全 文 ：小 白 菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis
Makino)为十字花科(Cruciferae)芸薹属白菜种的亚
种，是我国南北广泛栽培的蔬菜之一[1]。紫色小白
菜[B. campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var.
communis Tsen et Lee]是小白菜的变种，具有易种
植、易采摘的特点，且叶片正面紫色，富含花青苷，
营养价值高，深受消费者的喜爱。花青苷具有较强
的抗氧化作用，具有延缓衰老、降低胆固醇、降血
响应面法优化超声辅助提取紫色小白菜花青苷的
工艺研究
杨碧云a,b, 叶丽萍a,b, 林琳琳a,b, 汪镇坤a, 邹伟明a, 曾晓兰a, 钟凤林a,b*,
林义章a,b*
(福建农林大学，a. 园艺学院； b. 蔬菜研究所， 福州 350002)
摘要： 为探讨从紫色小白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. communis Tsen et Lee)叶片中提取花青苷的最
佳工艺条件，在超声功率为 420 W、40%乙醇和两次超声提取条件下，采用 Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，设计 4 因
素 3 水平试验，研究了 pH、料液比、超声温度、超声时间对花青苷得率的影响。结果表明，紫色小白菜叶片花青苷提取的优化工
艺参数为料液比 1∶16 (pH 2.76)，在超声功率为 420 W、温度为 58℃下超声 12 min，花青苷的提取得率可达 4.11 mg g–1 DW。
关键词： 紫色小白菜； 花青苷； 超声波； 提取工艺； 响应面法
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.04.008
Ultrasonic Condition Optimization for Anthocyanin Extraction from
Purple Cabbage by Using Response Surface Methodology (RSM)
YANG Bi-yuna,b, YE Li-pinga,b, LIN Lin-lina,b, WANG Zhen-kuna, ZOU Wei-minga, ZENG Xiao-lana,
ZHONG Feng-lina,b*, LIN Yi-zhanga,b*
(a. College of Horticulture; b. Vegetable Research Institute, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract: The aim was to optimize the ultrasonic extraction method for anthocyanins from purple cabbage
[Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. communis Tsen et Lee] leaves. Under the conditions of 420 W
ultrasonic power, 40% ethanol and twice extraction, the interactive effects of four crucial parameters, including
pH, ratio of solid to liquid, ultrasonic time and ultrasonic temperature, were studied by central composite (Box-
Behnken) and response surface methodology (RSM). The results showed that the optimum process for anthocyanin
extraction was 1:16 of solid to liquid with pH 2.76 extracted at 58℃ for 12 min under 420 W ultrasonic power.
Under this condition, the extract yield of anthocyanins from purple cabbage leaves reached up to 4.11 mg g–1 DW.
Key words: Purple cabbage; Anthocyanins; Ultrasonic; Extract; Response surface methodology
热带亚热带植物学报　2014， 22(4)： 373 ~ 382
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2013–12–31　　　　接受日期： 2014–03–30
基金项目： 福建省大宗蔬菜产业体系项目(2012K83139294)；福建省自然科学基金项目(2012J01082)；福建农林大学校重点建设项目(6112c0409)
　资助
作者简介：杨碧云(1989~ )，女，硕士研究生，主要从事蔬菜生理生化研究。E-mail: yangbiyun2010@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mails: ZFL10305@126.com; lyz2003007@163.com
374 第22卷热带亚热带植物学报
脂、护肝、抗肿瘤、抗癌、抗过敏等作用，并有很好的
调色作用[2–6]。因此花青苷的研究越来越受到人们
的重视。
超声波作为一种辅助提取手段主要应用于
中草药的化学成分、植物油、多酚、芳香成分、多糖
的提取等领域。超声波可通过产生空化作用和次
级效应，使细胞周围和细胞内产生环流，从而提高
细胞壁和细胞膜的通透性，有利于细胞内有效成
分的释放，明显缩短提取的时间[7–8]。目前，国内
外众多科研工作者对采用超声辅助技术提取花
青苷进行了研究，如采用超声辅助技术提取了紫
甘 蓝(B. oleracea var. capitata)[7]、苋 菜(Amaranthus
mangostanus)[9]、紫甘薯(Ipomoea batatas)[10–11]、紫苏
(Perilla frutescens)[12]、黑胡萝卜(Daucus carota ssp.
