全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

·3212·
西藏麻花艽种质资源的遗传多样性分析
倪梁红 1，赵志礼 1*，孟千万 1，嘎 务 2，米 玛 2
1. 上海中医药大学中药学院，上海 201203
2. 西藏藏医学院，西藏 拉萨 850000
摘 要：目的 对西藏不同产地 17 份麻花艽 Gentiana straminea 样品的遗传多样性进行比较分析。方法 居群采样，以相同产
地同属近缘种粗茎秦艽G. crassicaulis为外类群比对，nrDNA ITS区序列分析，构建UPGMA系统树。结果 西藏产麻花艽nrDNA
ITS 区序列有 1 个多态性位点；外类群粗茎秦艽 6 份样品序列完全一致。结论 麻花艽与外类群种间区别明显；17 份不同产地
麻花艽被划分为 2 类，遗传多样性较为丰富，为西藏麻花艽药材品质评价及麻花艽核心种质的构建提供基础资料。
关键词：麻花艽；种质资源；nrDNA ITS 区；遗传多样性；藏药
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)22 - 3212 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.22.021
Genetic diversity of germplasm resources of Gentiana straminea from Tibet of China
NI Liang-hong1, ZHAO Zhi-li1, MENG Qian-wan1, GAAWE Dorje2, MI Ma2
1. College of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
2. Tibetan Traditional Medical College, Lhasa, 850000, China
Abstract: Objective To study the genetic diversity of 17 samples of Gentiana straminea from different habitats of Tibet. Methods
Sampling in populations was carried out, and the related species G. crassicaulis from the same area was as the out group; nr DNA ITS
sequences were amplified and analyzed; UPGMA systematic tree was constructed. Results One polymorphic site of G. straminea
from Tibet was found; the six samples of out group have the identical DNA ITS sequences. Conclusion The difference between G.
straminea and the out group is obvious; seventeen samples of G. straminea from different habitats are divided into two groups; genetic
diversity is more abundant; the result could provide the basic reference for the quality evaluation and the construction of core
germplasm of G. straminea in Tibet.
Key words: Gentiana straminea Maxim.; germplasm resources; nrDNA ITS; genetic diversity; traditional Tibetan medicine

“解吉嘎保（ ）”为常用藏药之一，主治
赤巴病；其植物来源为龙胆科龙胆属Gentiana (Tourn.)
L. 秦艽组（Sect. Cruciata）麻花艽 Gentiana straminea
Maxim. 等数种植物[1-2]。近年来，本课题组开展了藏
药解吉类的品种整理工作[3]。在品种鉴定基础上，进
一步探讨藏药材产地与质量的相关性，进行种质资源
遗传多样性分析与物种的就地保护，很有必要。
遗传多样性评价是种质资源评价中的重要内容
之一[4-5]。为此，本实验以西藏麻花艽为研究对象，
在其主要产地那曲地区和昌都地区进行设点取样，
并以昌都地区丁青县相同产地同属近缘种粗茎秦艽
G. crassicaulis Duthie ex Burk. 为外类群比对，以植
物核糖体 DNA 序列中的内转录间隔区（nrDNA
ITS）区为分子标记[6]，评价该片段在西藏产麻花艽
种下不同居群间的分辨率，进而开展相关遗传多样
性分析，以期为西藏麻花艽药材品质评价及麻花艽
核心种质的构建提供基础资料。
1 材料
样品均为实验室自采，在西藏 2 个地区 3 个样
点采集麻花艽 Gentiana straminea Maxim.，于其中
一个产地采集近缘种粗茎秦艽 Gentiana crassicaulis
Duthie ex Burk.作为外类群，所有标本经上海中医药
大学赵志礼教授鉴定；凭证标本存放于上海中医药
大学中药学院药用植物标本室，见表 1。

收稿日期：2013-06-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173654）
作者简介：倪梁红（1980—），男，讲师，主要从事中药资源与品种鉴定工作。E-mail: nlhtcm@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

