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Qualitative and Quantitative Analysis of Diterpenoid Compounds in Sphagneticola trilobata (L.) Pruski

南美蟛蜞菊中二萜化学成分的定性与定量分析研究



全 文 :南美蟛蜞菊[Sphagneticola trilobata (L.) Pruski]
别 名 三 裂 叶 蟛 蜞 菊、地 锦 花、穿 地 龙,为 菊 科
(Compositae)蟛蜞菊属多年生草本植物,原产于热
带美洲,现在广泛分布在全球热带、亚热带地区。
南美蟛蜞菊因具有强的入侵扩张能力,已被列为
“世界 100 种恶性外来入侵生物”之一[1–2]。南美蟛
热带亚热带植物学报 2015, 23(6): 703 ~ 709
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期: 2015–02–05    接受日期: 2015–03–26
基金项目: 国家自然科学基金项目(31270406); 广东省自然科学基金项目(2014A030313742); 中国科学院仪器功能开发项目(YG2012050)资助
作者简介: 贾永霞,女,高级工程师,主要从事色谱仪器分析工作。E-mail: jyx@scbg.ac.cn
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: jwtan@scbg.ac.cn
南美蟛蜞菊中二萜化学成分的定性与定量分析研究
贾永霞1, 任慧1,2, 周忠玉1, 徐信兰1, 谭建文1*
(1. 中国科学院华南植物园,中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室,广州 510650; 2. 中国科学院大学,北京 100049)
摘要: 为了解南美蟛蜞菊[Sphagneticola trilobata (L.) Pruski]植物的化学成分,从其全株乙醇提取物中分离得到 8 个二萜类化合
物。经光谱分析,分别鉴定为 ent-16β,17-dihydroxy-9(11)-kauren-19-oic acid (1)、cussovantonin B (2)、ent-16-kauren-19-oic acid
(3)、ent-3β-hydroxy-16-kauren-19-oic acid (4)、16α-hydroxy-ent-kauran-19-oic acid (5)、2β,16α-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (6)、
3α-angeloyloxypterokaurene L3 (7)和 pterokaurene L3 (8)。化合物 4 为首次从蟛蜞菊属植物中分离获得,化合物 1、2 和 6 为首次
从南美蟛蜞菊中分离得到。化合物 3 具有显著的抗菌活性和显著抑制 α-葡萄糖苷酶活性。采用五氟苄溴进行底物五氟苄基衍
生化并结合 GC-MS 分析表明,化合物 3 在南美蟛蜞菊茎和叶中的含量分别为(1.00±0.21) mg g–1 FW 和(0.78±0.04) mg g–1 FW。
关键词: 南美蟛蜞菊; 二萜化合物; 抗菌; α-葡萄糖苷酶抑制剂; 定量分析
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.06.016
Qualitative and Quantitative Analysis of Diterpenoid Compounds in
Sphagneticola trilobata (L.) Pruski
JIA Yong-xia1, REN Hui1,2, ZHOU Zhong-yu1, XU Xin-lan1,2, TAN Jian-wen1*
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,
Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: In order to understand the chemical constituents of Sphagneticola trilobata (L.) Pruski, eight diterpenoids
were isolated from the ethanol extract of its whole plants. On the basis of spectral data, they were identified as
ent-16β,17-dihydroxy-9(11)-kauren-19-oic acid (1), cussovantonin B (2), ent-16-kauren-19-oic acid (3), ent-
3β-hydroxy-16-kauren-19-oic acid (4), 16α-hydroxy-ent-kauran-19-oic acid (5), 2β,16α-dihydroxy-ent-kauran-
19-oic acid (6), 3α-angeloyloxypterokaurene L3 (7) and pterokaurene L3 (8). Compound 4 were isolated from
genus Sphagneticola for the first time, and compounds 1, 2 and 6 were isolated from S. trilobata for the first
time. Compound 3 showed strong antibacterial activity against several bacteria and further inhibited significantly
α-glucosidase activity in vitro. Based on structural derivation with pentafluorobenzyl bromide coupled with GC-
MS techniques, the contents of compound 3 in the stem and leaves of S. trilobata were (1.00±0.21)mg g–1 FW and
(0.78±0.04) mg g–1 FW, respectively.