sativus)[13]等中的花青苷。响应面试验设计法是采
用多元二次回归方程，拟合试验中多个因子与响应
值间的关系，估计回归方程的系数，通过对方程求
极值来达到参数优化的目的，从而解决受多种因素
影响的最优组合问题。与过去的正交设计法不同，
由于其具有更合理的设计和更优良的结果，在化学
工业、生物学、医学、食品学、工程学、生态学等领
域得到了广泛应用[14–17]，尤其在天然产物的提取优
化，如总黄酮[17–19]、多糖[20–21]、蛋白质[22]的提取都获
得了具有实用价值的最佳优化工艺条件。
目前，对紫色小白菜的研究主要集中于杂交
育种和栽培管理方面[23–24]，而对其花青苷的提取研
究仅见浸提法[25]，尚未见利用超声辅助提取法的报
道。本研究利用超声波对紫色小白菜花青苷进行
提取研究，并通过响应面分析法使优化其工艺，旨
在探究紫色小白菜花青苷的超声辅助提取的最优
工艺条件，从而建立一个实用的模型，为深入研究
及推广紫色小白菜的产业化开发提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
紫色小白菜[Brassica campestris L. ssp. chinensis
(L.) Makino var. communis Tsen et Lee]于 2013 年 9–
11 月种植于福建农林大学，播种 45 d 后采收叶片，
去掉叶脉，叶肉经冷冻干燥，粉碎后过 40 目筛，保
存于 –80℃冰箱内备用。
1.2 试剂及仪器
冰醋酸、丙酮、无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、
甲醇均为分析纯试剂。FW200 型高速万能粉碎机
(天津市泰斯特仪器有限公司)、低温离心机(Thermo
D-37520 Osterode，德 国)、TU-1810 紫 外 可 见 光
分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)、KQ-
600DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有
限公司)、AKWL-IV-50 艾柯超纯水系统(成都康
氏康宁科技发展有限公司)、BS214D 电子天平(北
京赛多利斯仪器系统有限公司)、LGJ-S24 型冷
冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)、奥立龙
Model868 型酸度计(北京长风仪器仪表公司)。
1.3 花青苷的提取和含量测定
将紫色小白菜叶片冻干粉末按 1∶5 料液比用
酸化乙醇溶液(乙酸∶乙醇∶水=5∶40∶55)溶解，
在功率为 420 W，温度为 50℃条件下超声波辅助提
取 30 min，在 4000 ×g 下离心 10 min，吸取上清液
稀释 30 倍，以酸化乙醇水溶液为对照，1 mL 比色
皿的溶液用紫外分光光度计在 195~650 nm 范围内
进行光谱扫描[25]。参照 Wrolstad 法[26]进行花青苷
含量的测定。
1.4 提取工艺单因素优化试验
紫色小白菜叶片冻干粉末分别对乙醇浓度、
pH 值、超声功率、料液比、时间、温度和提取次数等
单因素进行优化，各因素水平设计见表 1。
1.5 响应面法设计试验
在单因素试验的基础上，利用响应面法确定影
响水平，根据 Box-Behnken 的中心组合试验设计，
固定浸提溶剂，设计 4 因素 3 水平的响应面分析试
验(表 2)。试验数据使用 Design-Expert 8.0 软件进
行分析，得到响应面分析图和方差分析表，确定紫
色小白菜花色素苷提取的最佳条件。采用响应面
试验确定的优化条件对紫色小白菜花青苷提取工
艺进行验证。
1.6 数据处理
采 用 Excel 2003、Design-Expert 8.0 和 Origin
9.0 软件进行数据分析及作图，并用 DPS V3.01 进
行单因素方差分析，LSD 检验法进行多重比较，
P<0.05 表示差异显著。
第4期 375
2 结果和分析
2.1 紫色小白菜花青苷的光谱特性
由图 1 可知，紫色小白菜的色素提取液在 335 nm
处有 1 个最大吸收峰，在 530 nm 处有 1 个侧峰，
这是植物花青苷的特征吸收峰之一，由此判断紫色
小白菜的紫色提取液主要成分属于花青苷类色素。
本试验以该波长作为测定紫色小白菜的花青苷质
量浓度的特征谱[27]。
2.2 单因素试验
通过对乙醇浓度、pH、超声功率、料液比、超
声时间、温度和提取次数等因素进行试验，结果表
明，乙醇浓度为 40%，pH 为 3，超声功率 420 W，
料液比为 1∶15，在 60℃下超声 10 min 是单因素
试验的最佳结果。从图 2 可见，随乙醇浓度升高，
紫色小白菜花青苷的提取得率先逐渐提高，乙醇浓
度为 40% 时的得率最高，然后不断下降。随超声
功率的升高，提取得率呈现先提高后快速下降的趋
势，表明在超声功率较小时，细胞不能受到超声波
充分的作用，而当超声功率过大则会加速提取液的
流动，破壁作用随之减弱，使胞内花青苷溶出速率
减缓。随料液比的升高，提取得率呈现先提高后快
速下降的趋势，说明若溶剂太少，会导致超声波在
表 1 单因素试验设计
Table 1 Design of single factor experiment
因素 Factor 水平 Level
乙醇 Ethanol(%) 0、20、30、40、50、60、70
pH 0.5、1、2、3、4
超声功率 Ultrasonic power (W) 240、300、360、420、480、540
料液比 Ratio of solid to liquid 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30
超声时间 Ultrasonic time (min) 5、10、20、30、40、50
超声温度 Ultrasonic temperature (℃ ) 30、40、50、60、70
提取次数 Extraction times 1、2、3、4
表 2 响应面试验因素水平
Table 2 Factors in RSM experiment
因素
Factor
编码
No.
