全 文 ：法 ,能准确地测定原料及制剂中的该成分含量 ,该方
法操作简便 ,重现性高 ,特异性强 ,是控制灵芝孢子
油和灵芝孢子粉类产品质量的有效方法和依据 。
参 考 文 献
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(2008-01-24收稿)
·药理 ·
半边旗二萜化合物 5F和大黄素影响 HO-8910PM
细胞中 GDF15表达的研究
何太平 1 ,吕应年2 ,龚先玲 2 ,莫丽儿 2 ,陈　功3 ,梁念慈 1＊
(1.广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东湛江 524023;2.广东天然药物研究与开发重点实验
室 ,广东湛江 524023;3.香港中文大学威尔斯亲王医院外科学系 ,香港)
　　摘要　目的:研究半边旗二萜化合物 5F(简称 PsL5F)和大黄素对人高转移卵巢癌 HO-8910PM细胞中生长分
化因子 15(GDF15)表达的影响 , 探讨它们抗肿瘤的作用机制。方法:应用肿瘤基因芯片 、荧光定量实时 PCR和
Westernblot法检测 PsL5F和大黄素对 GDF15表达的影响。结果:PsL5F和大黄素都能明显上调 GDF15表达。结
论:PsL5F和大黄素的抗肿瘤作用与 GDF15高表达有关。
关键词　半边旗二萜化合物 5F;大黄素;卵巢癌;GDF15
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)12-1845-04
Efectsof5FfromPterissemipinnataandEmodinonExpression
ofGDF15 inHO-8910PMCelLine
HETai-ping1 , LVYing-nian2 , GONGXian-ling2 , MOLi-er2 , CHENGong3 , LIANGNian-ci1
(1.InstituteofBiochemistryandmolecularBiology, GuangdongmedicalColege, Zhanjiang524023, China;2.GuangdongKeyLabora-
toryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs, Zhanjiang524023, China;3.DepartmentofSurgery, PrinceofWaleshospital, Fac-
ultyofmedicine, TheChineseUniversityofHongKong, HongKong, China)
Abstract　Objective:Toinvestigateefectsandmechanismsof5FfromPterissemipinnata(PsL5F)andemodinonexpressionof
growthdifferentiationfactor15(GDF15)inhighlymetastaticovariancarcinomaHO-8910PMcels.Methods:Theexpressionlevelof
GDF15 wasassessedbymicroarrayChip.Fluorescentquantitativereal-timePCRassayandWesternblotwereperformedtoverifythe
effectsofPsL5FandemodinonGDF15 expression.Results:PsL5Fandemodinsignificantlyup-regulatedtheexpressionofGDF15.
Conclusion:AntitumorefectsandmechanismsofPsL5FandemodinonHO-8910PM celsareassociatedwiththeexpressionof
GDF15.
Keywords　5FfromPterissemipinnataL.;Emodin;Ovariancarcinoma;GDF15
