全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，1 1(2)：153—156
Journo／of Tropical and Sub~op／ca／Botany
KT和 C 对绿豆下胚轴原生质体的体积和
CaM 含量的影响
李德红 张瑞凤 ’ 潘瑞炽 王小菁 ¨
(华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631)
摘要：以黄化绿豆幼苗下胚轴原生质体为材料，探讨钙信使系统在 KT诱导原生质体体积变化中的作用。I mol／L
KT可诱导含钙培养液中绿豆下胚轴原生质体膨大，处理后30 rain达到最大体积。Ca2~通道阻断剂Verapamil、Ca2+通
道竞争性抑制剂 LaCI3和钙调素拮抗剂 n 、CPZ可明显抑制 KT诱导的原生质体膨大。另一方面，无论是 KT处理还
是对照(CaCh单独处理)，原生质体内 CaM 含量均在处理后 30 m—in时达到峰值，前者是后者的 5倍 ．在 KT+CaCh处理
液中加入 5 moi／LV~ pamil、50 moi／LLaCI3、5 mol／L1H’或 CPZ后原生质体 内 CaM 含量都大大降低 。以上结
果表明，CaM 可能与 Ca2+共 同参与KT的信号传递。 ’
关键词：激动素；钙 ；钙调素；原生质体
中圈分类号 ：Q942．6 文献标识码：A 文章编号 ：1005-3395(2003)02-153-04
Effects
．
of KT and Ca2+on the Change in Volume of
Protoplasts an d CaM Content in Hypocotyl of
Etiolated M ung Bean Seedlings
LI De—hong ZHANG Rui—feng‘ PAN Rui—chi WANG Xiao—j ing”
(Co／eSe of Life Science，South China Normal Unlvers Cl~ gzhou510631，China)
Abstract： 白e role ofcalcium ion in kinetin D signal transduction was studied with etiolated mung bean
(Phaseolus radiatus L．) hypocotyl protoplasts． Tl1e volume of protoplasts maintained at a constant osmotic
potential at 2O士2℃ began to swell 10 minutes later when treated wi th l moFL KT in the present ofCaC12, and
reached their maximuln at 30 minutes， then declined to the same level as the control oBe (CaC12 only) at 60
minutes． sweling ofprotoplasts induced by KT could be signifcantly inhibited by Verapamil(C channel
blocker)or LaCl3【Ca2 channel competitve inhibitor)respectively．Calmodulin antagonists n ，CPZ and W7
could obviously inhibit protoplasts swelling induced by KT．CaM levels in protoplasts reached their peaks at 30
minutes whethertreated wi th or without KT，the CaM content ofthe treated one being about five times more than
that in treatmen t wi thout KT．However，wheil KT and CaC|2 solutions Wele added wi th 51．t mol／L CPZ
． Tl or
O．5 mol／L W 7， CaM level in protoplasts declined greatly． It is suggested that calcium acts as the second
messenger in l 一induced swelling ofprotoplasm in this system an d Ca2+-CaM may play an im role．
收稿日期：2002-o7一l1 接受日期 ：2Oo2一lo-3l