水平 Level
–1 0 1
料液比 Ratio of solid to liquid A 1∶10 1∶15 1∶20
超声时间 Ultrasonic time (min) B 5 10 15
超声温度 Ultrasonic temperature (℃ ) C 50 60 70
pH D 2 3 4
图 1 紫色小白菜花青苷的吸光光谱
Fig. 1 Absorbance of anthocyanin from purple cabbage
杨碧云等：响应面法优化超声辅助提取紫色小白菜花青苷的工艺研究
376 第22卷热带亚热带植物学报
液相中的吸收大于固相，超过 1∶15 后，由于色素
被稀释，有机溶剂接触色素的机会减少而导致得率
降低。随超声时间的延长，提取得率也呈现先提高
后快速下降的趋势，以超声 10 min 的得率最高，达
2.12 mg g–1，这表明超声时间过短，紫色小白菜花青
苷溶解不充分，而过长的超声波时间可能使花青苷
发生降解作用，从而导致花青苷得率下降。花青苷
提取得率以 60℃时最高，温度继续升高后提取得率
出现快速下降，表明高温会造成花青苷的分解，影
响其生物活性。
2.3 提取次数的影响
随着提取次数的增加花青苷的得率也相应地
增加，第 1 次的花青苷提取得率为 2.87 mg g–1，第
图 2 单因素对花青苷提取得率的影响。不同字母表示差异显著(P<0.05)。
Fig. 2 Effects of factors on anthocyanin yield. Different letters above line indicate significant difference at 0.05 level.
第4期 377
2 次达 3.63 mg g–1，而第 3 次(3.79 mg g–1)和第 4 次
(3.95 mg g–1)的提取得率变化不大，说明提取次数超
过 2 次后对得率的影响不大，从能耗、时间以及提
取剂的经济角度来看，已没有多少实际意义，故提
取次数以 2 次为佳。
2.4 响应面法优化
响应面试验结果及回归分析　　为研究各工
艺参数之间的交互作用对紫色小白菜花青苷得率
的影响，选用中心复合模型，采用 4 因素 3 水平共
29 个试验点(5 个中心点用以估计试验误差)的响
应面分析试验，按表 3 的顺序进行试验，将所得的
数据用 Design-Expert 8.0 软件进行分析，以料液比
(A)、时间(B)、温度(C)和 pH (D)为自变量，以花青苷
的得率(mg g–1)为响应值，经回归拟合得到二次回归
方程：Y = 4.17 + 0.047A + 0.037B – 0.12C – 0.18D +
0.071AB – 0.031AC – 0.021AD – 0.14BC – 0.11BD +
0.049CD – 0.21A2 – 0.16B2 – 0.42C2 – 0.48D2 + 0.11A2B。
方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各
因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响
的方向。由此得出最佳提取工艺条件为：料液比为
1∶16，超声时间为 11.86 min，超声温度为 57.66℃，
pH 为 2.76。
利用 Design-Expert 8.0 软件对紫色小白菜花
表 3 中心组合试验设计及结果
Table 3 Design and results of central composite test
编号
No.