基金项目:粤港科技合作项目(GHP/022 /06);广东省卫生厅课题(B2005104);广东省中医药局课题(1060044)作者简介:何太平 ,男 ,副研究员 ,研究方向:生化药理学;Tel:0759-2388581-7, E-mail:taipinghe@ 163.com。＊通讯作者:梁念慈 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:生化药理学;Tel:0759-2388501, E-mail:ncliang@gdmc.edu.cn。
　　本课题组发现草药半边旗 (Pterissemipinnata
L., PsL)具有明显的抗癌作用 ,并分离和鉴定了几
种有效成分 ,其化学结构皆为二萜类化合物 。其中
之一 5F(简称 PsL5F)含量最高 ,其结构为 Ent-11α-
hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oicacid。近十年的研
究表明 , PsL5F能抑制多种癌细胞的生长 ,并初步探
讨了其作用机制 , 包括下调 NF-κB的活性 、下调
Bcl-2及 Bcl-xL的表达 、上调 Bax的表达和刺激
·1845·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 12期 2008年 12月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.12.029
P38mAPK的活性等 〔1-3〕。大黄素 (3-甲基-1, 6, 8-三
羟蒽醌)是从大黄 、虎杖和何首乌等多种中药分离
出的有效成分之一 ,研究表明大黄素在体外对多种
肿瘤细胞如食道癌细胞 〔4〕、肺腺癌细胞〔5〕和肝癌细
胞 〔6〕等具有明显的抗肿瘤作用 ,本课题组前期研究
结果表明大黄素还具有抑制高转移卵巢癌细胞转移
相关能力 〔7〕。但 PsL5F和大黄素抗肿瘤细胞的作
用机制还不完全清楚 。笔者应用肿瘤基因芯片研究
它们的抗肿瘤机制时发现 PsL5F和大黄素能明显诱
导人高转移卵巢癌 HO-8910PM细胞中生长分化因
子 15(GDF15)高表达 ,并分别用荧光定量实时 PCR
和蛋白印迹方法验证它们对 GDF15表达的影响 ,探
讨了它们抗肿瘤可能的作用机制。
1　材料与仪器
1.1　药品与试剂　小牛血清购自杭州四季青公
司;RPMI-1640培养基购自 Gibco公司;GDF15兔多
克隆抗体购自 Abgent公司;β-Actin兔 IgG多抗购自
SantaCruz公司;辣根过氧化物酶标记抗兔 IgG购自
北京中山公司;四氮唑蓝(MTT)购自上海华舜生物
公司;半边旗二萜化合物 5F由广东医学院天然药物
研究与开发重点实验室提供;大黄素购自 Sigma公
司 ,实验前分别用 DMSO溶解 ,培养基稀释 , DMSO
终浓度为 0.1%(实验证明该浓度对细胞无影响);
人高转移卵巢癌细胞 (HO-8910PM)购自上海细胞
生物研究所;人肿瘤基因芯片(OHS-802)构自 Su-
perAray公司 ,并委托上海康成生物公司检测。
1.2　仪器　XSB-1A型双目倒置显微镜;450型酶
标免疫测定仪 、Bio-Rad公司 Mini-ProteinIElectro-
phoresisCel和转移电泳槽(Bio-Rad公司);Rotor-
Gene3000 RealtimePCR仪 (CorbetResearch公
司)。
2　方法
2.1　肿瘤基因芯片检测 PsL5F和大黄素对 GDF15
表达的影响　培养 HO-8910PM细胞 ,分别用 0.1%
DMSO、 100 μmol/LPsL5F〔2〕和 40 μmol/L的大黄
素 〔7〕处理 HO-8910PM细胞 24 h,加 Trizol试剂融解
细胞 ,干冰运输至上海康成生物公司按芯片操作步
骤进行检测 ,并由上海康成生物公司出具检测报告 。
2.2　荧光定量实时 PCR验证 GDF15表达　参照
荧光定量实时 PCR要求设计引物 , GDF15:5′-
TGACTTGTTAGCCAAAGACTGCC-3′(Forward), 5′-
GAACCTTGAGCCCATTCCACA-3′(Reverse);β-Ac-
tin:5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′(Forward),
5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′(Reverse)。 用
