全 文 ：热带亚热带植物学报 2002，10(4)：371—380
Journal of Tropical and Subtropical Botany
药用植物基因工程的研究进展
胡 忠 李庆云 曹 军
(汕头大学生物学 系，广东 汕头 515063)
摘要 ：从农杆 菌诱 导的转基 因器 官的培养 、模式基 因工程、目的基 因的遗传转化等方面 概述 了
药用植物基因工程研 究及应用中的最新进展 ，并展望 了今后发展 的方 向及前景 。
关键词 ：药用植物；基因工程；农杆菌
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编 号：1005-3395(2002)04-0371一l0
Advances in Gene Engineering of M edicinal Plants
HU Zhong LI Qing—yun CA0 Jun
(Dept．of Biology，Shanwu University，Shantou 5 15063，China)
Abstract： This paper reviews the latest studies and application of gene engineering for
medicinal plan ts on the following aspects：tran sgenic organ culture，transfer an d expression of
model genes，and specific genes mediated by Agrobacterium．
Key words：Medicinal plan t；Gene engineering；Agrobacterium
最近二十多年来，伴随着高等植物的离体培养、植株再生和基因重组技术的 日趋成熟，
许多带抗性基因的植物如抗病毒的烟草、抗虫害的番茄和棉花、抗除草剂的大豆和玉米都 已
培育出来【”。同时，科学家还利用植物转基因的方法来研究和探索植物细胞内的一些机能和
调控机制。所有这些显示出植物转基因研究的广阔应用前景。
目前用于植物细胞外源基因导入的方法和技术很多，其 中土壤农杆菌介导的转化系统
是研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。据报道，迄今所获得的约 200种
转基因植株中 80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的 】。到 目前为止，药用植物转基因
研究中除了农杆菌介导的转化系统之外，利用其他方法转化成功的报道还比较少。药用植物
有别于农作物，它们的有效成分是植物细胞的次生代谢产物，这一特点决定了药用植物与农
作物的遗传转化有着不同的侧重点。尽管药用植物遗传转化的研究起步较晚，但 自二十世纪
八十年代 以来，也取得 了显著的进展 ，主要集中在转基因器官的培养、模式基因工程、目的基
因的遗传转化等几个方面。
收稿 日期：2001—10—09 接受日期：2002-04—12
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372 热 带亚热带植物 学报 第 lO卷
1转基因器官培养
利用发根农杆菌 质粒转化形成的发状根和根癌农杆菌 Ti质粒转化形成的冠瘿瘤组
织作为培养系统来生产有用的植物活性成分是当今药用植物生物技术研究的热点之一。
1-1 发 状 根培 养
发状根是植物受发根农杆菌感染后产生的。在感染过程中，发根农杆菌把自身 质粒
的 T-DNA上的基因转移并整合入植物基因组，这些基因表达后即产生发状根。近十几年来
发状根培养已发展成为继细胞培养后又一新的培养系统，这一培养系统对传统中药材来讲
更为重要，因为约三分之一的传统药材是植物的根部。据不完全统计，药用植物发状根培养
已在 26个科 100多种植物获得 了成功。