Key words: Sphagneticola trilobata; Diterpenoids; Antibacterial; α-Glucosidase inhibitor; Quantitative analysis
704 第23卷热带亚热带植物学报
蜞菊自 20 世纪 70 年代作为地被植物引入我国,很
快便逸生为园圃杂草,目前已对华南很多地区的农
田、果园等造成显著危害,严重破坏了森林景区的
生态环境,威胁着华南地区的物种多样性,并造成
较大的经济损失[3]。
据文献报道,南美蟛蜞菊在加勒比海和中美洲
地区被民间用作传统药物 , 医治蛇伤、感冒、腰痛、
肌肉痉挛、风湿病、褥疮、关节炎等多种疾病[2,4]。目
前已报道的南美蟛蜞菊化学成分主要有倍半萜、二
萜、三萜等类型,其中部分化合物已被揭示具有抗
疟疾、抗菌、抗肿瘤或抗病毒等活性[2–9]。为进一步
揭示南美蟛蜞菊的生物活性化学物质基础,我们对
南美蟛蜞菊全株的化学成分进行了系统研究。
本文报道其二萜化合物的分离鉴定及其抗菌
和抑制 α-葡萄糖苷酶方面的活性,同时采用五氟苄
基衍生化结合 GC-MS 分析技术对强活性二萜化合
物 3 在南美蟛蜞菊茎和叶中的含量进行测试分析。
1 材料和方法
1.1 材料
用 于 二 萜 成 分 提 取 分 离 的 南 美 蟛 蜞 菊
[Sphagneticola trilobata (L.) Pruski]全 株 材 料 于
2011 年 9 月采自中国科学院华南植物园科研生
活 区,经 中 国 科 学 院 华 南 植 物 园 邢 福 武 研 究 员
鉴 定,标 本 保 存 于 中 国 科 学 院 华 南 植 物 园 生 物
有 机 化 学 实 验 室。2014 年 11 月 又 在 同 地 采 集
南 美 蟛 蜞 菊 茎 和 叶 用 于 分 析 化 合 物 3 的 含 量。
正相层析硅胶为青岛海洋化工有限公司产
品(80~100 目,200~300 目);反 相 层 析 硅 胶 YMC
ODS-A (50 μm)为日本 YMC 公司生产;薄层色谱正
相硅胶板(HFGF254)为山东烟台江友硅胶开发有限
公司产品;凝胶 Sephadex LH-20 为瑞典 Amersham
Biosciences 公司生产;氘代试剂为 Sigma 公司产
品。显色方法包括紫外荧光显色(254 nm)、碘蒸气
显色和喷洒硫酸-乙醇溶液(10:90,V/V)加热显色。
1.2 仪器
电喷雾质谱(ESIMS)采用美国应用生物系统
公司 MDS SCIEX API 2000LC/MS/MS 仪;1H NMR
谱和 13C NMR 谱采用 Bruker Avance 600 和 Bruker
Avance HD 500 核磁共振仪,并以四甲基硅烷为
内标;中压半制备使用北京创新通恒科技有限公
司的 HPLC 半制备系统,泵型号 P3000,检测器为
UV3000 UV-VIS,反相色谱柱(400 mm×25 mm i.d.);
减压浓缩采用日本东京理化公司 N-1000 旋转蒸发
仪、CCA-1110 循环式冷却箱和 SB-1000 电热恒温
水 浴 锅;GC-MS 分 析 采 用 Shimadzu 公 司 GCMS-
QP2010Plus 仪,色谱柱为 HP-5MS (30 m×0.25 mm
i.d.×0.25 μm film.)。
1.3 提取和分离
南美蟛蜞菊全株(干重 8 kg)粉碎后用 95% 的
乙醇在室温浸泡提取 3 次,每次 2 d,合并提取液;
经减压浓缩将提取液中乙醇抽干后加适量水使其
成为混悬液,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,各萃取
4 次;减压浓缩后分别得到石油醚部分(180 g)、乙酸
乙酯萃取部分(140 g)。
石油醚萃取部分经正相硅胶柱层析(200~300 目),
以 石 油 醚-丙 酮50:1~0:1, V/V, 每 次 10 L)梯 度 洗
脱,检测合并主点相同的流分,得到 P1~P12 共 12 个
组分。组分 P5 (18.8 g)用石油醚 - 丙酮(10:1)洗脱 ,
经正相硅胶柱层析(200~300 目)以石油醚-乙酸乙
酯(40:1~1:1)梯度洗脱,检测合并主点相同的流分,
得到 P5-1~P5-5 共 5 个组分。P5-3 (8.9 g)经 ODS 反相
硅胶柱层析(50 µm),以甲醇-水(60:40~100:0)梯度
洗脱,检测合并主点相同的流分,得到 P5-3-1~P5-3-6