因素 Factor 得率 Yield
(mg g–1)
预测值 Predicted
value (mg g–1 )
编号
No.
因素 Factor 得率 Yield
(mg g–1)
预测值 Predicted
value (mg g–1)A B C D A B C D
1 10 5 60 3 3.71 3.67 16 15 15 70 3 3.20 3.36
2 20 5 60 3 3.60 3.63 17 10 10 50 3 3.51 3.58
3 10 15 60 3 3.86 3.82 18 20 10 50 3 3.76 3.74
4 20 15 60 3 4.03 4.06 19 10 10 70 3 3.41 3.40
5 15 10 50 2 3.55 3.62 20 20 10 70 3 3.54 3.44
6 15 10 70 2 3.31 3.28 21 15 5 60 2 3.61 3.56
7 15 10 50 4 3.16 3.17 22 15 15 60 2 3.97 3.84
8 15 10 70 4 3.11 3.02 23 15 5 60 4 3.32 3.42
9 10 10 60 2 3.54 3.59 24 15 15 60 4 3.25 3.27
10 20 10 60 2 3.64 3.72 25 15 10 60 3 4.12 4.17
11 10 10 60 4 3.31 3.27 26 15 10 60 3 4.10 4.17
12 20 10 60 4 3.33 3.33 27 15 10 60 3 4.32 4.17
13 15 5 50 3 3.63 3.52 28 15 10 60 3 4.13 4.17
14 15 15 50 3 3.92 3.89 29 15 10 60 3 4.16 4.17
15 15 5 70 3 3.49 3.57
青苷提取的响应值进行回归分析，结果表明，一次
项 C、D, 交 互 项 B、C 以 及 二 次 项 A2、B2、C2、
D2 对得率的影响均达极显著水平，表明试验因子
对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值有
很大的影响，这和模型回归中的线性和平方项影响
显著项对应，在所选取的各因素水平范围内，对结
果的影响依次为 pH > 温度 > 料液比 > 时间。失拟
项(F=1.56)不显著，说明试验误差很小。回归方程
的 F 值为 18.09，P<0.0001，达到极显著水平。相
关系数 R2=0.9543，说明该回归方程拟合程度较好。
变异系数(CV=2.92%)<5%，说明模型的重现性较
好[28]。这说明该回归模型是合理的，试验具有很高
的可信度和准确性，可以用于紫色小白菜花青苷得
率的预测。
响应曲面与等高分析　　根据紫色小白菜花
青苷得率的回归模型作出三维响应面图和等高曲
线图(图 3~8)，每个响应面对其中两个因素进行分
析，另外两个因素固定在零水平。通过三维图与二
维图，可以看出试验水平与每个变量或变量之间的
交互影响的响应值之间的关系。等高线的形状(圆
杨碧云等：响应面法优化超声辅助提取紫色小白菜花青苷的工艺研究
378 第22卷热带亚热带植物学报
形、椭圆形)反映变量之间的交互影响是否显著，圆
形的等高线表明两变量之间的交互影响不显著。
从图 3~8 可以看出，超声温度和时间的交互作用
最显著，其它因素间的交互作用较小。结合表 4 的
回归方差分析，料液比的变化坡度较超声时间的大
(图 3)，且料液比的等高线变化数量多于超声时间
的，说明料液比对紫色小白菜花青苷得率的影响大
于超声时间；同理，温度对花青苷得率的影响大于
料液比(图 4)；pH 值对花青苷得率的影响大于料液
比(图 5)；温度对花青苷得率的影响大于超声时间
(图 6)；pH 值对花青苷得率的影响大于超声时间(图
7)；pH 值对花青苷得率的影响大于温度(图 8)。
根据响应面试验所得的优化提取工艺进行验
证试验，准确称取 0.5 g 干燥的紫色小白菜叶片粉
末，以料液比 1∶16 加入 0.05% HCl-40% 乙醇 8 mL，
调节 pH 为 2.76，在 58℃下以 420 W 的超声功率
提 取 12 min，提 取 次 数 2 次。 重 复 试 验 3 次，花
青苷的平均得率为 4.1102 mg g–1，与模型预测值
(4.2133 mg g–1)的相对误差仅为 2.5%，说明此模型
有效，采用响应面法得到的紫色小白菜花青苷提取
工艺参数可靠，重现性好，具有实用价值。
3 结论和讨论
本研究利用超声波辅助提取方法，在单因素
试验的基础上，采用 4 因素 3 水平的响应面分析
法，针对超声时间、温度、料液比等因素进行了工艺
条件优化，通过回归模型进行参数优化，确定最佳
工艺的提取条件为：料液比为 1∶16 (pH 2.76)，在
58℃下超声提取 12 min。在此条件下紫色小白菜
花青苷的提取得率可达 4.11 mg g–1 DW，从而建立
起了其优化条件的数学回归模型，并分析了各因子
对响应值的影响，本试验结果表明，模型拟合程度
高，试验误差小，可用于实际预测，是一个实用的、
表 4 中心组合试验的方差分析