·3213·
表 1 样品与凭证标本
Table 1 Samples and voucher specimens
名称 地理位置 海拔 / m 编号 凭证标本号 采集地
BQ1 XZ201213-1 西藏那曲地区巴青县城河边草滩
BQ2 XZ201213-2 西藏那曲地区巴青县城河边草滩
麻花艽 G. straminea
（样点 1）
N 31°55.634′
E 94°01.957′
4 141
BQ3 XZ201213-3 西藏那曲地区巴青县城河边草滩
DQ1 XZ201215-1 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ2 XZ201215-2 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ3 XZ201215-3 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ4 XZ201215-4 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ5 XZ201215-5 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ6 XZ201215-6 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
麻花艽 G. straminea
（样点 2）
N 31°23.178′
E 95°49.844′
4 138
DQ7 XZ201215-7 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ8 XZ201216-1 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ9 XZ201216-2 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ10 XZ201216-3 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ11 XZ201216-4 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ12 XZ201216-5 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
DQ13 XZ201216-6 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
麻花艽 G. straminea
（样点 3）
N 31°22.598′
E 95°52.146′
4 225
DQ14 XZ201216-7 西藏昌都地区丁青县协堆村路边草地
CJ1 XZ201214-1 西藏昌都地区丁青县协堆村山坡草地
CJ2 XZ201214-2 西藏昌都地区丁青县协堆村山坡草地
CJ3 XZ201214-3 西藏昌都地区丁青县协堆村山坡草地
CJ4 XZ201214-4 西藏昌都地区丁青县协堆村山坡草地
CJ5 XZ201214-5 西藏昌都地区丁青县协堆村山坡草地
粗茎秦艽 G. crassicaulis
（外类群）
N 31°21.458′
E 95°52.533′
4 561
CJ6 XZ201214-6 西藏昌都地区丁青县协堆村山坡草地

2 方法
2.1 总 DNA 提取
采集各样本新鲜叶片，硅胶快速干燥固定，带
回实验室后置−20 ℃冰箱。在 CTAB 法[7]的基础上，
略做改进提取总 DNA。
2.2 PCR 扩增
利用nrDNA ITS区的通用扩增引物YP1和YP4
进行该序列的扩增 [8]。引物序列如下：YP1 为
5’-GGAAGTAGAAGTCGTAACAAGG-3’，YP4 为
5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 反应在 20
μL 的反应体系中进行。反应液中含 10×缓冲液 2
μL，MgCl2（25 mmol/L）1.8 μL，上游引物 YP1（10
μmol/L）0.6 μL，下游引物 YP4（10 μmol/L）0.6 μL，
dNTP Mix（各 10 mmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合
酶（5 U/μL）0.2 μL，模板 DNA 稀释 20 倍后加入 2
μL，加入去离子水补至 20 μL。阴性对照加 2 μL 去
离子水，代替模板 DNA。反应在（Eppendorf
Mastercycler Pro S）PCR 仪上进行，循环参数为：
95 ℃预变性 4 min，95 ℃变性 30 s，59 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 1 min，共 31 个循环，最后 72 ℃延伸补
齐 10 min。
2.3 nrDNA ITS 区序列测定
PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在 700
bp 处有清晰条带。产物送上海英骏生物技术有限公
司纯化并测序（Axygen 胶回收试剂盒纯化，ABI
3730xl 型测序仪测序）。测序引物为 YP1。
2.4 序列数据分析
ITS1 和 ITS2 区的起止范围参考 GenBank 中龙
胆属秦艽组的 ITS 区范围，所得序列输入计算机后，
用 MEGA5.0、MegAlign7.1.0（44）软件进行分析。
3 结果
3.1 各样本 ITS 区序列
巴青县 3 份麻花艽的 ITS 区全序列完全一致，
长度均为 627 bp，其中 ITS1 区为 233 bp，5.8 S 区
为 164 bp，ITS2 区为 230 bp，居群内样品间无位点
差异；丁青县 2 个居群 14 份麻花艽的 ITS 区全序列
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

·3214·
完全一致，长度均为 627 bp，其中 ITS1 区为 233 bp，
5.8 S 区为 164 bp，ITS2 区为 230 bp，居群内样品间无
位点差异；丁青县 6 份粗茎秦艽的 ITS 区全序列的长
度完全一致，长度均为 625 bp，其中 ITS1 区为 230 bp，
5.8 S 区为 164 bp，ITS2 区为 231 bp，居群内样品间无
位点差异。各样本的 ITS 区长度及碱基量见表 2。
3.2 麻花艽不同居群 ITS 区序列分析
所测定的23份样品的 ITS区序列均无杂合位点
出现。麻花艽巴青县的样品与丁青县的样品在 ITS
区的 537 位（位于 ITS2 区）存在多态性差异，巴青
县样品该位点均为 C，丁青县样品该位点均为 T，
其余位点皆一致（图 1）。
表 2 ITS 区序列长度及 G＋C 量
Table 2 Sequence length and G + C content
样品编号 T / % C / % A / % G / % G＋C / % ITS1 / bp 5.8 S / bp ITS2 / bp 总长/ bp
BQ1—BQ3 17.54 29.67 22.97 29.82 59.49 233 164 230 627
DQ1—DQ14 17.70 29.51 22.97 29.82 59.33 233 164 230 627
CJ1—CJ6 17.76 29.92 22.72 29.60 59.52 230 164 231 625