利用发根农杆菌转化产生的发状根培养物具有生长速度快、合成次生代谢产物的能力
强并可以向培养液中分泌一定的产物以及无需添加外源激素等特点。与目前广泛应用的Ti
质粒转化系统相比， 质粒转化系统还具有几个方面的优点pl4】：对单个根尖培养系的研究表
明，一个发状根是单个转化细胞的克隆体 ，既使它们含有多个独立的转化发状根 ，每个发状
根的 T-DNA结构是非常稳定的，并且单个根尖的分枝也常具有与亲本根系一样的 T．DNA
组成。发状根的这种克隆性质有利于筛选和转化机制的研究。此外，利用 质粒转移外源基
因容易从发状根或愈伤组织上产生再生植株 ，不必除去象 Ti质粒 内的一类致癌基因。目前，
采用 质粒转化药用植物已有不少再生植株的例子[5-71。
自二十世纪八十年代 中期发状根培养技术应用于次生代谢产物生产以来，许多有开发
价值的次生代谢产物 已从不同植物的发状根培养物 中提取出来，有的化合物已通过发状根
培养法得以工业化生产或中试生产，其中药用价值较高的有喹啉生物碱 、吲哚生物碱、托品
烷生物碱、喹嗪烷生物碱等，此外，噻吩、多炔、蒽醌、糖苷等次生代谢产物也是重要的药用化
合物IS]。
通常情况下，发状根培养生产的次生代谢产物仅限于那些正常植物的根中能够合成的
物质，而对于那些由植物绿色部分所合成的次生物质而言，绿色发状根就具有十分重要的意
义。有些植物的发状根培养物在光照下能变成绿色，绿色发状根具有正常的根器官构造 ，而
在皮层细胞中含有叶绿体能进行光合作用，CO 的固定能力和核酮糖二磷酸化酶的活性可
达到叶片的水平。现在，一些植物 已成功诱导出绿色发状根，并且发现这些发状根合成的某
些次生物质与植物绿色部分合成的次生物质成分相同【9】。Sauerwein等【 q在翻过江藤(Lippia
d )发状根培养物 中分离到 0．25 mg g- (干重)的 hemandulcin(-种倍半萜化合物)和另外
2O种单萜类或倍半萜类化合物，在 16 h d。光照的条件下能使发状根变绿 ，而在未转化根培
养物中却没有发现这些萜类化合物。另外绿色发状根生长速度和次生产物积累增加，表明培
养物中的发状根可能有一种生物合成潜力，而通常根生长在地下未能显现出来。这对利用发
状根培养生产更多的次生代谢产物也许十分有利。洋地黄含有强心苷活性成分，利用绿色洋
地黄发状根培养物不仅增殖速度快而且还提高了强心苷的产量【“】。
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第 4期 胡忠等：药用植物基因工程的研究进展
l-2 冠瘿瘤(crown gals)和畸状茎(shooty teratomas)培养
有些药用植物的活性成分仅在叶片和茎中合成，自然不能利用发状根培养获得活性成
分，而利用冠瘿瘤或畸状茎的形成和培养则能达到这一 目的。
根癌农杆菌 Ti质粒的 T．DNA片段(含 f棚 基因、trar基因)通过根癌农杆菌感染植物并
整合进入植物细胞的基因组，诱导冠瘿瘤组织的发生。冠瘿瘤离体培养时，具有激素 自主性、
增殖速率较常规细胞培养快等特点，其次生代谢产物合成的稳定性与能力较强，对生产有用
次生代谢产物有着 良好的开发前景，目前 已经用来生产一些特殊次生产物(表 1)。宋经元
等[2习利用诱导的丹参冠瘿瘤培养生产丹参酮，筛选 出高产株系，丹参酮的含量 已超过生药的
含量。Hank等口川报道用根癌农杆菌 B0542和 C58感染成年短叶红豆杉和欧洲红豆杉幼茎切
段，诱导出了可在不含植物激素培养基上快速生长的冠瘿瘤。经质谱和酶联免疫证明瘤状组
织中含有紫杉醇及其类似物，紫杉醇含量为干重的 0．00008％一0．0004％。在一些药用植物中，
转化的畸状茎可以通过几种根癌农杆菌菌株诱导形成(表 1)，这些菌株包括一种缺失生长素
生物合成基因的 Ti质粒突变体和芽形成 Ti质粒 pTiT37。这些转基因器官培养对于那些通
常在叶片和绿色茎杆中形成和生物转化的特异次生产物也十分有用 。与发状根相比，利用畸
