全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (3) : 189～ 194
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
衣藻属的系统发育分析——基于形态形状和
nrD NA ITS 序列Ξ
张 弛 胡鸿钧 李中奎 李夜光 钟 扬ΞΞ
(中国科学院武汉植物研究所经济微藻研究室 武汉 430074)
提 要 通过实验分析莱茵衣藻 (Ch lam y d om onas reinhard tii) 1 个种和互连网获得衣藻属 15
个种及丝藻属 1 个种 (U loth rix z ona ta) , 共 17 个种的 nrDNA IT S 序列, 并以U. z ona ta 为外
类群, 采用计算机分析软件包对其进行分析及构建分子系统发育树图。同时以 12 个传统分类
性状, 对此 16 种衣藻构建数据矩阵; 以U. z ona ta 动孢子的相应性状为外类群原始性状, 用
W agner 法在计算机上对其进行分枝分析; 然后比较并分析分子系统树和表征性状分支分析
树的异同。初步尝试以 IT S 分子序列系统发育分析作为传统性状分析的补充来研究衣藻种
间的亲缘关系。
关键词 衣藻属, 系统发育, n rDNA IT S, 分支分析
中图分类号: Q 949. 21+ 2 文献标识码: A 文章编号: 10002470X (2000) 0320189206
PHYLOGENET IC ANALY SIS ON GENUS CHLAM YDOM ON AS
BASED ON MORPHOLOGICAL CHARACTERS
AND nrD NA ITS SEQUENCE
Zhang Ch i H u Hongjun L i Zhongku i L i Yeguang Zhong Yang
(W uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences W uhan 430074)
Abstract T he sequences of IT S regions and 5. 8S coding region of nuclear ribo som al DNA
from 16 species of the genus Ch lam y d om onas w ere determ ined and analysed. Based on the IT S
sequences, the phylogen tic tree of these species w as constructed using the nrDNA IT S
sequence of U loth rix z ona ta as the ou tgroup. A nd on the basis of 12 mo rpho logical characters
fo r study in the 16 species, phylogenetic analysis w as perfo rm ed and then W agner m ethod
w as used to construct the phylogenetic tree. F inally the tw o phylogenetic trees w ere
compared and the phylogenetic affin ity betw een the 16 species of the genus Ch lam y d om onas
w as analysed. T he clo se affin ity betw een tree pairs of species: C. incerta w ith C. reinhard tii;
C. g eitleri w ith C. noctig arna; C. asymm etrica w ith C. m ex icana is suppo rted by bo th nrDNAΞΞΞ 其他作者包括: 殷春涛、欧阳叶新、耿亚红、邵华、魏晓东、罗立明、桂建平。收稿日: 1999203211, 修回日: 1999206224。第一作者: 男, 1973 年生, 硕士, 现从事生物信息学研究。国家自然科学基金资助项目 (N o. 39870063)。本文是作者毕业论文的一部分。
IT S analysis and the mo rpho logical characters analysis. How ever, the resu lt show s that there
is sign ifican t difference betw een the phylogenetic tree from the nrDNA IT S sequences
analysis and the phylogenetic tree from mo rpho logical characters analysis. T he tw o
phylogenetic trees don’t agree w ith each o ther as a w ho le, and the po ssib le reason fo r the
difference is discussed.