0.1% DMSO、100 μmol/LPsL5F和 40 μmol/L的大
黄素处理 HO-8910PM细胞 24h后提取 HO-8910PM
细胞总 RNA,变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA质量。
按反转录试剂盒操作流程行反转录实验 。配实时
PCR反应体系 (dNTP2.5 μl, 10 ×PCR缓冲液 2.5
μl, MgCl2溶液 1.5 μl, Taq聚合酶 1 unit, Sybergreen
终浓度 0.25 ×, 10 μmol/L的 PCR特异引物 P1 1
μl, 10μmol/L的 PCR特异引物 P2 1μl, cDNA1μl,
加水至总体积为 25μl),置于 Rotor-Gene3000 Real-
timePCR仪上进行 PCR反应 ,反应条件如下:NAG-
1:95℃, 5min;35cycles(95℃, 10s;60℃, 15s;72℃,
20s;85℃, 5s);Actin:95℃, 5min;35cycles(95℃,
10s;57℃, 15s;72℃, 20s;85.5℃, 5s)。 72℃至 99℃
绘制溶解曲线 ,然后采用比较阈值法对实时定量
RT-PCR结果进行定量分析。
2.3　Westernblot分析 GDF15蛋白表达　取对数
生长期的 HO-8910PM细胞 ,稀释成 106 /ml,接种于
50mm的培养皿中培养 ,每皿 5ml。待细胞贴壁后 ,
分别以 0.1% DMSO、 100 μmol/LPsL5F和 40
μmol/L的大黄素处理 HO-8910PM细胞 24 h后 ,收
集细胞 , PBS洗涤 2次 ,加入预冷的细胞裂解液 100
μl,用细胞刮将细胞刮下 ,并转移至预冷的 1.5 ml
离心管中 。置于碎冰上冰育 20 min后 , 4℃、12000
×g离心 15 min。 BCA法测定上清液中蛋白含量。
蛋白样品和 4×上样缓冲液以 3∶1混合 , 100℃水中
煮沸 5 min使蛋白质变性。 SDS-PAGE电泳后电转
移至 PVDF膜上 , 5%脱脂牛奶封闭后加入 GDF15
抗体于室温孵育 2h, 用 TBS缓冲液洗涤 3次 、每次
10 min,加入 HRP-anti-Rabbit-IgG于室温孵育 2 h,
再用 TBS缓冲液洗涤 3次 、每次 10min,加超敏发光
试剂显影;再用洗膜液(2% SDS, 65.5 mmol/LTris-
HCl, pH=6.8, 100 mmol/Lβ-Mercaptoethanol)室温
洗膜 30min,加 β-Actin多克隆兔抗体室温孵育 2h,
用 TBS洗 3次 ,每次 10 min,加入 HRP-anti-Rabbit-
IgG于室温孵育 2 h, TBS洗 3次 ,每次 10 min,加超
敏发光试剂再显影;以 β-Actin作内参 ,用图像分析
软件 ScionImage进行光密度积分值分析 。
2.4　统计学处理 　实验数据以 x±s表示 ,
SPSS11.0统计软件分析数据 ,两两比较采用 t检验。
3　结果
3.1　肿瘤基因芯片检测结果　由上海康成生物公
司提供的芯片检测结果表明 PsL5F和大黄素能明显
上调 HO-8910PM细胞中 GDF15mRNA的表达(见图
1), PsL5F处理组中 GDF15mRNA表达水平是对照
组的 7.14倍 ,大黄素处理组中 GDF15mRNA表达水
平是对照组的 8.86倍。
·1846· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 12期 2008年 12月
图 1　基因芯片检测半边旗二萜化合物 5F和大
黄素对 GDF15mRNA表达的影响
3.2　荧光定量实时 PCR分析结果　荧光定量实
时 PCR验 证 PsL5F和 大 黄 素 能 明 显 上 调
GDF15mRNA表达 , PsL5F处理组中 GDF15mRNA
表达水平是对照组的(8.91±0.73)倍(见图 2),大
黄素处理组中 GDF15mRNA表达水平是对照组的
(10.01±0.87)倍 ,与芯片检测结果基本吻合。
图 2　实时定量 PCR验证半边旗二萜化合物 5F和大
黄素对 GDF15mRNA表达的影响( x±s, n=3)
注:与对照组比较 , ＊＊ P<0.01