状茎进行有用产物合成的成功报道还比较少，这可能是由于建立快速生长的畸状茎的液体
培养体系十分困难。
表 1 Ti质粒转化药用檀物形成的冠瘿瘤和 畸状茎
Table l Crown galls and shooty teratomas induced with Ti plasmid
某些次生代谢产物在植物的特定器官内合成后再运输到其它器官中贮藏，这种生理特
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374 热 带 亚热 带 植物 学报 第 10卷
性在培养条件下也能表明出来。对烟草和颠茄的冠瘿组织、簇芽和发状根中生物碱合成和贮
藏的研究表明，二者的发状根均可合成原植物固有的生物碱，而簇芽则不能合成。若在二者
的簇芽培养基中分别加入烟碱和莨菪碱，簇芽可将它们分别转化为去甲烟碱和东莨菪碱口习。
在植物体内许多次生物质的合成需要地上部分(叶、茎)和地下部分(根)的共同参与 ，而
酶的表达具有器官特异性，因此离体培养生产这些代谢产物无论是发状根还是冠瘿瘤组织
均不能达到这一目的。最近 ，Subroto等126]为了提高颠茄器官培养物中莨菪胺的产量，在离体
条件下效仿完整植株 ，在无激素培养基中共培养遗传转化的颠茄畸状茎和发状根，获得了较
好的结果。通常植物中天仙子胺主要是由根产生，然后被转运到植物的地上部分，在那里由
6一羟化酶催化转变为莨菪胺。发状根培养物可以产生与完整植株产量相似的天仙子胺，但仅
有非常少量的莨菪胺。共培养的茎产 生的莨菪胺 (0．84 mg g。DW)是完整植株叶片中的
3—11倍，莨菪胺 与天仙子胺 在共培养物中的比率高达 1．9，比在颠茄发状根中所见的比率
0-0．03有显著提 。他们认为发状根合成的天仙子胺能通过培养基转移，类似于植物体中
维管束运输 ，被 畸状 茎吸收并转变 为莨 菪胺 。Mahagamasekera等【 利用颠茄 发状 根与
Duboision hybrid的冠瘿组织进行不同属间的组织共培养，也显著提高了莨菪胺的含量。转基
因器官的利用使根与茎共用相同的培养基且不需要外源激素进行共培养成为可能。
2药用植物模式基因工程
植物基因工程的最终 目的是把有用的基因转移到受体基因组，并在受体中能稳定表达
和遗传。研究遗传转化技术体系及外源 目的基因的表达和调控机制，需要一类具有选择标记
的基因，称为模式基因(model gene)或报道基因(reporter gene)。根据基因编码产物的特点，大
致可分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶的基因，前者常用的有新霉
素磷酸转移酶 I基因(nptl1)、氯霉素乙酰转移酶基因(CA 、潮霉素磷酸转移酶基因(hp￡)，以
及 phorphinotricine乙酰转移酶基 因(6 等；后者有 B一葡萄糖醛苷酶基因(cvs)、萤火虫荧
光素酶基因 )、绿色荧光蛋白基因 )等。由于在转化植物组织中表达的产物相当稳定并
且容易检出，nptH基因和 GUS基因是广泛用于植物遗传转化的模式基因[21。近些年来，这些
模式基因已用于研究甘草、颠茄、黄花蒿、宁夏枸杞、枳壳等药用植物的遗传转化过程 ，有的
已在植株水平得到表达(表 2)。在农杆菌转化成功的报道中，外植体选择非常广泛，其中茎和
叶是使用最多的外植体，也最容易转化成功。同样地，受体植物发育年龄和生理状态也十分
重要。为了提高转化效率，许多研究中采用 乙酰丁香酮活化菌液、选择合适菌株、菌液浓度和
共培养时间、外植体预培养一定时间等转化条件。总之，利用模式基因可以优化农杆菌感染
外植体及整合入植物染色体组的最佳条件 ，从而建立 良好的转化系统，以便将一些有用的外
源 目的基因转移到这些植物中表达。
石刁柏是第一个用根癌农杆菌转化并得到再生的单子叶植物。Hernalstenns等【。 用野生
型的根癌农杆菌 C58感染石刁柏嫩茎，对瘤组织进行培养，经继代的愈伤组织仍能合成胭脂