麻花艽与外类群粗茎秦艽相比存在多个位点差
异（巴青县样品、丁青县样品与之比较分别有 9 个、
8 个位点差异），可将 2 个物种进行有效区分。
将粗茎秦艽的 ITS 区序列作为外类群，构建
UPGMA 系统树。结果显示，外类群单独聚为一支；
麻花艽被划分为 2 类：巴青县的样品与丁青县的样
品各为一类，结果见图 2。

图 1 麻花艽 ITS 区多态性位点图
Fig. 1 Polymorphic site of G. straminea in ITS sequences

图 2 基于 ITS 序列构建的 UPGMA 系统发育树
Fig. 2 UPGMA systematic tree based on ITS sequences
4 讨论
基于 nrDNA ITS 区序列构建的分子系统树，
结果与形态分类学观点相一致：麻花艽种内丁青
县 14 个样品聚为 1 支，巴青县 3 个样品聚为一支，
这两支共同聚为一支；同时与粗茎秦艽种间并列
为两大支。显示以 nrDNA ITS 区序列为分子标记，
评价西藏麻花艽种质资源的遗传多样性是适宜
的。相较于 ISSR、AFLP 等以条带显示实验结果
的方法[9-10]，nrDNA ITS 区序列测定法可获得具体
多态性位点的信息。以此稳定的多态性位点设计相
关引物，其产地鉴别意义不言而喻。
因居群分布、生长环境等多方面影响，不同产
地的麻花艽在有效成分量及药材品质上可能存在差
异。本实验初步确定了西藏产麻花艽的多态性鉴别
位点，此位点与麻花艽药材的道地性、药材的品质
是否相关，以及 nrDNA ITS区序列是否适合藏药“解
吉嘎保”其他品种的分析，尚待深入研究。
参考文献
[1] 帝玛尔•丹增彭措. 晶珠本草 [M]. 上海: 上海科学技
术出版社, 1986.
[2] 杨永昌, 何廷农, 卢生莲, 等. 藏药志 [M]. 西宁: 青
海人民出版社, 1991.
[3] Zhao Z L, Gaawe D, Wang Z T. Identification of
medicinal plants used as Tibetan Traditional Medicine
Jie-Ji [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 132(1): 122-126.
[4] Abdurakhmonov I Y, Abdukarimov A. Application of
association mapping to understanding the genetic
diversity of plant germplasm resources [J]. Int J Plant
Genomics, 2008, ID574927: 1-18.
[5] Rao V R, Hodgkin T. Genetic diversity and conservation

DQ13
DQ14
DQ12
DQ11
DQ10
DQ9
DQ8
DQ7
DQ6
DQ5
DQ4
DQ3
DQ2
DQ1
BQ1
BQ2
BQ3
CJ1
CJ2
CJ3
CJ4
CJ5
CJ6
4 3 2 1 0
遗传距离

T T G C C C C A A C T T G C C T C A A C
巴青县麻花艽样品 丁青县麻花艽样品
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

·3215·
and utilization of plant genetic resources [J]. Plant Cell,
Tissue Organ Cult, 2002, 68: 1-19.
[6] China Plant BOL Group. Comparative analysis of a large
dataset indicates that ITS should be incorporated into the
core barcode for seed plants [J]. Proc Natl Acad Sci,
2011, 108: 19641-19646.
[7] Stewart C N Jr, Via L E. A rapid CTAB DNA isolation
technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR
applications [J]. Biotechniques, 1993, 14(5): 748-749.
[8] Yuan Y M, Philippe K. Molecular phylogenetics of the
subtribe Gentianiae (Gentianaceae) inferred from the
sequences of internal transcribed spacers (ITS) of nuclear
ribosomal DNA [J]. Plant Systems Evol, 1995, 196:
207-226.
[9] Joshi S P, Gupta V S, Aggarwal R K, et al. Genetic
diversity and phylogenetic relationship as revealed by
inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the
genus Oryza [J]. Theor Appl Genet, 2000, 100: 1311-1320.
[10] Ferriol M, Pico B, Nuez F. Genetic diversity of a
germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and
AFLP markers [J]. Theor Appl Genet, 2003, 107(2):
271-282.