基金项 目：国家 自然科学基金(39970079)；教育部留学回国人
员科研启动基金(教外司留[19981679号)；优秀年轻
教师资助计划项 目资助
现在工作地址：广东省环境保护局。广州 510045
“ 通讯联系人 Corespondingauthor
缩写Abbreviation：KT：激动素Kinetin；CAM．钙调素Catmodulin：
1rIiP：三氟啦嗪 Trifle ； CPZ：氯丙嗪 Chloropromazine：
MES．2-1 吗啉 乙烷磺酸 2-(N-morpholino)ethane sulphonicacid
present study did not exclude the possibility of
involvemen t ofother cellular signaling system．
Key words：KT；Calcium ；CaM ；Protoplast
近年来，已有大量资料证明钙和钙调素参与植
物代谢和生长发 。钙对植物激素的功能有强烈
的修饰作用。Eliot曾经推论通过 Ca2+-CaM 调节细
胞内功能是植物激素的一种统一作用方式【习。本文
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热带亚热 带植物 学报 第 11卷
探 讨 KT在 原生质体 体积 变化 中的作用 以及 与
CaM含量变化的关系，这对研究 Ca2+-CaM 参与植
物激素作用的调控是很有意义的。
1材料和方法
原生质体制备 采用我们先前的方法 培养
绿豆(Phaseolus radiatua L．)黄化幼苗 、分离和纯化
原生质体。
原生质体体积测定 将原生质体分别悬浮
于基本培养液 (含 9％甘露醇 +5 mmol／L IVIES，pH
6．0)中，调整原生质体的密度到 10S-5xl0s个 mlI 。然
后加入 CaC12(250 u moFL)或 ／和 KT(1 u moFL)，
或进一步加入其它试剂，于黑暗中保温一定时间后
参照 Bossen等的方法【4】，将 原生质体制 片，显微摄
影。以测微尺测量每张制片中至少 100个原生质体
的直径，计算其体积，每个处理最少重复三次。
原生质体内 CaM 含量的测定 按上述方法
提取、纯化的原生质体，在含或不含 KT的含钙培养
液中保温一定时间后，置于液氮中终止反应并破碎
原生质体 ，然后保存于 -20℃冰箱中备用。参照赵升
浩等[81的方法用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定
CaM 含量。标准植物 CaM 由河北师范大学生物系
提供。
蛋白质含量的测定 采用考马斯兰 G-250法唧。
2结果和分析
2．1 KT诱导原生质体膨大的时间进程和 CaM 含
量的动态变化
在含钙培养液中加或不加 l u mol／L KT处理原
生质体 ，黑暗 中分别保温 0，5，10，20，30，40，60 rain
后，测定其体积，结果如图 lA所示a不加 KT的含
钙培养液中的原生质体体积变化不大 ，处理后 0—
30一rain略减小，30-60一rain体积慢慢回复。而加 KT
的原生质体在处理 10一rain后可观察到膨大现象 ，随
着时间推移，原生质体逐渐膨大，30一rain时达到最
大体积，随后膨大程度减弱。
另一方面 ，无论 是 KT+CaCI2处理还是对照
(CaClz)的原生质体 ，都在处理后 30一rain时 出现
CaM 峰值(图 1B)。在试验的 60 min内，加 KT后，
原生质体 CaM 含量比对照显著升高，30一rain后，
CaM 含量远远高于对照的水平，几乎是它的 5倍。
原生质体体积变化和 CaM 含量都在处理后30一rain
时变化最大 ，这暗示体积变化可 能与 CaM 含量变
化存在一定联系 。
时闻 Time《rain)
图 l KT诱导原生质体膨大【A)和CaM含量变化(1})的时间进程
Fi吕 lTime c0峨 ofKT-inducod h蛆8esofprotoplutvolume【A)
andCaMcontent(B)
Protoplastswm m丑intIincdindarkness at20-~．℃ for o 10,20，
30,4o O1"60 rain respectively．Cac12 and KT wm o．25 mmoFL and
l,tool／L,respectively．Values玳 them∞nsof3 replicatesper缸嗣衄删
口 ◇KT+Ca~
2．2 钙通道阻断剂 Verapamn．和钙通道竞争性抑
制剂 LaCI,对原生质体体积和 ClM 含量的
影响
为了了解膨大是否需要胞外 Ca2+进入胞 内这
一 过程，我们采用了钙通道阻断剂Verapamil和钙
通道竞争性抑制剂 LaCI3处理原生质体。Verapamil
是一种钙通道阻断剂，能阻断信使的产生【m。在含钙