碱和农杆碱 。Bytebier等128]重复了这一工作，并证实石刁柏的细胞核基因组 内有 Ti质粒的
T—DNA区段。此后将含有 NOS-APH基因的重组质粒 C58C1转化石刁柏愈伤组织，经卡那
霉素筛选获得了再生植株；分子杂交证明外源基因已整合到石刁柏核基因组上。
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第 4期 胡忠等：药用植物基因工程的研究进展 375
蒿A rtemisia annlgl
石刁柏
Asparagus ofwinalis
颠茄
Atropa belladonna
甜菜 Beta”岫
毛地 黄 Digitalis lal4~a
洋地黄n purpurea
甘草 G iza gl~ra
乌拉尔甘草
G．uroJensis
宁夏 枸杞
Lycium barbarum
黄花烟草
Nicotiana rustica
枳壳 Poncirus t,~floliata
黄岑 Scutellaria baicolensis
Pno$．kan
Nos-A H
豫 』"-kan,TR2"-gus
(pGSGluc1)
Pno$·kan(pBinl9^
Pno$·hyg(paGS1251
Pno$·kan 35S-gus
(pBIj2j)
豫 』"-kan,TR2"-gus
(pGSGluc1)Pno$· nm
35S-gus(pBIj2j)
Pl~o$·kan 35S-gus
(pBIj2j)
豫 』"-kan, TR2"-gus
(pGSGluc1)
Pno$．kan
Pno$·kan(pBinl9^
Pno$·hyg(pA GS125)
PI1．o$一kan，35S-gus
Rj(pRiA46) 青蒿素 Artemisinin +
Ti 未确定Not determined +
莨菪烷生物碱
Tropane alkaloids
Betalain pigments
Ti(pGV2260) 未确定 Not determined ·
Ri(pRi 1 5834) 强心甾 Cardenolides +
Ri(pRi15834) 甘草甜素 Glycyrrhizin ·
Rj(pRi 1 5834) 甘草甜素 Glycyrrhizin ·
Ti(pGV3850， 未确定 Not determined +
neoIl03)
Rj(pRjl855) 烟碱生物碱 +
Nicotine alkaloids
Ti(pGA482GG)未确定 Not determined +
Rj(pRjl5834) 黄酮类 Flavonoids ·
3通过转基因改 良药用植物的遗传特性
将一些有用的目的基因导入药用植物 中，可望在短时间内实现药用植物某些遗传特性
的定向改 良。这些研究主要包括三个方面。
3．1提高抗性(包括抗病虫害、抗除草剂、抗逆性等)
药用植物的平均产量远低于其潜在的最高值 ，其原因之一是它们并不总是生活在最适
宜的环境中，且经常受到各种逆境条件及病毒、虫害等的影响。因此，应用基因工程的手段提
高药用植物的抗性具有十分重要的意义。目前，已被鉴定和克隆的可供植物遗传操作的有益
基因多达几百个，它们分别来 自微生物 、植物、动物和人体，其 中有一大类与植物的抗病、抗
虫、抗盐碱、抗旱、抗寒、抗除草剂等抗逆性有关。通过遗传转化，将这些基因导入宿主植物以
增强其抗性，这方面的研究工作已经取得了很大进展【”。为了增强颠茄对除草剂的抗性，Saito
等[3目将构建好的嵌合载体 pARK5(含有 35s—bar基因)转入发根农杆菌 15834菌株 中，进而感
染颠茄叶盘。转基因植株和其后代均显示了对除草剂 phosphinothricin和 bialaphos的抗性，
而其颠茄碱的合成不受任何影响。同样地，Yamazaki等 利用 双元载体转化系统，将编
码 phosphinothricin乙酰转移酶的 bar 基因成功地导入到莨菪(Scoparia dulcis)基 因组中，转