共 6 个亚组分。P5-3-1 (0.11 g)、P5-3-3 (0.08 g)分别经
Sephadex LH-20 柱层析,以氯仿:甲醇(1:4)洗脱,得
到化合物 8 (13.6 mg)和 4 (7.5 mg)。P8 组分(4.2 g)
用石油醚 - 丙酮(2:1)洗脱,经 ODS 反相硅胶柱层
析(50 µm),以甲醇-水(50:50~100:0)梯度洗脱,检
测合并主点相同的流分,得到 P8-1~P8-5 共 5 个组分。
P8-4 (0.4 g)经正相硅胶柱层析(200~300 目),以石油
醚-乙酸乙酯(5:1)梯度洗脱,得到化合物 7 (8.9 mg)
和 5 (9.4 mg)。
乙酸乙酯萃取部分(140 g)经正相硅胶柱层析
(200~300 目),以氯仿-甲醇(50:1~0:1, 每次 9 L)梯
度洗脱,检测合并主点相同的流分,得到 E1~E11 共
11 个组分。E2 组分(17.6 g)用氯仿-甲醇(50:1)洗脱,
经正相硅胶柱层析(200~300 目),以石油醚-乙酸乙
酯(20:1~2:1)梯度洗脱,检测合并主点相同的流分,
得到 E2-1~E2-5 共 5 个组分。E2-1 (0.12 g)经 Sephadex
LH-20 柱层析,以氯仿:甲醇(1:4)洗脱,得到化合
物 3 (25.0 mg)。E3 组分(26.7 g)用氯仿-甲醇(25:1)
洗脱,经正相硅胶柱层析(200~300 目)以氯仿-甲
第6期 705
醇(100:1~10:1)梯度洗脱,检测合并主点相同的流
分,得 到 E3-1~E3-7 共 7 个 组 分。E3-4 (6.9 g)经 ODS
反 相 硅 胶 柱 层 析(50 µm),以 甲 醇-水(40:60~100:
0 ) 梯 度 洗 脱 ,检 测 合 并 主 点 相 同 的 流 分 ,得 到
E 3 - 4-1~E3-4-7 共 7 个亚组分。E3-4-6 (0.9 g)经 Sephadex
LH-20 柱层析,以氯仿:甲醇(1:4)洗脱,检测合并主
点相同的流分,得到 E3-4-6-1~E3-4-6-2 共 2 个亚组分。
E3-4-6-2 (0.19 g)经正相硅胶柱层析(200~300 目),以
石油醚-乙酸乙酯(5:1)等度洗脱,得到化合物 1
(6.8 mg)。E3-5 (6.1 g)经 ODS 反 相 硅 胶 柱 层 析
(50 µm),以甲醇-水(40:60~100:0)梯度洗脱,检测
合并主点相同的流分,得到 E3-5-1~E3-5-3 共 3 个亚组
分。E3-5-3 (0.16 g)经Sephadex LH-20柱层析,以氯仿:
甲醇(1:4)洗脱,得到化合物 6 (11.7 mg)。E4 组分
(4.1 g)用氯仿-甲醇(10:1)洗脱,经 ODS 反相硅胶
柱 层 析(50 µm),以 甲 醇-水(30:70~100:0)梯 度 洗
脱,检测合并主点相同的流分,得到 E4-1~E4-7 共 7 个
组分。E4-3 (0.09 g)经正相硅胶柱层析(200~300 目),
以氯仿-甲醇(20:1)梯度洗脱,得到化合物 2 (1.0 mg)
(图 1)。
1.4 结构鉴定
ent-16β,17-Dihydroxy-9(11)-kauren-19-oic
acid (1)  白色粉末; 分子式为 C20H30O4; ESI-MS
(+) m/z: 707 [2M + K]+, 691 [2M + Na]+, 373 [M +
K]+, 357 [M + Na]+, ESI-MS (–) m/z: 667 [2M –H]–,
369 [M +Cl]–, 333 [M –H]–; 1H NMR (600 MHz,
C5D5N): δ 5.26 (1H, s, H-11), 4.04 (1H, d, J = 11.0 Hz,
H-17a), 4.00 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-17b), 1.33
(3H, s, H-18), 1.30 (3H, s, H-20); 13C NMR (150 MHz,
C5D5N): δ 180.7 (s, C-19), 158.7 (s, C-9), 114.8 (d,
C-11), 85.2 (s, C-16), 69.4 (t, C-17), 56.3 (t, C-15),
47.4 (d, C-5), 45.4 (s, C-10), 45.3 (d, C-13), 44.4 (t,
