全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(4)：312—317
Journal ofTropical and Subtropical Botany
无核荔枝胚胎发育时期蛋白质图谱分析
李 蕾 ，彭存智 ，李明芳 ，郑学勤
(1．中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室，海 口571101；2．海南师范学院生物系，海口571158)
摘要：通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)以及计算机辅助的图像分析技术，对荔枝开花后 20 d的正常与败育胚蛋白
质图谱进行了初步分析。结果表明，正常胚总蛋白质斑点数为 129，败育胚总蛋白质斑点数为 130，其中 24个蛋白质点
在两种胚中的表达丰度没有明显变化，35个蛋白质点在表达丰度上有明显差异，55％的蛋白则发生了蛋白质缺失、增
加以及位置改变等变化。这两种蛋白质组的表达差异说明了胚内蛋白质成分在其败育过程中发生了变化，这些蛋白可
能参与了胚败育的调节和控制。
关键词：荔枝；胚发育；蛋白质图谱；二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
中图分类号：Q946．1 文献标识码：A 文章编号 ：1005—3395(2006)04—0312—06
Proteomic Analysis of Seedless Litchi at Embryo Developmental Stage
LI Lei ， PENG Cun—zhi ， LI Ming—fang ， ZHENG Xue—qing
(1．KeyState Laboratory ofBiatechnologyfor Tropical Crops，ChineseAcademyofTropicalAgriculture Sciences，Haikou 571101，China；
2．Department ofBiology,Hainan Normal Unwemi~，Haikou 571158，China)
Abstract：Proteomatic analysis is a new powerful tool for revealing the chan ges in protein leve1．Two—dimensional
polyacrylamide gel electrophoresis(2DE)and computer image analyses were employed to compare the global
protein paterns between normal and aborted embryo of litchi(Litchi chinensis Soma．)．Totaly,1 29 and 1 30
protein spots were obtained from normal and aborted embryos，respectively,of which 24 spots in both kind of
embryos showed no significant diference， but 35 spots exhibited obvious diferences in quan tity． Furtherm ore，
some spots were missing an d some new spots emerged in aborted embryo compared with norm al embryo．The
diferences in expressing the proteins betw een norm al an d aborted embryos of litchi are useful for regulating and
controlling the embryo abortion．
Key words： Litchi； Embryo development； Proteomics mapping； Two—dimensional polyacrylamide gel
electrophoresis
荔枝 (Litchi chinensis Soma．)为 无 患 子 科
(Sapindaceae)荔枝属植物，是我国特有的经济果
树。由海南省筛选的荔枝新株系无核荔枝“陆侨”，
果实大，品质好，产量高但果实的无核率不够稳定，
影响了商业价值。有关荔枝胚胎败育机制研究虽已