基因植物及其子代表现出对除草剂具有明显的抗性 ，而次生代谢途径仍能正常进行。
珊
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376 热 带亚 热带 植物 学报 第 10卷
目前，我国科学工作者 已利用 Ti转化系统介导获得了抗 CMV／TMV病毒的番茄和抗
BNYV 病毒的甜菜 。枳壳生产 中面临一种由病毒引起的衰退病，贺红等[4q以枳壳实生苗
上胚轴为材料进行遗传转化，成功地获得了转柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因的植株。宁夏枸
杞为名贵的中药材，又是良好的滋补品。然而，病原菌 GlomereUa cingulata可侵染宁夏枸杞
的花蕾、青果、叶，导致黑果病的发生，使其品质下降，大幅度减产；此外危害枸杞的病虫种类
也很多。目前，我们 已经建立了以发根农杆菌和根癌农杆菌介导的宁夏枸杞离体转化和植株
再生系统，现正在利用基因工程技术培育抗病、抗虫新品质[3蝴 。
3．2 代谢 途径
药用植物中有效成分 (如生物碱、皂甙、黄酮、甙类、萜类等)含量甚微 ，利用栽培措施大
幅度地提高有效成分的含量往往难度很大。已有的研究表明，次生代谢产物是药用植物特殊
分化细胞在酶的作用下，经多个反应步骤合成的，而酶的合成受基因调节控制。因此在掌握
次生产物代谢途径的分子机制的基础上，借助转基因技术来调节基因的表达和酶的合成，可
以提高目标产物的含量。
莨菪碱 6—13一羟化酶是莨菪烷生物碱生物合成途径中催化莨菪碱合成 6—13．莨菪碱、再
经 环氧 化作用合成东莨菪碱 的关键酶。Hashimoto等[4 以发根农杆菌作载体，将天仙子胺
6一B一羟化酶转入到富含天仙子胺的颠茄发状根中，结果羟化酶活性增强，6一B一羟化莨菪碱
含量比用野生型发根农杆菌诱导出来的发状根高，东莨菪碱 的含量提高了 5倍。一种来源于
酵母的鸟氨酸脱羧酶基因也成功地转入烟草发状根并得以表达，使烟草中的尼古丁含量增加
2倍[4I。通过转移细菌的赖氨酸脱羧酶基因也使烟草发状根中尸胺和霉藜碱的含量增加 。
紫 杉 醇 是 一 类 结 构 异 常 复 杂 的 新 型 抗 癌 药 物 ，1988年 Denis等 报道 了以
10一deacetylbaccatinII为原料半合成紫杉醇，但该原料要从红豆杉属植物中提取。目前，全合
成工作虽已完成 ，但 由于合成路线比较复杂尚无商业应用价值 。最近 Croteau等[4目从短叶
红豆杉茎提取物 中获得紫杉醇 生物合成途径 中关键的二萜环化酶 一紫杉二烯合成酶 的
cDNA克隆物，并进行了测序和氨基酸序列分析。胡国武等【4 以东北红豆杉愈伤组织为材料，
采用 RT—PCR技术也获得了紫杉烯合成酶基因片段，并转化到大肠杆菌 l09。这些结果为
研究紫杉醇合成代谢相关的一系列催化酶的基因表达及调控打下了基础。
在 了解青蒿素生物合成途径后，陈晓亚等 将源于棉花基因组的(+)一8一杜松烯合成酶
(C )基因和法呢棋焦磷酸( 合成酶基因分别插入到植物表达载体 pBI121和 pBI101．2
系列中，再通过根癌农杆菌和发根农杆菌分别介导转化青蒿叶片，已获得转基因的发状根、
愈伤组织和不定芽。青蒿素检测结果表明，与对照相比转 Cad发状根系中青蒿素含量平均提
高 80％；转 Cad愈伤组织中青蒿素含量达到发状根的水平，提高 2—3倍；而在转 FPP合成酶
基因的根系中，其青蒿素含量未见有明显的差异。近些年，一些研究者对吲哚碱生物合成的
关键酶--strictosidine合成酶产生了浓厚的兴趣，该酶可以催化 secologanine和色胺缩合反
应生成 strictosidine。目前，来源于植物中的 strictosidiDe合成酶基因已在大肠杆菌[5q、昆虫培
养细胞[521和番茄[5 中表达。Okada等 从黄连细胞中分离 了编码 (S)一四氢小檗碱氧化酶的