C-14), 43.8 (s, C-4), 42.2 (t, C-1), 39.7 (s, C-8), 39.6
(t, C-3), 31.5 (t, C-7), 31.4 (t, C-12), 29.2 (q, C-18),
24.6 (q, C-20), 21.5 (t, C-2), 19.6 (t, C-6)。上述光谱
数据与文献[10]报道一致。
Cussovantonin B (2)   白 色 粉 末; 分 子 式
为 C20H32O5; ESI-MS (+) m/z: 727 [2M + Na]
+, ESI-
MS (–) m/z: 703 [2M–H]–, 351 [M–H]–; 1H NMR
(600 MHz, CD3OD): δ 3.70 (1H, d, J = 11.4 Hz,
H-17a), 3.59 (1H, d, J = 11.4 Hz, H-17b), 3.09 (1H,
dd, J = 12.2, 4.6 Hz, H-3), 1.36 (3H, s, H-18), 1.02
(3H, s, H-20); 13C NMR (150 MHz, CD3OD): δ 181.6
(C-19), 82.9 (C-16), 79.3 (C-3), 66.9 (C-17), 57.3
(C-9), 57.2 (C-5), 53.6 (C-15), 49.6 (C-4), 46.2 (C-
13), 45.6 (C-8), 43.3 (C-7), 40.5 (C-1), 40.4 (C-10),
38.1(C-14), 29.3 (C-2), 27.2 (C-12), 24.4 (C-18), 23.2
(C-6), 19.7 (C-11), 16.5 (C-20)。上述光谱数据与文
献[11]报道一致。
ent-16-Kauren-19-oic acid (3)  白色粉末;
分子式为 C20H30O2; ESI-MS (+) m/z: 643 [2M + K]
+,
贾永霞等:南美蟛蜞菊中二萜化学成分的定性与定量分析研究
图 1 化合物 1~8 的结构
Fig. 1 Structures of compounds 1−8
706 第23卷热带亚热带植物学报
627 [2M + Na]+, 325 [M + Na]+, 303 [M + H]+, ESI-
MS (–) m/z: 603 [2M –H]–, 301 [M –H]–; 1H NMR
(600 MHz, CDCl3): δ 4.78 (1H, s, H-17a), 4.72 (1H,
s, H-17b), 2.62 (s, 1H, H-13), 1.22 (3H, s, H-18), 0.93
(3H, s, H-20); 13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 184.7
(C-19), 156.1 (C-16), 103.2 (C-17), 57.3 (C-5), 55.4
(C-9), 49.2 (C-15), 44.5 (C-4), 44.1 (C-13), 44.0 (C-
8), 41.5 (C-7), 40.9 (C-1), 39.9 (C-10, C-14), 38.0 (C-
3), 33.3 (C-12), 29.2 (C-18), 22.1 (C-6), 19.3 (C-2),
18.7 (C-11), 15.8 (C-20)。上述光谱数据与文献[12]
报道一致。
ent-3β-hydroxy-16-kauren-19-oic acid (4)  
白色粉末; 分子式为 C20H30O3; ESI-MS (–) m/z: 317
[M–H]–; 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4.82 (1H, s,
H-17a), 4.76 (1H, s, H-17b), 4.59 (1H, dd, J = 12.0,
4.2 Hz, H-3), 1.30 (3H, s, H-18), 1.06 (3H, s, H-20);
13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 180.3 (C-19), 155.5
(C-16), 103.4 (C-17), 78.9 (C-3), 56.5 (C-5), 55.3 (C-
9), 48.9 (C-15), 48.2 (C-4), 44.1 (C-8), 43.9 (C-13), 41.1