Table 4 ANOVA analysis of central composite test
来源 Source 平方和 Sum of square 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F P > F
模型 Model 3.07 15 0.2 18.09 <0.0001**
A 0.027 1 0.027 2.38 0.1469
B 0.011 1 0.011 0.97 0.3435
C 0.18 1 0.18 15.66 0.0016**
D 0.38 1 0.38 33.31 <0.0001**
AB 0.02 1 0.02 1.79 0.2042
AC 3.74×10–3 1 3.74×10–3 0.33 0.5753
AD 1.71×10–3 1 1.71×10–3 0.15 0.7039
BC 0.084 1 0.084 7.39 0.0176*
BD 0.046 1 0.046 4.08 0.0645
CD 9.45×10–3 1 9.45×10–3 0.83 0.3776
A2 0.28 1 0.28 24.82 0.0003**
B2 0.18 1 0.18 15.50 0.0017**
C2 1.13 1 1.13 99.49 <0.0001**
D2 1.49 1 1.49 131.30 <0.0001**
A2B 0.03 1 0.03 2.68 0.1254
残差 Residual 0.15 13 0.011
失拟项 Lack of fit 0.11 9 0.013 1.56 0.3541
误差 Error 0.033 4 8.17×10–3
总和 Total 3.22 28 R2=0.9543 Radj
2=0.9016
**：P<0.01； *：P<0.05.
第4期 379
图 4 料液比和超声温度交互影响的响应面图和等高线图
Fig. 4 Contour map and response surface graph of interaction effects between ratio of solid to liquid and ultrasonic temperature
图 5 料液比和 pH 交互影响的响应面图和等高线图
Fig. 5 Contour map and response surface graph of interaction effects between ratio of solid to liquid and pH
图 6 超声时间和超声温度交互影响的响应面图和等高线图
Fig. 6 Contour map and response surface graph of interaction effects between ultrasonic time and temperature
图 3 料液比和超声时间交互影响的响应面图和等高线图
Fig. 3 Contour map and response surface graph of interaction effects between ratio of solid to liquid and ultrasonic time
杨碧云等：响应面法优化超声辅助提取紫色小白菜花青苷的工艺研究
380 第22卷热带亚热带植物学报
易于操作的提取方法。
近年来，对于花青素提取方法的研究是较为活
跃的领域，有关的研究报道较多，一些新的提取方
法，如微波、超声波、超高压等都得到了应用[8]。超
声波辅助提取植物花青苷具有简单、高效、成本低
等特点，且其提取效果和超声作用时间、强度、频率
及所用溶剂及样品种类等有关[29]。响应面法可以
在更广泛的范围内考虑因素的组合，并对响应值进
行预测，从而得到更可靠的优化工艺条件。周丹
蓉[17]对枇杷(Eriobotrya japonica)花的总黄酮、石恩
慧[30]对板栗(Castanea mollissima)总苞的多酚物质、
王伟[31]对桑树(Fructus mori)的桑葚色素提取工艺
条件进行了优化，都证明利用响应面分析法和超声
辅助技术体系具有较高的效率、优越性及巨大的发
展潜力。本试验利用响应面法对紫色小白菜花青
苷提取工艺进行了优化，建立了紫色小白菜花青苷
提取的技术体系，这将为研究紫色小白菜等紫色叶
菜类的外观品质提供一个良好的技术平台，还为紫
色小白菜花青苷的产业化开发提供参考。
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图 8 超声温度和 pH 交互影响的响应面图和等高线图
Fig. 8 Contour map and response surface graph of interaction effects between ultrasonic temperature and pH
图 7 超声时间和 pH 交互影响的响应面图和等高线图
Fig. 7 Contour map and response surface graph of interaction effects between ultrasonic time and pH
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