基因，进行序列分析，克隆到质粒 PTVB2中，再转化到大肠杆菌 DH一5 Q中。在培养的大肠杆
瓣 雏雕 雕 翳 阱
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第 4期 胡忠等：药用植物基因工程的研究进展 377
菌的上清液中，检测到了该酶活性，从而为通过直接培养转化细菌或真菌而获得次生产物奠
定了基础。由于大部分药用植物的次生代谢途径仍不十分清楚，但利用转基因技术获得药用
植物的次生产物已显示出十分诱人的发展前景，并成为众多学者关注的焦点。
3．3 其它相关基 因工 程
在进行外源基因的植物次生代谢产物的遗传操作中，许多研究者对细胞色素 P一450基
因的研究兴趣与 日俱增。细胞色素 P一450位于某些细胞的光滑 内质网上，是多功能氧化酶系
的重要组成部分，具有底物广泛性和功能多样性的特点，在许多内源性和外源性化合物的氧
化、过氧化和还原代谢中起重要的作用。在哺乳动物肝细胞中，一些 内源激素及药物被体内
的酶氧化为具更高生物活性的代谢物，有毒物质被 P一450的氧化反应所分解。外源 P一450基
因在宿主细胞中的表达可以影响细胞器膜上的电子转移活动，导致转基因植物的表型及代
谢模式的变化。Saito等 将从兔肝细胞分离的细胞色素 P一450基因经农杆菌介导转入烟草
细胞并得到了表达，还改变 了烟草生物碱生物合成的类型。植物细胞色素 P一450广泛参与次
生代谢，产生有植保素功能的物质和对除草剂、杀虫剂等外毒素的生物转化解毒代谢。目前，
已分离纯化了一些植物细胞色素 P一450，在基因克隆和表达调控上取得了一些进展，但在抗
虫和抗除草剂的农作物基因工程方面尚处于起步阶段【5句。半胱氨酸合成酶在植物细胞硫同
化中起一个中心的作用，这一重要的磷酸盐依赖酶催化 L一半胱氨酸的合成。在植物细胞中，
存在有两种形式的半胱氨酸合成酶，半胱氨酸合成酶 A存在于细胞质中，而半胱氨酸合成酶
B则存在于叶绿体中。编码半胱氨酸合成酶 A的 cDNA基因已经克隆，并且经 pCSK3F介导
在植物细胞中得到了表达【5 。
利用基因工程手段，赵亚华等 已将小 鼠金属硫蛋 白基因通过根癌农杆菌介导整合到
枸杞细胞染色体上并使之表达，希望从转基因后代中培育出集枸杞的药用价值与锌元素的
营养价值于一身的优 良枸杞品种。由于绞股蓝入口时有苦涩味，人们对其服用 口感不好。目
前，国内的一些科学家期望将甜蛋白 Thaumatin基因转入绞股蓝并使之表达，利用极甜的
Thaumatin蛋白遮掩苦涩味[591。
利用基因工程的方法和技术，广泛挖掘和充分利用我国的药用植物资源 ，对发展我国的
医药事业、保障人们的健康有重要意义。进入 2l世纪，伴随着 “人类回归大 自然”的潮流，
药用植物在保护人类的健康方面将受到更多的青睐和关注。药用植物的基因工程起步较晚，
当前 已取得 了一些令人兴奋的进展，但还有很大的差距，我们认为今后应加强以下几方面的
工作：
1)进一步完善药用植物 的基因转移和离体植株再生体系，尤其是单子叶植物和裸子植
物，以便于进行目的基因的转移；
2)加强大规模生产工艺的优化研究，为药用成分工业化生产奠定基础；
3)进一步分离和鉴定出更多的影响特定有效成分生物合成的关键酶及其基因，并研究
有效成分生物合成的生物调控机制；
4)分离和研究那些具有组织特异性功能的启动子，实现 目的基因在特定组织或细胞中
的定向表达。
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378 热 带 亚热 带植 物 学报 第 l0卷
可以相信 ，随着生物化学、分子生物学、生物工程学等多学科科研工作者的密切配合和
共同努力，基因工程技术在药用植物领域 已经取得的成就及其巨大的潜能必将进一步推动
药用植物生物技术的研究，以实现药用植物的合理开发和利用。
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