有一些报道【卜扪，但从蛋白质组学探讨其理论机制，
尚未见报道。
无核荔枝在胚胎发育早期 (花后 15 d左右)即
发生胚败育 ，果实成熟后仅见核痕迹，与同株系正
常发育胚胎有明显差异。两者既属同一株系，其基
因组通常是维持稳定不变的，但正常发育胚胎与败
育胚胎间的基因表达即蛋白质组间则可能存在较
大差异。因而寻找两者之间的差异蛋白质谱，对于
揭示胚胎发育进程的本质，获得某些关键蛋白，对
收稿 日期 ：2005．12．29 接 受日期 ：2006．04．18
基金项目：863计划项目(2004AA001380)；海南省 自然科学基金项目(80419)资助
+通讯作者Coresponding author
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第 4期 李蕾等：无核荔枝胚胎发育时期蛋白质图谱分析 313
其定性和功能分析都具有重要意义[101。
目前关于植物的差异蛋白质研究已有一些报
道[1,121，David等利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(two．
dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DE)
技术比较了栽培于不同环境下但起源于同一种群
的小麦，结果发现所有的栽培种群的蛋白质谱都与
原种群有差别，他认为，这不是由随机漂移引起，而
是由适应其各自的气候条件而形成。Santoni、Herbik、
Von Wiren、Komstsu等分别对拟 南芥 rabidopsis
thaliana)、小麦(Triticum spp．)、水稻(Oryza sativa)、番
茄(Lycopersicum esculentum)等进行了野生型和突
变体间蛋白质组分析，获得了蛋白质组差异表达
谱，并获得相关蛋白【-3-2”。
本文采用 2DE及计算机辅助的图像分析技
术[2-261，对正常型发育胚和败育胚的蛋白质组图谱进
行分析比较，为荔枝胚胎败育机制研究提供科学依据。
1材料和方法
1．1材料
以无核荔枝 (Litchi chinensis Sonn一)“陆侨”为
供试材料，取白海南陆桥无核荔枝基地。选取 4—5年
生正常挂果果树，于盛花期选择开花量较大、花穗
健壮的单株挂牌，记录雌花开放期。于花后 20 d取
幼果，冰上剥离正常发育及败育胚，液氮速冻后于
． 20℃低温保存备用。
1．2蛋白质提取及测定
提取液按张以顺等[27】方法配制，分别称取 0．5 g
正常发育及败育胚，液氮下充分研磨，加入 3—4倍
体积的提取液及 l0％(材料鲜重)的 PVP40，常温下
再充分研磨，12 000 xg，4~C下离心 15 min，取上清
液。残渣用 3—4倍体积的提取液重提一次 (不加
PVP40)，合并上清液，用 l0倍体积无水乙醇，一20℃
下沉淀 3—4 h，12 000 xg，4~C下离心 15 min，沉淀用
适量提取缓冲液溶解或直接置于 。20℃冰箱备用。
在上述沉淀提取的蛋白质中加入 100 Ixl裂解
液(裂解液组成：尿素 7 mol／L，硫脲 2 mol／L，3．【(3一
胆酰胺丙基)一二乙铵】_丙磺酸(CHAPS)4％，二硫苏
糖醇(DTT)60 mmol／L，两性电解质 2％)，4~C下溶解
过夜，12 000 xg，4~C离心 15 min，以除去样品中不
溶或杂质部分。取上清液依 Bradford[2S~方法测定蛋
白质含量。
1．3 2DE
一 维固相pH梯度等电聚焦 使用lmmobiline TU
pH3—10线性固相 pH梯度(immobilized pH gradient，
IPG)预制凝胶条(18 cm，购 自Amersham Pharmacia
Biotech lnc．1，在 IPGphor电泳仪(Amersham Phar—
macia Biotech lnc．)上完成。样品蛋白含量为每胶条
400 Ixg，水化为 30 v，l2 h；以 100 V 1 h，500 V
l h，l 000 V 0．5 h，8 000 V 7．5 h电泳至 60 000 V h
时结束。
平衡 配制平衡液(50 mmol／L Tris，尿素
6 mol／L，30％甘 油 ，2％SDS，痕 量 溴 酚 蓝 BPB)
40 ml，临用前加入 DTT，使其终浓度为 l％，将等电
聚焦后的IPG胶条放入，于摇床上振荡 15 min。再
将 IPG胶条放入临用前加进 2．5％碘乙酰胺的平衡
液中，于摇床上振荡 15 min。
SDS．PAGE 在 Multiphor II电泳仪上进
