全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
热带亚热带植物学报 , 一
”
升气升环流式生物反应器培养紫草细胞
戚树源 林立东
中国科学院华南植物研究所 , 广州
梁世 中 高建华 高孔荣
华南理工大学 , 广州
摘要 本文采用 自行设计研制的 升气升环流式生物反应器培养紫草细胞 , 培养周期
。
前 为
细胞生长培养 , 细胞生长呈正常的 型曲线 , 细胞增长到原细胞接人量的 倍 后 为紫草色素生
产培养 , 细胞增长到 倍 整个周期每升培养液可生产紫草色素
,
在反应器中 , 培养液 值
的变化与细胞生长呈正相关 , 与紫草色素的形成呈负相关 , 值变化规律可用于监测紫草细胞在生物
反应器的生长和色素形成
关键词 气升式环流生物反应器 细胞悬浮培养 紫草 紫草素
几了 几了
左 天口 石 一
‘ 。“ ” , ,
阴月 汉 飞沙,
一
,
, ,
” ,
,
,
,
,
心 ,
广东省科委 “八 · 五 ”攻关项 目
一 一 收稿 一 一 修回
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第 期 戚树源等 升气升环流式生物反应器培养紫草细胞
印 “ 即
植物是医药
、
香料
、
色素
、
调味剂
、
化妆品
、
农药等天然产物的重要 自然资源 , 植物细胞培
养是近 年来为进一步开发和利用植物界丰富的天然资源而发展起来的新技术 目前 , 应用 植
物细胞培养实现商业化大规模生产天然产物最重要 的技术之一是研制适用于植物细胞大规模培养
的生物反应器
。
本文报道应用 自制的 升气升环流式生物反应器研究紫草细胞生长规律及有 关
生理因子对紫草细胞生长及紫草素形成的影响 , 为应用生物反应器培养植物细胞调控和检测机制
提供依据
。
有关生物反应器的研制及冷模试验研究将另文报道
材料和方法
实验材料 紫草细 胞 是 从 广 西 全 县 采 集 的 紫 草 伍 胡 砂 入
叶诱导的愈伤组织 , 经多次二步法和平板培养筛选产生
。 在 固体培养中 , 该细胞系松散 ,
用从固体培养的紫草细胞直接投人液体培养 , 分散状态好 , 细胞最大聚集半径小于 , 适用
于细胞悬浮培养及生物反应器细胞悬浮培养
。
升气升环流式生物反应器 反应器内外径比为 , 高径 比为 , 主要材料为不锈钢 ,
用电热锅炉发生的蒸汽灭菌
。 空气采用三级过滤除菌 , 空调器控制培养室温度
培养液 细胞生长培养液为修改的 , 添加
一
,
, 石 , “
。
细胞色素生产培养液为修改的 , 添加 石 , 石
。
摇瓶悬浮培养 紫草细胞摇瓶悬浮培养在旋转式摇床进行 , 三角瓶加人 培
养液 , 或 三角瓶加人 培养液 , 转速 , 振 幅 , 士 ℃暗培养
紫草细胞在生长培养液培养 , 在紫草色素生产培养液培养
。
生物反应器培养 采用两步法培养 , 第一步加人 紫草细胞生长培养液和经摇瓶培养一
代的紫草细胞 , 加人细胞量为
一
, 鲜重 , 相 当于细胞干重
一
协, 培养 。 第二步
利用装设于反应器的滤网过滤 , 放出第一步加人的培养液 , 并用适量无菌水冲洗 , 除去残留反应
器中的紫草细胞生长培养液 , 再加人紫草色素生产培养液 , 并通过样品管调节反应器中细胞
量为 , 鲜重 , 相 当于细胞干重
一
勺, 培养
。 反应器 内压为 一 ,
通气流速为 一 , 培养温度为 一 ℃
。
图表 中数据为三次实验的平均值
。
及电导率测定 用 和上海雷磁仪器厂 一 型电导率仪
测定
紫草细胞色素及培养液色素测定 收获的紫草细胞置低温干燥 , 称取一定量进行 色素测
定
。
培养液通过 目筛 , 滤液用 乙醚萃取至无色 , 蒸馏回收乙醚 , 用乙醇溶解定容 , 参照
方法川 测定紫草色素 , 在上海分析仪器厂 型分光光度计上进行
。
结果和讨论
对紫草细胞生长和色素形成的影响
在紫草细胞培养中 , 虽然 值随细胞生长周期及细胞色素的形成有规律地变化 , 摇瓶培养
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
热带亚热带植物学报 第 卷
过程 变化见图 , , 但培养液的起始 值对紫草 细 胞 生 长 及 紫草 色 素 的形 成 均有影 响 ,
其最适 的起 始值 灭 菌前 分别 是 和 表 ,
。
在 紫草 细 胞 生 长和紫草色素形成中 ,
培养液的最适 值不同 , 而且 值变化规律也不同
。
在紫草细胞生长培养液 中 , 值在细
胞生长前 急剧下降 , 此时细胞处于延迟生长期 , 第 天以后 , 值快速上升 , 细胞开始进
人对数生长期 , 细胞生长培养液 值的变化与紫草细胞生长呈正相关 图 在紫草色素生产
