDNA ITS 致同进化不完全的现象可能不如裸
子植物常见，但在不同类群中也有报道，例如栎属
(Quercus)[10]和梨属(Pyrus)[11] 等类群中也发现致同
进化不完全现象和假基因。nrDNA 假基因在系统
发育研究中的作用颇受争议[7,11–14]。因此，在利用
nrDNA ITS 序列进行系统发育研究之前首先要判
断该序列是否存在假基因及假基因的类型。
基 因 组 内 nrDNA ITS 区 致 同 进 化 不 完 全 的
产生既有物种进化和生活史方面的原因，如多倍
化 [15]、世代周期长和杂交[16] 等，也有核仁组织者
(NOR)在基因组中的数目和位置等原因，基因组内
NOR 数目较多或位于非同源染色体上都会减缓甚
至阻止致同进化[12]。
在利用 ITS 和 cpDNA 序列进行山茱萸属系统
发育关系的研究[2]中，一些物种的 ITS 区的 PCR 扩
增产物直接测序结果出现多态性，碱基不可读。本
研究从四照花亚属基因组内 nrDNA ITS 序列多态
性入手，分析了四照花亚属 nrDNA ITS 致同进化不
完全现象和 nrDNA 假基因的存在及产生原因。
1 材料和方法
1.1 材料
本 研 究 选 取 尖 叶 四 照 花(Cornus elliptica)、
香 港 四 照 花(C. hongkongensis)、多 脉 四 照 花(C.
multinervosa)和四照花(C. kousa) 4 种植物 6 个居群
共 21 个个体进行分析，每个居群的凭证标本均保
存在中国科学院华南植物园标本馆(IBSC)，样本具
体标本号和地理位置见表 1。样本均采自物种的典
型分布区。每个个体采集幼嫩叶片，硅胶干燥保存。
另外，从 GenBank 数据库下载到已发表该属植物
nrDNA ITS 序列 12 条(序列编号见表 1)。
1.2 DNA提取、PCR扩增及克隆
样本的总 DNA 提取采用改良的 CTAB 法[17]，
nrDNA ITS 片 段 的 扩 增 采 用 引 物 ITS-5m[18]和
ITS-4[19]，扩 增 反 应 (PCR) 体 系 总 体 积 为 25 µL，
包 括 60 ng DNA 模 板，引 物 ITS-5m 和 ITS-4 各
0.2 µmol L-1，MgSO4 2 mmol L
-1，1 × Pfu 缓冲液，
dNTPs 0.2 mmol L-1，Pfu DNA 聚 合 酶(Fermentas)
1.25 U。反应程序为：95℃预变性 5 min；95℃变性
30 s， 58℃退火 30 s， 72℃延伸 90 s， 37 个循环；最
终 72℃延伸 10 min。为了便于 PCR 产物能够与
T 载体连接，PCR 结束后，加 2.5 U 普通 Taq DNA
聚合酶延伸 10 min，加 A 接头。
PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后，切下目的
片段并用 Axgene 凝胶回收试剂盒回收、纯化产物
与 pMD19-T Vector (TaKaRa)载体连接，然后转化
DH5α 感受态细胞。纯化和克隆按试剂盒说明书操
作。菌液送奥科鼎盛生物公司采用 Sanger 法测序。
测序结果经人工核对后，提交 GenBank。测序结果
序列号与样本之间的对应关系见表 1。
第1期 31
表 1 四照花亚属样本和相应 nrDNA ITS 序列信息
Table 1 Samples and nrDNA ITS sequence information of Cornus subg. Syncarpea
物种
Species
编号
No.
采集地
Location
凭证标本
Voucher
GenBank 序列号
GenBank Acc. No.