行，配制 200m x200m xl mil，12．5％均匀胶。将
平衡后的 IPG胶条移至凝胶的上方，用 0．5％的琼
脂糖封闭。电泳缓冲液为 Tris—Gly-SDS，在 14—15~C
时，以每一胶条 15 m 叵流电泳，直至溴酚蓝前沿抵
玻璃板下缘为止。
1．4 染色
Hoefer凝胶 自动染色仪银染。
1．5 图象分析
使用 Labscan控制 ImageScanner扫描图像，图
象扫描仪经强度矫jE(intensity calibration)后，透射扫
描 2DE凝胶(光学分辨率 300 dpi，象素深度 8 bits)，
所得图谱借助图象分析软件 ImageMaster 2D Elite
进行详细分析、比较蛋白质斑点差异。图象分析软
件自动将不同图谱中的相同蛋白质点匹配，不能匹
配的蛋白质斑点视为差异点。蛋白质分子的等电点
和分子质量根据 IPG胶条 pH标示范围和低分子质
量蛋白标准测算；每个蛋白质的相对含量以其占总
蛋白质的百分数表示。
2结果和分析
2．1 胚蛋白质 2DE图谱特征
荔枝花后 20 d正常发育胚与败育胚双向电泳
各重复 3次，重复性较好。它们的胚蛋白质 2DE图
谱见图 1。根据 Carsetin坐标系统，从左到右等电点
增加，从下往上分子量增加。由图 1可见，花后 20d
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2．2 胚蛋 白质 2DE图谱 分析
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一 旦蛋白点被检定，ImageMaster 2D Platinum
可自动计算每一个蛋白点的蛋白质含量。其含量值
可以以光密度(OD)、体积(Vo1)和相对光密度(％
OD)、相对体积(％Vo1)表示。相对光密度和相对体积
不受凝胶之间由于实验条件改变而发生变化的影
响，是评价凝胶之间蛋白质表达差异的一种相当有
效的方法。图3用散点图表征来自两张凝胶的蛋白
点值之间的线性依赖关系。x为来自败育胚凝胶的
蛋白质点，Y为来自正常胚凝胶的蛋白质点，两块
胶上匹配的 59个蛋白质中有 24个线性依赖相关
系数高于 0．95，说明这 24个蛋白质点是相似的，在
两组胶中质和量上没有差异。
柱状图可直接显示蛋白点的蛋白点值、集中趋
势和离差。本实验中，生成蛋白点群的柱状图所选
取的蛋白质点值类型为％OD，选用了算术平均数
100％和均方偏差 100％统计学方法。柱状图窗口
中，标准化方式选取了原始蛋白点值 (Value)，为在
所有的柱状图中展示一个等同的等级。图4A为含
有 21个蛋白点的蛋白点群柱状图，这些是在败育
胚中表达量减弱的蛋白质点。图4B为在败育胚中
表达量增加的蛋白点群柱状图，以上两柱状图中，
垂直的橘黄色棒对应于蛋白点值，蓝色水平线代表
了选定的集中趋势，红色线条描绘出用【中心值±离
差1定义的范围边界。这 35个蛋白质点在表达量上
表现出差异，表明这些蛋白质成分在胚胎发育过程
中发生了变化，进而可能参与胚败育的调节和控制。
与正常胚胎凝胶电泳图比较，胚胎败育的蛋白
质 2DE图谱中，在 PI 6—7、分子量(Mw)35—43 kD
处可见有一组新蛋白质点群(图 5)，这些新蛋白质
点的产生可能与胚胎败育有更直接的相关。
3讨论
陈伟 、张以顺 等也进行了荔枝胚胎发育时
期的蛋白质双向电泳研究，但仅是胚胎后期 (花后
40—50 d)的蛋白质电泳。本文进行了无核荔枝胚发
育过程中花后 20 d的双向电泳。前文已表明[9l，无核
荔枝胚败育发生在花后 1 5 d左右，故进行这一阶段
的蛋白质组差异表达谱分析，对于揭示胚败育机制
更有意义。但此时的幼胚剥离非常困难，取样量较
少，双向电泳蛋白上样量低，凝胶染色只能采用银
染法，这对于进一步的肽质量指纹图谱分析有一定
影响。而发育后期的蛋白质在数量和表达丰度上均
较前期有所增加，通过对发育后期蛋白质组差异表
达图谱进行分析，采用 MALDI—TOF．MASS鉴定了
部分差异蛋白(待发表)。
第一相电泳中，本文采用了商品化的预制 IPG
胶条，IPG重泡涨上样和低电压主动上样促进了低
拷贝数蛋白的分离，但蛋白质的溶解问题和丢失问
题仍可能存在。两组凝胶中分离出的蛋白质点相对
图3两块胶中％OD变化较小的蛋白质相关图
Fig．3 Corelation ofless changed protein spots in％OD between normal an d aborted embryos ofitehi
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