(C-7), 39.6 (C-14), 39.5 (C-1), 38.9 (C-10), 33.2 (C-12),
27.9 (C-2), 24.1 (C-18), 21.7 (C-6), 18.7 (C-11), 15.5 (C-
20)。上述光谱数据与文献[13]报道一致。
16α-Hydroxy-ent-kauran-19-oic acid (5)
白色粉末; 分子式为 C20H32O3; ESI-MS (+) m/z: 664
[2M + Na]+, 343 [M + Na]+, ESI-MS (–) m/z: 639
[2M–H]–, 319 [M–H]–; 1H NMR (600 MHz, C5D5N):
δ 2.49 (1H, d, J = 13.0 Hz, H-3), 2.31 (1H, m, H-2),
2.23 (1H, m, H-6), 2.14 (1H, br s, H-13), 1.97 (1H,
d, J = 13.7 Hz, H-15), 1.90 (1H, d, J = 12.7 Hz, H-1),
1.78 (1H, d, J = 12.8 Hz, H-7), 1.69 (1H, d, J =
13.7 Hz, H-15), 1.58 (3H, s, H-17), 1.36 (3H, s, H-18),
1.22 (3H, s, H-20), 0.88 (1H, m, H-1); 13C NMR
(150 MHz, C5D5N): δ 180.7 (C-19), 78.5 (C-16), 59.1
(C-15), 57.6 (C-5), 56.9 (C-9), 49.7 (C-13), 46.1 (C-
8), 44.5 (C-4), 43.2 (C-7), 41.6 (C-1), 40.6 (C-10),
39.3 (C-3), 38.6 (C-14), 29.9 (C-18), 27.8 (C-12),
25.6 (C-17), 23.4 (C-6), 20.4 (C-2), 19.2 (C-11), 16.6
(C-20)。上述光谱数据与文献[14]报道一致。
2β,16α-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (6)
白色粉末; 分子式为 C20H32O4; ESI-MS (+) m/z: 695
[2M + Na]+, 359 [M + Na]+, ESI-MS (–) m/z: 671
[2M–H]–, 335 [M–H]–; 1H NMR (600 MHz, CD3OD):
δ 4.10 (1H, ddd, J = 11.4, 6.9, 4.7 Hz, H-2), 1.34 (3H,
s, H-17), 1.25 (3H, s, H-18), 0.99 (3H, s, H-20);
13C NMR (150 MHz, CD3OD): δ 181.0 (C-19), 79.8
(C-16), 65.0 (C-2), 58.4 (C-15), 57.5 (C-5), 57.3 (C-
9), 50.6 (C-1), 49.5 (C-13), 47.7 (C-3), 46.3 (C-8),
45.8 (C-4), 43.1 (C-7), 42.1 (C-10), 38.5 (C-14), 29.4
(C-18), 27.8 (C-12), 24.4 (C-17), 23.0 (C-6), 19.4 (C-11),
17.3 (C-20)。上述光谱数据与文献[15]报道一致。
3α-Angeloyloxypterokaurene L3 (7)  白色粉
末; 分 子 式 为 C25H36O5; ESI-MS (+) m/z: 439 [M +
Na]+, 417 [M +H]+, ESI-MS (–) m/z: 831 [2M –H]–,
415 [M –H]–; 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 6.04
(1H, qd, J = 7.0, 1.5 Hz, H-3′), 4.79 (1H, s, H-17a),
4.75 (1H, s, H-17b), 4.62 (1H, dd, J = 12.2, 4.7 Hz,
H-3), 1.95 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-4′), 1.85 (3H, t, J =