培养液中加入 5 u mol／L Vcmqmmil，发现 KT使原
生质体膨大的效应从 l7．11％下降到7．09％，CaM 含
量也急剧下降，甚至比对照的含量还低。 不能进
入植物细胞内，它在质膜的外部抑制 C 的作用或
更 专一地 抑制 Ca2+内流【lq。在含 钙培 养液 中加
50 u mol／L LaC13后，LaC13抑制原生质体膨大，但对
CaM 含量的抑制比Verapamil弱得多(表 1)。可见，
减少 Ca2+进入胞内可抑制原生质体的膨大 ，同时也
降低钙调素含量 。这进一步表明原生质体膨大与
CaM 含量之间的关联。
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第 2期 李德红等：KT和 Ca2+对绿豆下胚轴原生质体的体积和 CaM 含量的影响 155
襄 I v．飘Ip蛐m 和 LaCI3对纛生质体体积和 CaM 含■的l参响
Table l Efe~ ofVcrapamiland LaCl~oll protoplastvolume
and CaM content
2．3 钙调素拮抗剂对原生质体膨大和钙调素含量
的影响
为 了进 一 步 了解 KT诱导 原生质 体膨 大 与
CaM 含量之间的关系，我们采用钙调素拮抗剂
CPZ、TFP、w 分别与 KT配合处理含钙培养液中的
原生质体。如表 2所示，CaM 拮抗剂明显抑制原生
质体膨大的同时，也使原生质体 内 CaM 水平急剧
下降，尤 以CPZ和 TFP对 CaM 含量的降低程度为
甚。该结果表明，当 CaM 含量减少或活性降低时
KT诱导的膨大受抑制 ，从而进一步表明原生质体
的膨大与其 CaM 含量有关。
襄 2 钙调素拮抗锕对原生质体体积和钙调素含■的影响
Table2 Efectsofoalmodulinant~on／stsO11protoplastvolume
and CaM content
3讨论
近年来，许多研究都发现激素等外界信号可使
原生质体膨大，并伴随着 Ca2+内流 ， ¨习，本试验
为此提供 了更进一步的证据 。原生质体膨大的原因
主要是通过吸收胞外的溶质或分解胞内淀粉及增
加 Co2固定物等来降低细胞内的渗透势 堋。对于本
实验系统而言，后两个原因应该可以排除。许多研
究发现 ，依赖于细胞分裂素的细胞膨大主要是离子
运输发生变化引起 的【 q。在本实验中，KT信号可
能使质膜打开 Ca2+通道，同时也可能打开其它离子
通道(如 Cl-、l(+通道)，从而使质膜吸收阳离子，引起
渗透势变化 ，导致吸水膨大 。当用钙通道拮抗剂
Verapamil、钙通道竞争性抑制剂 Ia3 等试剂阻碍或
减少 Ca2+进入原生质体，就会减轻膨大效应。另有
研究证实 Ca2+通道抑制剂 Vcrapamil和 Bcpridil抑
制 ℃a2+流入胡萝 卜原生质体07]。 通过细胞膜上
的 Ca2+通道抑制 Ca2+内流到苦草的叶肉细胞原生
质体【1玛。我们在先前的试验中发现 和 6-BA 习
对原生质体的影响也依赖于 Ca2+内流，V~ amil
和 LaCl 均能抑制这一过程，使原生质体体积膨大
受阻。由此我们推论，KT诱导的原生质体的膨大可
能也需要 Ca2+进入胞内。
本试验还发现 KT诱导的原生质体的膨大与原
生质体内CaM 含量有关。一般认为 CaM 的作用方
式是与 Ca2+结合形成活化的 Ca aM 复合物激活
靶酶D,1g,2q。本试验结果显示，无论 CaC12处理(对照)
还是 KT+CaC12处理 ，原 生质体 内 CaM 含量都在
30一rain出现一个峰值，此时 KT-H~aCl2处理的 CaM含
量是对照的 5倍左右，原生质体的体积也相应最大 。
这 与 在 IAA、6-BA 试 验 中 观 察 到 的 现 象 十 分
相 。
综上所述，KT所诱导的原生质体的膨大可能
是通过打开质膜上的C 通道或胞内贮钙体释放
Ca2+引起的胞质内Ca2+浓度升高而实现的。胞内
Ca2+浓度的变化可被 CaM感受，郝鲁宁和余叔文认
为CaM只有与Ca2 结合才有生理活性∞。因此，无
论 用 降 低 胞 内 Ca2+浓 度 的 钙 通 道 拮 抗 剂
Vcrapamil、钙通道竞争性抑制剂 Ia 或者减低胞内
CaM 含量的钙调素拮抗剂 TFP、CPZ、W7等都可 以
抑制原生质体的膨大。这说明，Ca2 可能与 CaM 结
合在一起参与了KT诱导原生质体膨大的过程。
此外，有报道指出，脱壁酶裂解产生的植物细
胞壁片断，能以信号分子的方式与细胞膜上蛋 白受
体结合 ，或改变膜脂的结构 ，引起细胞膜通透性的
改变 ，从而引起一系列细胞生理过程的改变鲫。本试
验中对照的原生质体体积在 60一rain内有一个体积
先略变小，然后慢慢回复的过程 ，这是否与脱壁酶
及脱壁操作有关尚待证实。
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