尖叶四照花 C. elliptica 江西井冈山
Jinggangshan,
Jiangxi,
胡兆锋 Z F Hu 748210, IBSC
JX-1-1 Acc. 1 clone 1 JQ909996
JX-1-2 Acc. 1 clone 2 JQ909997
JX-2-1 Acc. 2 clone 1 JQ909998
JX-2-2 Acc. 2 clone 2 JQ909999
尖叶四照花 C. elliptica 湖北恩施
Enshi, Hubei
胡兆锋 Z F Hu 748209, IBSC
HB-3-1 Acc. 3 clone 1 JQ910000
HB-3-2 Acc. 3 clone 2 JQ910001
HB-4-1 Acc. 4 clone 1 JQ910003
HB-4-2 Acc. 4 clone 2 JQ910004
HB-4-3 Acc. 4 clone 3 JQ910005
HB-4-4 Acc. 4 clone 4 JQ910006
HB-4-5 Acc. 4 clone 5 JQ910007
香港四照花 C. hongkongensis FJ-1-1 福建武夷山
Wuyishan, Fujian
胡兆锋 Z F Hu 748206, IBSC
Acc. 1 clone 1
JQ910009
香港四照花 C. hongkongensis 广东
Guangdong
胡兆锋 Z F Hu 748207, IBSC
GD-2-1 Acc. 2 clone 1 JQ910011
GD-3-1 Acc. 3 clone 1 JQ910012
GD-3-2 Acc. 3 clone 2 JQ910013
GD-3-3 Acc. 3 clone 3 JQ910014
GD-3-4 Acc. 3 clone 4 JQ910015
GD-3-5 Acc. 3 clone 5 JQ910018
GD-4-1 Acc. 4 clone 1 JQ910019
GD-4-2 Acc. 4 clone 2 JQ910020
GD-4-3 Acc. 4 clone 3 JQ910021
GD-4-4 Acc. 4 clone 4 JQ910022
GD-4-5 Acc. 4 clone 5 JQ910023
GD-5-1 Acc. 5 clone 1 JQ910024
GD-5-2 Acc. 5 clone 2 JQ910025
GD-6-1 Acc. 6 clone 1 JQ910026
多脉四照花 C. multinervosa SC-1-1 四川峨眉山
Emeishan, Sichuan
向秋云 Q Y Xiang 02-115, NCSC
Acc. 1 clone 1
JQ918684
四照花 C. kousa 陕西眉县
Meixian, Shaanxi
向秋云 Q Y Xiang 10-24, NCSC
SX-1-1 Acc. 1 clone 1 JQ910028
SX-2-1 Acc. 2 clone 1 JQ918685
SX-2-2 Acc. 2 clone 2 JQ910029
SX-3-1 Acc. 3 clone 1 JQ910030
SX-3-2 Acc. 3 clone 2 JQ910031
SX-4-1 Acc. 4 clone 1 JQ910032
SX-4-2 Acc. 4 clone 2 JQ910033
SX-4-3 Acc. 4 clone 3 JQ910034
SX-5-1 Acc. 5 clone 1 JQ910035
SX-6-1 Acc. 6 clone 1 JQ910036
SX-7-1 Acc. 7 clone 1 JQ910037
SX-8-1 Acc. 8 clone 1 JQ910038
SX-8-2 Acc. 8 clone 2 JQ910039
SX-8-3 Acc. 8 clone 3 JQ910040
SX-9-1 Acc. 9 clone 1 JQ910041
SX-9-2 Acc. 9 clone 2 JQ910042
SX-10-1 Acc. 10 clone 1 JQ910043
SX-10-2 Acc. 10 clone 2 JQ910044
胡兆锋等：四照花亚属 nrDNA ITS 致同进化不完全
32 第21卷热带亚热带植物学报
1.3 序列处理
ITS1、 5.8S、 ITS2 区域的边界确定参照其它已
有的序列[2,20]；利用 CLUSTAL X [21]对所有序列进行
对位排列；并用 BioEdit 5.0.6[22]对序列进行人工校
正。为了初步确定四照花亚属基因组内是否存 ITS
假基因，进行了以下分析[23]： (1) 计算 ITS1、5.8S 的
G + C 含量[11,24]，以及序列之间的平均遗传距离；(2)
检测是否存在种子植物 5.8S 特有的 3 个保守基序。
motif1：GAATTGCAGAATCC、 motif2： TTTGAAY-