1.5 Hz, H-5′), 1.28 (3H, s, H-18), 1.15 (3H, s, H-20);
13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 180.1 (C-19), 167.9
(C-1′), 154.9 (C-16), 138.2 (C-3′), 129.0 (C-2′), 103.7
(C-17), 78.6 (C-3), 77.6 (C-9), 49.4 (C-5), 49.2 (C-
8), 48.2 (C-4), 43.9 (C-10), 43.9 (C-15), 42.4 (C-13),
40.5 (C-14), 36.1 (C-7), 34.7 (C-12), 30.8 (C-1), 30.2
(C-11), 24.3 (C-18), 24.1 (C-2), 21.6 (C-6), 20.9 (C-
5′), 17.4 (C-20), 15.9 (C-4′)。上述光谱数据与文献[6]
报道一致。
Pterokaurene L3 (8)  白色粉末; 分子式为
C20H30O3; ESI-MS (+) m/z: 659 [2M + Na]
+, 341 [M +
Na]+, ESI-MS (–) m/z: 635 [2M –H]–, 317 [M –H]–;
1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4.78 (1H, s, H-17a),
4.75 (1H, s, H-17b), 1.23 (3H, s, H-18), 1.08 (3H,
s, H-20); 13C NMR (150 MHz, CDCl3): δ 184.4 (C-
19), 155.2 (C-16), 103.3 (C-17), 77.8 (C-9), 50.2 (C-
5), 49.3 (C-8), 44.1 (C-10), 44.0 (C-15), 44.0 (C-4),
42.3 (C-13), 40.6 (C-7), 37.6 (C-3), 36.2 (C-1), 34.5
(C-14), 32.3 (C-12), 29.6 (C-11), 29.2 (C-18), 21.8
(C-6), 19.1 (C-2), 17.6 (C-20)。上述光谱数据与文
献[16]报道一致。
2 抗菌活性
采用刃天青显色法[17]和 96 孔稀释滴度技术,
测定化合物 1~8 对 4 种病原菌,即金黄色葡萄球
菌(Staphyloccocus aureus)、蜡 样 芽 孢 杆 菌(Bacillus
cereus)、萎蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfaciens)
和鼠伤寒沙门氏菌(Shigella dysenteriae)的最低抑
第6期 707
菌浓度(MIC)。先将 100 μL 100 μg mL–1 的刃天青
溶液放置到无菌的 96 孔板上的第 11 列板孔里;
取 7.5 mL 的指示剂溶液与 5 mL 的待测菌溶液
(106 CFU mL–1)混 合;接 着 转 移 100 μL 到 第 1 至
第 10 列 以 及 第 12 列 所 有 测 试 孔 中;待 测 样 品
(1 mg mL–1)溶液 100 μL 加入到第一列板孔中;这
时再从第一列取出 100 μL 的溶液转移到第二列,
然后接下几列用同样的方法(倍增稀释)到第 10 列,
再从第 10 列取出 100 μL 弃掉以保证每一列的孔
中的溶液均为 100 μL。最后,将加好样品的孔板
放入到恒温培养箱,37℃培养 5~6 h,直到孔板的
染色变成生长色:粉红色。检测活性标准:若颜色
无变化仍为蓝色表示有活性,颜色从蓝色变为粉红
色,表示无抑菌活性;发生的颜色变化的最低稀释
浓度被认为是待测化合物的最低抑菌浓度(MIC)。
一个 96 孔板可同时测量 6 个样品、1 个阳性对
照和 1 个阴性对照,每个处理重复 3 次,以硫酸卡
那霉素作为阳性对照。测试结果可见化合物 3 具
有与阳性对照硫酸卡那霉素接近或相当的体外抑
制 4 种测试菌的活性,化合物 4 仅有较弱的抑菌
活 性(MIC 值≥25 μg mL–1),而 其 他 化 合 物 则 不
显示明显的抗菌活性(MIC 值 >100 μg mL–1)(表 1)。
表 1 化合物 1~8 对 4 种细菌的最小抑菌浓度 MIC 值 (μg mL–1)