培养液中 , 随着细胞中紫草色素的增加 , 培养液中 值有规律地下降 , 值在前 下 降较
慢 , 第 天至 天下降较快 , 这时紫草色素形成处于对数期 , 紫草色素形成增长迅速 , 后 ,
培养液 值开始平稳 , 紫草色素增长也处于平稳 紫草色素生产培养液 值与紫草细胞色素
增长呈负相关 图
了‘︸,、︶
勺,
⋯
尸凡‘︺吃厂、﹄砚︼叹」
曰切三︶
︵
︵︶沈留﹃蕊﹄。一拐︵二月︶喇代谈切歼级
蝴刊月
,刁冬
巴多亡口喇留界
个︶一七之,工户﹃。哥价钾刃一
洲“厂
二‘ 「
。 ’ 「
么
培养天数 ” 培养天数 ‘
图 紫草悬浮培养细胞生长与培养液 和电导率变化曲线 图 紫草悬浮培养细胞生 长
, 紫草色素形成和 变化曲线
,
少 朋
, 正 ,
『 七
表 对细胞生长的影响
少 括。
消毒前
消毒后
培养结束时
,
细胞 生长率
表 对紫草色紊形成的影响
消毒前
紫草色素产量
议 花
” ,
升气升环流式生物反应器中培养液 值变化规律大体与上述相 同 图 , 在生物反应
器中 ,
‘
紫草细胞色素生产培养液 值在前 呈现升高 , 然后逐渐下降 , 这可能是反应器的
通气供氧和混合剪切作用及摇瓶的差异引起的
在植物细胞培养过程中 , 培养液中 值的变化通常是 由于培养液中氮源的消耗产生 的
。 当
植物细胞在以
一
为主要氮源的培养液中培养 , 培养液的 值随植物细胞生长上升
。
紫草细
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第 期 戚树源等 升气升环流式生物反应器培养紫草细胞
胞生长培养液是 以
一
为主要氮源的 修改培养液 , 上述结果与该报道一致
。
在紫草色素生产
培养液中 , 虽然修改的 培养液也是 以
一
为主要氮源的培养液 , 但是 , 培养液 值随紫草
细胞色素增加及紫草细胞增长而下降 , 这可能是色素生成过程伴随有酸性副产物生成以及紫草色
素的蔡醒环显酸性所致 , 这有待进一步研究
。
在生物反应器中 , 紫草细胞培养液 值与紫草细胞生长及紫草色素在细胞中形成相 关的规
律 , 可用于监测紫草细胞生物反应器大规模培养中紫草细胞生长及紫草色素生产动态 , 为生物反
应器扩大设计提供一个方便有效的检测依据
。
在紫草细胞培养 中 , 虽然培养液 的电导率变化与
紫草细胞增长相关 图 , , 但在紫草色素生产培养液中 , 紫草细胞产生的紫草色素却直接干扰
培养液中电导率的测定
。
︵上
︵闷四日︶的。争一月拼﹁﹄﹃三
︵月︶喇化翻司挤戮‘,、,︸,乙
︵。不曰巴︸诊沙。粼忙纂磊
︵︶乞一经。的盖身﹁︸七口研补钾
,户刀召石冲,﹁名丫平个中下工仁术小土书
二。
︶
码
培养天数 女吝养天 数
图 升气升环流式反应器紫草细胞生长 ,
培养液 和 电导率变化曲线
,
么 ‘月夕 括
通
图 升气升环流式反应器紫草细胞生长 ,
紫草色素形成和 变化曲线
,
, ,
通
紫草细胞生长及紫草色素的形成
在 升气升环流式生物反应器中 , 紫草细胞生长呈正常的 生长曲线 , 每升培养液 生
长期可获得 干重 细胞 , 对于每 升接人 干重 细胞 而 言 , 细 胞增 长 到 倍 图
。
在生物反应器 中 , 紫草细胞生长率 比摇床培养的紫草细胞略低 , 在摇床培养中 , 每升培养液
生长期可获 干重 细胞 , 对比每 升接人 干重 细胞 , 细胞增长到 倍 图
。
在反应器培养 中 , 紫草细胞延迟期为 , 在摇瓶培养中只有 , 延迟期过长可能是影 响
生物反应器中细胞产量的原因之一
。
增加紫草细胞在反应器中继代培养次数有可能缩短紫草细胞
在生物反应器中生长的延迟期 , 增加紫草细胞产量
。
维持生物反应器一定的内压水平是保持反应器内无菌状态的重要手段之一
。
在紫草细胞生
物反应器培养中 , 在不大于 内压下 , 紫草细胞生长 良好
。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
热带亚热带植物学报 第 卷
在紫草色素生产培养液中 , 紫草细胞生长与紫草色素的形成 同步 图 , 的生长期 中 ,
生物反应器培养的紫草细胞增长到 倍 , 而在摇瓶培养的紫草细胞只增长到 倍 图
。
紫
草细胞在生物反应器的整个培养周期中增长了 倍
。
最近 , 陈士云等人应用英 国设计制造 的
升外循环气升式反应器培养新疆紫草细胞 , 整个培养周期干重增加 倍
。
但在反应器中紫草
色素产量只相 当于摇瓶培养的 , 紫草细胞在生物反应器中形成色素较慢 , 其色素形 成 曲线
不明显 , 其原因有待进一步研究
。
参考文献
, 论 , 卿 行
, , 一
, 认
, , 一
陈士云 , 侯省生 , 叶和春等 外循环气升式反应器培养新疆紫草细胞
,
生物工程学报 , , 叩 一