GCA 和 motif3： CGATGAAGAACGYAGC[25]， 并
检测保守基序中碱基的变化；(3) 利用网络在线版
Mfold 3.1 (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/
mfold/rna/form1.cgi)统计 5.8S 二级结构最小自由能
(ΔG 在 37℃)[26]。在 R2.10.1 软件中作 ITS1 G + C
含量与 ITS2 G + C 含量以及 5.8S G + C 含量与 5.8S
二级结构最小自由能变化关系图。
1.4 系统发育关系重建
由于假基因在系统发育研究中的应用还存在
很多争议，本研究利用以上初步分析得到的可能
的 nrDNA ITS 假基因以外的克隆序列，选取大花四
照花(C. florida)、山茱萸亚属(Cornus subg. Cornus)
的山茱萸(C. officinalis)和长圆叶梾木亚属(Cornus
subg. Yinquania)的长圆叶梾木(C. oblonga)为外类
群，采 用 最 大 简 约 法(maximum parsimony, MP)、
最大似然法(maximum likelihood, ML)和贝叶斯法
(Bayesian inference, BI)构建 ITS1 序列和种间系统
发育关系。由于 GenBank 中四照花亚属及相关外
类群只有部分 ITS2 序列数据(0 ~ 79 bp)，在本研究
中 ITS2 没有用于系统发育分析。用 PAUP*4.0b10
软件[27]构建 MP 树和 ML 树，对 MP 树和 ML 树分
别进行 1000 次和 100 次拟重复抽样的 bootstrap
分析，检验各节点的置信度；ML 树根据 Modeltest
3.7[28]估算数据最佳模型为 TrNef + G。然后利用
这个进化模型(TrNef + G)和 Mrbayes-3.1.2[29] 软件
构建系统发育树。贝叶斯法构建系统发育树时采
用 如 下 设 置： MCMC (Metropolis-coupled Markov
Chain Monte Carlo)算法，以随机树为起始树，迭代
运行 2000000 次，每 100 代取样 1 次，舍弃开始的
5000 个样本作为老化样本(burn-in samples)。
2 结果
2.1 nrDNA ITS基因组内多样性
序列组成分析结果显示，四照花亚属中 ITS1-
5.8S-ITS2 序列总长度为 608 ~ 659 bp，G + C 含
量为 51% ~ 66%。四照花基因组内不同克隆序列
间的 ITS1-5.8S-ITS2 存在 51 bp 的长度差异，其中
ITS1 序列长度变异达到 40 bp；尖叶四照花基因组
内 ITS1-5.8S-ITS2 序列的 G + C 含量变化最大，为
52% ~ 64%，序列长度为 637 ~ 650 bp。香港四照花
基因组内 ITS1-5.8S-ITS2 序列长度和 G + C 含量
变化介于四照花和尖叶四照花之间，基因组内长度
变异最大为 638 ~ 647 bp，G + C 含量变化最大为
58% ~ 65%。
物种
Species
编号
No.
采集地
Location
凭证标本
Voucher
GenBank 序列号
GenBank Acc. No.
香港四照花 C. hongkongensis SC-7-dl Xiang et al. 2006 DQ340548.1
YN-8-dl Xiang et al. 2006 DQ340552.1
头状四照花 C. capitata YN-1-dl Xiang et al. 2006 DQ340540.1
YN-2-dl Xiang et al. 2005 AY530915.1
四照花 C. kousa HB-11-dl Xiang et al. 2006 DQ340555.1
HB-12-dl Xiang et al. 2006 DQ340554.1
多脉四照花 C. multinervosa SC-dl Xiang et al. 2006 DQ340556.1
外类群 Outgroup
大花四照花 C. florida dl Xiang et al. 2006 DQ340535.1
长圆叶梾木 C. oblonga dl Xiang et al. 2006 DQ340530.1
山茱萸 C. officinalis 1-dl Xu et al. 2008 EU591992.1
2-dl Chen and Pan 2006 DQ683358.1
3-dl Xiang et al. 2005 AY530921.1
dl：从 GenBank 上下载的序列； Acc. 1 clone 1: 第 1 个个体的第 1 个克隆。
dl: Sequence downloaded from GenBank; Acc. 1 clone 1: The first clone from the first individual.