Table 1 MICs (μg mL–1) of compounds 1–8 against four bacterial strains
细菌
Bacteria
化合物 Compounds 硫酸卡那霉素
Kanamycin sulfate 1~2 3 4 5~8
金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus >100 16.25 25 >100 3.125
蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus >100 12.5 50 >100 6.251
萎蔫短小杆菌 Curtobacterium flaccumfaciens >100 12.5 >100 >100 3.125
鼠伤寒沙门氏菌 Shigella dysenteriae >100 13.125 25 >100 3.125
3 α-葡萄糖苷酶的抑制活性
采用比色法[17]在 96 孔细胞培养板中对二萜化
合物 1~8 进行抑制 α-葡萄糖苷酶活性的分析。先
将供试化合物及阿卡波糖用 DMSO 溶解,然后将
20 µL 的 α-葡萄糖苷酶(0.8 U)加入到样品孔中,将
测试样品溶液用磷酸缓冲液按一定比例稀释,每孔
加入样品溶液 120 µL,使测试样品的最终浓度分别
为 500、250 、125、62.5、31.25、15.625 µg mL–1,
最后再加入 20 µL 反应底物 4-硝基酚-α-D-吡喃葡
萄糖苷(5 mmol L–1),于 37℃水浴反应 15 min 后,每
个样品孔中加入 80 µL 的 NaCO3 溶液(0.2 mol L
–1)
终止反应,在 405 nm 波长处比色测定。阴性对照
为溶解样品溶液按测试样品的最终浓度用磷酸缓
冲液稀释加入反应,空白对照以相同体积的磷酸缓
冲液代替酶溶液,阴性空白以缓冲溶液代替样品测
试溶液加入反应孔中,样品空白以相同体积的磷酸
缓冲液代替酶溶液 , 采用阿卡波糖做阳性对照。抑
制率计算公式如下:
贾永霞等:南美蟛蜞菊中二萜化学成分的定性与定量分析研究
化合物的抑制率 (%)= ×100%
(OD 阴性对照 –OD 阴性空白 )
(OD 阴性对照 –OD 阴性空白 )–(OD 样品 –OD 样品空白 )
测试化合物对 α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度
(IC50)由剂量效应曲线得到。结果表明,仅化合物
3、4 和 8 对 α-葡萄糖苷酶有抑制活性,其 IC50 值
分别为(0.112±0.003)、(0.349±0.030)和(0.432±
0.006) mmol L–1,阳性对照阿卡波糖对 α-葡萄糖苷
酶抑制活性的 IC50 为(0.409±0.006) mmol L
–1,而其他
化合物均不显示明显的抑制活性(IC50>100 mmol L
–1)。
4 茎和叶中化合物3的含量
采用五氟苄溴对底物分子进行五氟苄基化衍
生并结合 GC-MS 分析的方法测定化合物 3 在南
708 第23卷热带亚热带植物学报
美蟛蜞菊茎和叶中的含量。化合物 3 为具有一个
羧基官能团的二萜化合物分子,此类有机化合物
分子于 55℃在三乙胺等有机碱催化下能与五氟苄
溴反应,迅速并较完全(>99%) 地转化为羧基被五
氟苄基化的衍生物,此类羧基被五氟苄基化的衍
生物在 GC-MS 分析中能呈现 [M]+ 以及 m/z=[M–
181]+ 和 181 的特征离子峰,可进行定性和定量分
析检测(图 2)。首先构建化合物 3 的标准曲线(方
程),准确称量 5 个质量的化合物 3 分别放入 5 个
2 mL 样品瓶中,各自分别加入 10 µL 三乙胺和
10 µL 五氟苄溴后置于 55℃封盖反应 30 min,然
后氮气吹干反应溶剂,用对应适量的二氯甲烷溶液
定容,分别配制成 10、5、2、1、0.5 mg mL–1 的溶
液并转移至 GC-MS 样品瓶进行 GC-MS 分析,分
析条件为:进样口温度 280℃,离子源温度 300℃,
传输线温度 300℃,质量扫描范围是 30~550 aum;
色谱柱分析条件是初始温度 150℃,保持 1 min,然
后以 20℃ min–1 的速度升到 280℃,保持 10 min,
依据化合物 3 样品浓度和 GC-MS 呈现的特征峰
值(tR=9.676 min)构建化合物 3 的标准曲线,方程
为 Y=278285.1X;R=0.99955,R2=0.99911。依据上