Key words Ch lam y d om onas, Phylogenetic analyse, n rDNA IT S
衣藻属是一类由 500 多个种和变种构成的大类群〔1〕。传统上主要依据色素体和鞭毛
基部乳突的形态、结构和位置的进化特征来研究其种间亲缘关系。由于其种类多, 形态性
状较复杂〔2〕, 且易受环境的影响, 传统分类一般只对标本作形态观察, 又由于受许多种类
没有完整全面的生活史记录、有性生殖报道较少〔2〕等等因素限制, 使得形态分类学研究比
较困难〔3〕。另外, 传统的研究选择某几个表征形态为分析依据〔1〕, 受主观影响较大而难以
统一各种分类理论, 因此需要引入新的观点和方法推动其研究。80 年代以来, 由于分子生
物学技术和理论的飞速发展,DNA 序列分析已成为植物学系统发育研究的重要手段〔4, 5〕,
藻类学在这方面的研究工作近年也开始有报道〔5～ 8〕。在各种研究的分子序列中 n rDNA
IT S 以其保守性、稳定性、独立性及恒定的分子进化速率而成为科以下分子系统发育研究
的重要分子性状〔5, 6, 9〕。现在从 Genbank 中已经可查到 15 种衣藻的 IT S 序列, 全部由
A nnet te co lem an 测序。A nnet te co lem an 通过分析 IT S 二级结构, 尝试研究团藻目下各个
科间的进化关系〔6〕。其中部分涉及莱茵衣藻 (Ch lam y d om onas reinha rd tii)亲缘种的研究,
但迄今一直没有通过 IT S 序列分析研究衣藻属下种间亲缘关系和系统发育关系的报道。
本文通过实验分析和互连网获取衣藻属下 16 个种的 n rDNA IT S 序列, 对其进行分子序
列分析, 以从分子水平上探讨其亲缘关系, 并将结果同表征性状分支分析结果进行比较。
1 材料和方法
1. 1 材料
实验分析用的莱茵衣藻Ch lam y d om onas reinha rd tii # 479 来源于本实验室藻种库。
1. 2 nrD NA ITS 的提取、PCR 反应和序列测定
用本实验室改进的 SD S 法〔10〕破碎细胞提取总DNA。用真核藻类 IT S 序列的特异性
PCR 引物〔7〕, 扩增 n rDNA IT S 区域。扩增产物经过W izard PCR P rep s DNA Pu rif ica t ion
System 纯化后用于测序。
手工测序: 采用双脱氧链终止法〔10, 11〕, 以 Α235 s2dA T P 作为放射性标记, 用 4 个引物进
行测序, 得到整个 IT S 区及 518s 区的序列。测序反应产物用 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳进
行分离; 随后将胶转移到 3 mm W hatm an 滤纸上, 移至普通烘箱, 50℃干燥 3 小时后压
片, 放射自显影。
自动测序: 在中国科学院水生生物研究所用自动测序仪测序。自动测序结果同手工测
序结果相吻合。
1. 3 分子数据处理
通过互连网从 Genbank 中获取衣藻属下 15 个种和U lotrix z ona ta 的 n rDNA IT S 区
及 518s 区全序列; 加上实验所测的 C. reinha rd tii IT S 序列, 共 16 种衣藻序列, 用
091 武 汉 植 物 学 研 究 第 18 卷
C lu sta lx 程序〔12〕进行对准排序。再用 PhYL IP 软件包1) , 采用最大简约法〔5, 9〕获得最大简
约树; 应用自展法检验系统树, 自展数据集为 1 000 次。分支分析中采用U. z ona ta 的
n rDNA IT S 序列作为外类群。序列和样品来源 (包括外类群)见表 1。
表 1 序列和样品来源
T able 1 Source of sequences and stra ins
种 名
Species
序列来源
Sequence o rig in
Genbank 收录号
Genbank accesion
种 名
Species
序列来源
Sequence o rig in
Genbank 收录号
Genbank accesion
U loth rix z ona ta Genbank Z47999 C. incerta Genbank U 66950
C. reinhard tii # 479 Genbank A F156601 C. komm a Genbank U 66951
C. asymm etrica Genbank U 66944 C. ly eng arii Genbank U 66952
C. ca llosa Genbank U 66945 C. m ex icana Genbank U 66953
C. cribrum Genbank A F033281 C. noctig am a Genbank A F033283
C. cu lleus Genbank U 66946 C. sm ith ii Genbank A F033293
C. eug am etos Genbank A F033298 C. p itschm ann ii Genbank A F033301
C. g eitleri Genbank U 66947 C. z ebra Genbank A F033294
C. g ela tinosa Genbank U 66948
1. 4 表征性状的分支分析〔13〕
对以上 16 种衣藻的传统表征分类性状进行分析。选取易获取、较重要、稳定、普遍存
在的 12 条性状, 以U. z ona ta 动孢子的相应原始性状为衣藻属分支分析外类群性状; 运用
外类群比较法, 对 12 个形态性状进行了极化, 即区分祖征和衍征。用于分支分析的表征形
态性状及性状编码见表 2。
表 2 形态性状及性状编码表
T able 2 M o rpho logical characters and their codes
形 态 性 状
M o rpho logical characters
性状类型3
T ype
性状编码
Code
细胞形态对称
Symm etrical in cell’s shape 二 0 (是) , 1 (否)
眼点在前端