续表(Continued)
第1期 33
2.2 nrDNA ITS假基因
四 照 花 亚 属 ITS1、 5.8S 和 ITS2 的 G + C 含
量 分 别 为 49.19% ~ 67.50%、 52.63% ~ 68.77%、
45.16% ~ 55.56%。5.8S 二级结构最小自由能变化
为 – 48.20 ~ –26.00 (图 1)。 在 所 有 的 nrDNA ITS
克隆序列中，有 4 条尖叶四照花序列、9 条四照花
序列、2 条香港四照花和 1 条多脉四照花序列 5.8S
的 G + C 含量低于 50%，有 1 条香港四照花克隆序
列 ITS1 的 G + C 含量低于 50%，这些克隆序列被
初步判断为假基因(图 1 实心部分)。但由于这些可
图 1 四照花亚属植物 ITS1与 ITS2的G + C含量 (左 )以及 5.8S 的 G + C含量与 5.8S 二级结构最小自由能 ( 右 ) 的关系。实心代表可能的假基因。
Fig. 1 Relation of G + C contents between ITS1 and ITS2 (left) and relation between 5.8S G + C content and the minimum free energy (△G at 37℃)
of the secondary structure of 5.8S (right) in Cornus subg. Syncarpea. Solid symbols indicate putative pseudogenes.
表 2 四照花亚属植物 5.8S 的 3 个保守基序的核苷酸变化
Table 2 Changes in nucleotide in three motifs of 5.8S in Cornus subg. Syncarpea
编号　　　
No.　　　
保守基序1 Motif 1 保守基序2 Motif 2 保守基序3 Motif 3
3
4
3
5
3
6
3
8
4
1
4
3
4
4
4
5
4
6
4
8
4
9
7
0
7
5
7
6
7
8
8
1
8
2
1
0
3
1
0
4
1
0
8
1
1
0
1
1
1
JX-2-1 C G A G G A T G T G T A A C G T C - G T T A
HB-4-5 C G A G G A C G T A T G A C G T C T G C T A
GD-2-1 C G A G G G C G T G T A A C G T C T G C C A
GD-3-5 C G A G G A T G T G T G G C G T C T G C T A
GD-5-1 C G A G G A C G T G T G G C A T C T A T C A
GD-5-2 C G A G G A T G T G T A A C G T C T G T T A
SX-4-1 C G A G G A A G T G T G A T G T C T A T C A
SX-4-2 C G A G G A A G T G T G G C G T C T G T C A
SX-4-3 T G G G G A C T T G T G A T G T C T A C C A
SX-6-2 C G A G G A C G T G T G G C G T C T A T C A
SX-8-1 C G A G G A C G T G T G G C G T C T G T C A
SX-9-1 C G A G G A C G T G T G A T G T C T A C C A
SX-10-1 C G A G G A T G T G T G A C G T C T G C C A
YN-1 C G A G G A C G T G T G G C G T C T G C C A
YN-2 C G A A A A C G T G T G G C G T C T G C C A
HB-11 C G A G G A T G T G T G A T G T C T A T C A
HB-12 C C A G A A A G T A T G G C A T C T T T G C
C. oblonga C G A G G A C G T G T G G C G T C T G C C A
C. officinalis 1 C G A G G A T G T G T G G C G T C T G C C A
C. officinalis 2 C G A G G A T G T G T G G C G T C T G C C A
特有的保守基序
Viridiplantae conserved motif
C G A G G A C G y G C G G C G w y T G y C A
胡兆锋等：四照花亚属 nrDNA ITS 致同进化不完全
34 第21卷热带亚热带植物学报
图 3 Bayes 法分析四照花亚属植物 ITS1 序列的系统发育关系。节点处数字为各分支的支持率。
Fig. 3 Phylogenetic relationships among species of Cornus subg. Syncarpea from the ITS1 dataset. Posterior support is shown near the nodes.