述条件测定茎和叶中化合物 3 的含量,分别准确称
取茎和叶新鲜组织约 1 g,液氮下磨粉后迅速转移
至离心管用正己烷[体积 = 材料鲜重(g)×15 mL]提
取 3 次,离心取上清液合并浓缩至干,称量提取物
质量。提取物中加入 30 µL 三乙胺和 30 µL 五氟苄
溴后置于 55℃封盖反应 20 min,氮气吹干反应溶剂
后,用二氯甲烷定容使得提取物浓度为 10 mg mL–1,
转 移 至 GC-MS 样 品 瓶 进 行 GC-MS 分 析,依 据
GC-MS 呈现化合物 3 的特征峰值并结合标准曲
线(方程)计算茎和叶中化合物 3 的含量,实验重复
3 次取平均值。结果表明,化合物 3 在南美蟛蜞菊
新鲜茎和叶中的含量分别为(1.00±0.21) mg g–1 和
(0.78±0.04) mg g–1。
图 2 化合物 3 的结构衍生化及衍生化合物 3-PFB 的 GC-MS 分析特征质谱图
Fig. 2 Structural derivation of compound 3 and characteristic MS spectral of the derivative of 3-PFB in GC-MS analysis
5 结论和讨论
本文对南美蟛蜞菊植物的化学成分进行了
研究,从其全株乙醇提取物中分离得到 8 个二萜
化 合 物,分 别 鉴 定 为 ent-16β,17-dihydroxy-9(11)-
kauren-19-oic acid (1)、cussovantonin B (2)、ent-16-
kauren-19-oic acid (3)、ent-3β-hydroxy-16-kauren-
19-oic acid (4)、16α-hydroxy-ent-kauran-19-oic acid
(5)、2β,16α-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (6)、
3α-angeloyloxypterokaurene L3 (7)和 pterokaurene L3
(8)。其中化合物 4 为首次从蟛蜞菊属中分离获得,
化合物 1、2 和 6 为首次从南美蟛蜞菊中分离得到。
利用刃天青染色法对化合物 1~8 进行了抗 4
种病原菌的活性测试,结果表明,化合物 3 对金黄色
葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、萎蔫短小杆菌和鼠伤寒
沙门氏菌菌株的最低抑菌浓度(MIC 值分别为 6.25、
12.5、12.5 和 3.125 μg mL–1)与阳性对照品硫酸卡那
霉素接近或相当(MIC 值为 3.125~6.25 μg mL–1),化
合物 4 显示弱的抗菌活性(MIC 值≥25 μg mL–1)。
采用比色法测试了 8 个二萜化合物抑制 α-
葡 萄 糖 苷 酶 的 活 性,结 果 表 明,化 合 物 3 对 α-
葡 萄 糖 苷 酶 具 有 比 阳 性 对 照 阿 卡 波 糖[IC50 为
(0.409±0.006) mmol L–1]强约 4 倍[IC50 为(0.112 ±
0.003) mmol L–1]的 抑 制 活 性,化 合 物 4 和 8 显 示
对 α-葡 萄 糖 苷 酶 有 一 定 的 抑 制 活 性,但 它 们 的
抑 制 活 性 都 显 著 弱 于 化 合 物 3。α-葡 萄 糖 苷 酶
抑制剂是治疗Ⅱ型糖尿病的一类重要药物,化合
物 3 在作为 α-葡萄糖苷酶抑制剂用于预防或辅
助 治 疗 糖 尿 病 方 面 具 有 潜 在 重 要 的 利 用 价 值。
化合物 3 是在抗菌和抑制 α-葡萄糖苷酶方面
均具有强生物活性的二萜化合物。采用五氟苄溴
对底物进行五氟苄基衍生化并结合 GC-MS 分析
第6期 709
的技术,首次对化合物 3 在南美蟛蜞菊茎和叶中的
含量进行了分析,结果表明,化合物 3 在南美蟛蜞
菊新鲜的茎和叶中的含量分别为(1.00±0.21) mg g–1
和(0.78±0.04) mg g–1,显示南美蟛蜞菊具备直接作
为原材料用于化合物 3 提取的应用开发潜力。
本研究结果进一步丰富了南美蟛蜞菊的药理
活性化学物质基础,揭示了二萜化合物 3 显著的抗
菌和抑制 α-葡萄糖苷酶的活性,及其在南美蟛蜞菊
植物茎和叶中的含量分布特征,对于促进南美蟛蜞
菊植物基于功能活性物质发掘的开发利用具有极
其重要的意义。
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