图 3　半边旗二萜化合物 5F和大黄素对
GDF15蛋白表达的影响
1.Control(0.1%DMSO)　2.100 μmol/LPsL5F
3.40 μmol/LEmodin
　表 1　　　半边旗二萜化合物 5F和大黄素影响
GDF15和 β -Actin蛋白表达变化的光
密度扫描结果( x±s, n=3)
组别
光密度值
GDF15 β-Actin
GDF15 /β -Actin
对照组(0.1%DMSO)11108±1056 58465±3952 0.19±0.02
100μmol/LPsL5F 34723±2623 55764±4983 0.62±0.05＊＊
40μmol/LEmodin 39370±4019 51927±5332 0.76±0.08＊＊
　　注:与对照组比较 , ＊＊ P<0.01
3.3　Westernblot分析结果　PsL5F和大黄素同样
能明显上调 GDF15蛋白表达(见图 3),光密度积分
结果见表 1。
4　讨论
GDF15是 TGF-β超家族的成员之一 ,在炎症 、
癌症和人体多种细胞中广泛表达 ,因而具有不同的
命名 ,如巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)、胎盘转化生
长因子-β(PTGF-β)、前列腺衍生因子(PDF)和胎盘
骨形态发生蛋白(PLAB)。大量证据表明 GDF15的
高表达能抑制多种癌细胞株的生长增殖 ,并促进癌
细胞凋亡 〔8〕 ,另外由于 GDF15是 TGF-β家族的成
员之一 ,早已公认 TGF-β信号通路与肿瘤细胞的转
移能力密切相关 , LiuT〔9〕的研究还表明 GDF15在
体外能减少肿瘤细胞 -细胞外基质和肿瘤细胞 -肿瘤
细胞之间的粘附能力。笔者在过去数年的研究表明
PsL5F在体外可致人的多种癌细胞死亡 ,其作用机
制主要是通过线粒体途径诱导癌细胞的凋亡 ,同时
证明 PsL5F能抑制人高转移卵巢癌细胞的侵袭转移
能力 〔10〕。在本实验中 PsL5F强烈上调 GDF15的表
达 ,可解释 PsL5F抑制肿瘤细胞生长和转移能力 、并
促进癌细胞凋亡的实验结果 。同样许多研究证实大
黄素能抑制多种癌细胞的增殖和转移相关能力 ,并
诱导多种肿瘤细胞凋亡 ,因此大黄素诱导 NAG-1在
高转移卵巢癌细胞中高表达也能很好地解释大黄素
的体外抗肿瘤作用 〔7〕。
GDF15又名非甾体抗炎药物激活基因(NAG-
1),是一种环氧合酶抑制剂诱导蛋白〔11〕 ,与炎症反
应的关系十分密切 , PsL5F和大黄素诱导 GDF15高
表达与半边旗和大黄在民间具有抗炎功效相符合。
但 PsL5F和大黄素诱导 GDF15高表达的具体作用
机制目前尚未明确 。现许多文献表明多种转录因子
(如 P53〔12, 13〕、EGR-1〔14, 15〕 )、抑癌信号通路 AKT/
GSK-3β〔16, 17〕能对 GDF15进行表达调控 , 但 PsL5F
和大黄素是否通过这些方式调控 GDF15表达有待
更深入的研究 。
参 考 文 献
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cels.molCancerTher, 2007, 6(1):362-369.
(2008-04-07收稿)
《中药材 》杂志征稿内容
1 　药用植物栽培 ,包括野生药材变家种 ,引种药材和异地药材的引种驯化 ,道地药材的研究 ,培育优良品
种 ,防治病虫害 ,改革耕作制度 ,提高产量 、质量 ,组织培养 ,药用真菌的栽培及 GAP基地的建设等 。
2　动物药研究 ,包括药用动物的饲养和管理 ,资源 、生态 、习性的调查与观察 。野生变家养与异地引种品种
的驯化;用新技术 、新方法提高动物药的产量与质量 ,动物药的药理 、药化和临床实验等 。
3 　中药材鉴别 ,加工炮制和商品养护。
4 　中药资源的合理开发和利用 。
5 　中药化学成分及有效成分的提取 、分离及鉴定研究。
6 　中药药理 、临床试验研究。
7 　新技术 、新方法在中药材上的应用。
8 　基础理论讲座 ,文献综述 ,专论 ,考证 ,译文 ,中药剂型改革 ,制剂 ,用药 ,药膳 ,经验以及报道中药店(房)
的文章等 。
·1848· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 12期 2008年 12月