能的假基因 ITS1 序列 G + C 含量与可能的功能序
列之间的差别并不大(C. kousa SX-2-2 ITS1 的 G +
C 含量最低为 45.16%)，且不同克隆序列之间 5.8S
G + C 含量成连续分布(图 1 左)，因此需要借助于
保守基序的比较做进一步分析。
本研究得到的四照花亚属 nrDNA ITS 序列中，
大多数序列 5.8S rDNA 含有全部的 3 个植物特有
的保守基序(motif)。其中 motif 1 的第 49 个核苷
酸位置在所研究四照花亚属样本中全部为 T，而在
其它植物类群中为 C (表 2)。在 3 个保守基序中，
motif 3 保守性最高。有 9 条克隆序列的 5.8S rDNA
不含保守基序或 3 个保守基序中都存在碱基变异或
保守基序中存在碱基缺失，被认为是可能的假基因。
通过以上两步分析，本研究共有 4 条尖叶四照
花克隆序列、2 条香港四照花序列、2 条四照花和
1 条多脉四照花序列 ITS1 和 5.8S G + C 含量低于
50% 且 5.8S rDNA 序列不含保守基序或 3 个保守
基序中都存在碱基变异或保守基序中存在缺失，被
认为是假基因。
2.3 系统发育关系重建
由于 MP 和 ML 分析得到的克隆序列之间的
系统发育树，不同物种的克隆序列存在大量的交
叉，许多克隆序列都聚在同一分支上，且分支的自
展值都不高。因此，本文仅展示了物种与克隆序列
之间系统发育关系比较明确的贝叶斯法得到的系
第1期 35
表 3 4 个分支上不同 ITS 片段的平均 G + C 含量(%)
Table 3 Average G + C content (%) of ITS1, 5.8S and ITS2 of five clades
ITS1 ITS2 5.8S
Clade 1 67.22 66.89 54.58
Clade 2 66.81 65.94 53.36
Clade 4 56.25 56.5 47.23
Clade 5 61.05 60.89 51.40
统发育树。
系统发育分析结果表明四照花亚属 ITS 克隆
序列可分成五支(图 3)。分支 1 包含四照花亚属全
部物种的代表序列，而其它分支均仅包含该亚属部
分物种。分支 1 中，同一物种的克隆序列都聚在一
起，四照花与尖叶四照花系统发育关系较近，且后
验概率(PP)较高(0.97)；四照花与多脉四照花聚成
一个小分支，但后验概率较低；头状四照花单独形
成一个小分支，后验概率很高(1.00)。分支 2 包含 3
个物种，同一物种的克隆序列没有完全聚在一起，
香港四照花和尖叶四照花克隆序列之间存在部分
交叉。分支 4 中，四照花的 4 条克隆序列与尖叶四
照花的 1 条克隆序列是姊妹关系。分支 5 仅包含 2
条香港四照花克隆序列和 1 条四照花克隆序列。
在系统发育树上，除香港四照花第 3 号个体(C.
hongkongensis GD-3)的不同克隆序列被分别置于
分支 1、分支 2 和分支 5 外，其它物种相同个体的不
同克隆序列都被置于 1 个或两个分支中。
进一步分析表明，分支 1 和分支 2 中的 ITS1、
ITS2 和 5.8S rDNA 等 3 个片段平均 G + C 含量均
高于分支 4 和分支 5 (表 3)，推测后两个分支包含
的序列可能还是假基因序列。
4 讨论
4.1 nrDNA ITS基因组内多样性与致同进化不完全
序列组成成分分析结果发现，四照花亚属各物
种个体基因组内部不仅存在 GC 含量上的变化，不
同克隆序列之间长度也存在变异。这些结果说明
在四照花亚属中个体基因组内部 nrDNA ITS 存在
致同进化不完全现象。与一些裸子植物相比[8–9]，四
照花亚属植物基因组内部 ITS 序列变化相对较小。
这可能是由于裸子植物世代周期长，多倍化现象普
遍以及 NOR 数目较多且位于非同源染色体上；而
属于被子植物的四照花亚属植物，多倍化现象很