Eyespo t at fron t of cell 二 0 (是) , 1 (否)
眼点在中部
Eyespo t in the m iddle of cell 二 0 (否) , 1 (是)
有无胶质鞘
Cell sheath 二 0 (否) , 1 (是)
形态椭圆
E llip tical shaped 二 0 (是) , 1 (否)
乳突大小
Size of pap illa 多
0 (无) , 1 (小) , 2 (大)
(0→1→2)
乳突形状
Shape of pap illa 多
0 (无) , 1 (楔形) , 2 (方形) , 3 (双凸形)
(0→1→2, 1→3)
色素体杯状
Ch lo rop last cup2shaped 二 0 (是) , 1 (否)
色素体在侧位
Ch lo rop last app ressed to w all on one side 二 0 (是) , 1 (否)
色素体分布在基部且很厚
Ch lo rop last basal and th ick 二 0 (是) , 1 (否)
蛋白核分布在基部
Pyreno id basal 二 0 (是) , 1 (否)
色素体上有条纹
Stripes on the ch lo rop last 二 0 (否) , 1 (是)
3 “二”为二态性状 (B inary characters) ,“多”为多态性状 (M ultip le characters)。
1) Felsenstein J. PH YL IP (Phylogeny Inference Package) V ersion 3. 57c. D epartm en t of Genetics, U n iversity of
W ash ington, Seatt le. 1998.
191 第 3 期 张 弛等: 衣藻属的系统发育分析——基于形态形状和nrDNA IT S 序列
用 12 个性状对 16 个种和 1 个外类群构建的原始数据矩阵如下。
种名 性状编码 种名 性状编码
U. z ona ta 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C. g ela tinosa 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0
C. asymm etrica 1 0 0 0 2 2 1 0 0 1 1 0 C. ly eng arii 0 1 0 1 2 1 0 1 0 0 0 0
C. ca llosa 0 1 0 0 2 1 0 1 0 0 0 0 C. m ex icana 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0
C. cribrum 0 1 0 0 2 1 0 1 0 0 0 0 C. noctig am a 0 1 0 1 2 1 0 1 0 0 1 0
C. cu lleus 0 0 0 0 2 1 1 0 1 1 0 0 C. p itschm ann ii 0 0 0 1 2 1 1 0 1 1 0 0
C. eug am etos 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 C. reinhard tii 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0
C. g eitleri 0 1 0 1 2 3 1 1 0 1 1 0 C. sm ith ii 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0
C. incerta 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 C. z ebra 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
C. komm 0 1 0 0 2 2 0 1 0 0 0 0
应用 PH YL IP 软件包的 FA CTOR 程序, 将原始数据矩阵转化为二元数据矩阵; 应用
M IX 程序 (W agner 法)〔14〕对二元数据矩阵构建最简约树; 应用CON SEN SE 程序获得一
个严格一致树。
2 结果与分析
( 1) 序列分析表明, 在总长度为 654 bp 的序列中, IT S 区总长度 ( IT S21+ IT S22) 为
4062496 bp。518s 区长度除C. asym m etrica 为 160 bp 外都是 158 bp。
(2) 对 17 个种 (包括外类群)进行性状分析, 分析了 15 个二元性状〔14〕, 二元数据矩阵
结果如下:
U. z ona ta 000000000000000 C. z ebra 010100000000001
C. komm a 010011110010000 C. g ela tinosa 011100000010000
C. asymm etrica 100011110100110 C. ly eng arii 010111100010000
C. ca llosa 010011100010000 C. m ex icana 100010000110110
C. cribrum 010011100010000 C. noctig am a 010111100010010
C. cu lleus 000011100101100 C. p itschm ann ii 000111100101100
C. eug am etos 000100000001110 C. incerta 000100000010000
C. g eitleri 010111101110110 C. reinhard tii 000100000010000
C. sm ith ii 010010100010000
(3) n rDNA IT S 分子系统发育树见图 1。
(4) 形态性状分支分析树见图 2。
3 讨论
比较图 1 和图 2 可以看出, 在 IT S 分子树中亲缘近的 3 对种 C. incerta 与 C.