少，NOR 数目不多，一般为 1 ~ 2 个，因此后者基
因组内 ITS 序列致同进化的程度相对较高。
本研究显示四照花亚属植物基因组内存在多
种 ITS 变异类型(如香港四照花第 3 个个体检测到
有 3 种类型)，但同一个体的不同克隆序列大都被
置于两个不同的分支，且位于相同分支的这些序列
之间相似度非常高，只存在少数碱基的差别。我们
推测这些个体内部相似序列的变异可能是 PCR 或
测序过程中的错误引起的，但本研究用于 PCR 反
应的 DNA 聚合酶为 Pfu DNA 聚合酶，其出错率为
1.3 × 10-6 [30](即 100 万个碱基对可能出现 1.3 个错
配)，因此 PCR 过程中出现错误的可能性不大。另
外，本研究还在基因库上对所有克隆序列进行序列
相似性比较也没有发现其它生物 nrDNA ITS 序列
的污染。因此，本研究中检测到的植物个体内部的
ITS 相似序列的变异可能是基因组内串联重复序列
之间的近期分化、物种之间的杂交或植物基因组多
倍化引起的。
种间系统发育关系分析结果表明，得到的克隆
序列之间的系统发育关系与伞房属(Corymbia)、桉
树(Eucalyptus sp.)[6]和梨属[11]的研究结果相似，不同
物种相同类型的 nrDNA ITS 序列之间的关系比同
一物种基因组内不同类型的 nrDNA ITS 之间的关
系更近。这说明基因组内不同类型的 nrDNA ITS
经历了不同的进化过程，可能位于非同源染色体
上，或来源于种间杂交。该类群种间没有完全生殖
隔离的报道，种间过渡类型普遍。虽然采样居群中
没有发现不同物种同域分布的情况，但由于世代周
期长，一次与邻近居群偶然的种间杂交可能就会引
起基因组内长期存在多样性。
4.2 四照花亚属nrDNA假基因
由于假基因的判断标准很多[11,23–25]，本研究
选取通过核苷酸序列判断假基因最常用的方法，
胡兆锋等：四照花亚属 nrDNA ITS 致同进化不完全
36 第21卷热带亚热带植物学报
ITS1、 ITS2、 5.8S rDNA G + C 含量[31]和 5.8S rDNA
二级结构最小自由能以及 5.8S rDNA 保守基序，
同时结合克隆序列的系统发育位置做进一步分析。
但最可靠的还是与 5.8S rDNA 相应的 mRNA 序列
进行比较[31]，但由于没有保存提取 RNA 相应的实
验材料，因此要得到更加可靠的证据还需要以后
的深入研究。克隆序列的系统发育结果研究表明，
在整个四照花亚属中可能至少存在两种类型的假
基因。
与梨属[11]的报道相似，四照花亚属 nrDNA ITS
序列系统发育关系分析结果表明，假基因与功能序
列在基因树上各自独立形成分支，这说明其假基因
起源于亚属物种形成之前并且已经难以与功能序
列之间进行遗传交换了。深入研究表明这样的假
基因类型有些能够准确的反应物种之间的进化关
系。但是由于在本研究中不是所有物种都检测到
这两种假基因，要利用这些 nrDNA 假基因进行种
间系统发育分析还需要对每个个体做更多的克隆
测序，以增加检测到的假基因的数量。而且这两种
类型的假基因哪种更加适合进行种间系统发育分
析，还是两种都可以用于四照花亚属种间系统发育
关系分析还需要做进一步研究。
四照花亚属种间形态分类一直存在争议，由于
种间形态变异的复杂性以及不同学者对性状权重
的不同使得该亚属物种的分类和系统发育关系还
不明晰。本研究通过 nrDNA ITS 序列的深入分析，
发现了该亚属致同进化不完全现象和假基因的存
在，这一发现有助于解释向秋云等通过少数 ITS 序
列难以解决物种系统发育关系的问题。通过本研
究，我们推测四照花亚属可能存在自然杂交或多倍
化现象，最终导致该亚属物种基因组内 nrDNA ITS
区序列存在多态性，从而也使得物种之间形态上的
界限变模糊。但这种观点还需要更多 DNA 序列等
分子数据的证明。
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