reinha rd tii # 479; C. g eitleri 与C. noctig a rna; C. asym m etrica 与C. m ex icana 在形态分支
分析树中关系也最密切。这种一致性一方面表明这些亲缘关系的判断是可信的, 另一方面
证明 IT S 分子分析至少部分支持了传统形态分类分析的结果。但这两种分析结果仍有显
著的不同之处。有些种亲缘关系划分的结果不一样。如, 在分子树中C. p itschm ann ii 和C.
eug am etos 亲缘关系最近, 而在形态分子分析树中, 它们位于 2 个不同的单系类群中。这种
分子分析与传统形态分析结果的不一致性,A nnet te co lem an 在用 n rDNA IT S 二级结构
的分析中也指出过〔8〕。从总体上看 n rDNA IT S 系统发育树中 C. kom m a、C. reinha rd tii
# 479、C. incerta、C. ly eng a rii、C. z ebra、C. ca llosa 和 C. cribrum 构成 1 个单系类群, 其它
291 武 汉 植 物 学 研 究 第 18 卷
图 1 14 种衣藻 nrDNA ITS 的 50% 多数一致树
F ig. 1 T he 50% m ajo rity tree of 14
species of genus Ch lamy d om onas
base on IT S sequences of n rDNA
图 2 形态性状分支分析的 50% 多数一致树
F ig. 2 T he 50% m ajo rity tree of 16
species of Ch lamy d om onas genus
based on mo rpho logical characters
8 个种构成 4 个单系类群, 每个单系类群只由 2 个种构成, 这 5 个姊妹类群平行进化。而
在形态学分支分析树中, 16 个种分成 2 个大的单系类群, 形成相对较复杂的分支进化关
系。考虑衣藻属是一大类原始终生为游动的单细胞鞭毛绿藻的集合, 数目多达 500 种以
上, 相互间形态差异很大, 很有可能是多起源平行进化的, 这同 IT S 分子树反映相一致。
实际上当我们用属于衣藻科下另一个属的血球藻作外类群来重构这 16 个种的系统发育
树, 发现他们根本就不能形成单系类群 (文章待发表)。这表明衣藻属的传统划分标准可能
不能很好地反映种间的亲缘关系, 有些种的分类位置可能需要调整。形态分支树之所以较
分子树的结构复杂, 可能是由于形态性状的表达较易受环境影响, 有的重要性状在许多种
中不容易被观察记录下来——例如并不是所有的种都观察到有性生殖的现象, 而这又是
分析种间亲缘关系的重要依据, 并且其进化较易受自然选择的制约而不稳定。另外, 形态
性状的选取受主观因素的影响较大, 不同的分类理论侧重于不同的性状而难以找到客观
统一的标准。因而, 形态性状分支分析树相对复杂的层次关系包含有一定的主观因素。
n rDNA IT S 分子序列的进化较稳定、独立, 序列分析中也较少受主观的影响, 可以作为衣
藻属传统形态分支分析的有力补充, 以获得较客观的分析结果, 并对传统分类确定的衣藻
属种间亲缘关系进行验证。当然, 仅 700 bp 长的 n rDNA IT S 序列不能反映基因组的全部
信息。而迄今 500 多种衣藻中, 只测了 16 个种的 IT S 序列, 对他们的分析未必能正确和全
面地反映该属的系统发育状况, 这还有待于更多的衣藻 n rDNA IT S 序列的测出。
391 第 3 期 张 弛等: 衣藻属的系统发育分析——基于形态形状和nrDNA IT S 序列
参 考 文 献
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