全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，l1(1)：7-10
Jounu／of Tropical and Subtropical Botany
沙田柚黄龙病病原体的电镜观察与 PCR检测
董高峰 黄 涛 李耿光 张兰英 徐信兰
(中国科学院华南植物研究所，广东 广州 510650)
擒要：柑桔黄龙病可以侵染沙田柚而产生典型的 ‘斑驳’症状。我们通过电镜观察表明，带病沙田柚的病原体在形
态、大小和构造上均与柑桔黄龙病病原体 (类细菌)相似；PCR扩增也证明其病原体 DNA与柑桔黄龙病病原体的
PCR产物具有很高的同源性。
关■词：沙田柚；柑桔黄龙病；病源体形态；聚合酶链式反应
中圈分类号：$436．661．19 文献标识码 ：A 文章编号：1005-3395(2003)01-0o07—o4
Detection of Citrus Yellow Shoot Pathogen in Shatianyou
Pommelo by Electron M icroscopy and PCR M ethod
DONG Gao．-feng HUANG Tao LI Geng．-guang ZHANG Lan．·ying XU Xing·-lan
(South China Institute of Botany,the Chinese Academy o／Sciences，Guangzhou 510650,China)
Abstract：Citrus yelow shoot disease(citrus buanglongbing)leaves of Cit丌ls maxima CV．Shatianyou colected
from pommeloorchardinMeizhou，GuangdongProvince，showedtypical symptom ofleafmottling．Thepathogen
which was observed under electron microscopy was similar in morphology and structure to bacteria-like organism
of citrus huanglongbing disease．Polym erase chain reaction (PCR) analysis also proved that the DNA ofthe
pathogen was greatly homologous、Ⅳitl1 PCR product fiom that of citrus huanglongbing pathogen ． Th e result
exhibitsthatthe citrusyellow shotcouldinfectpommelo，whichseldom appearedinthisfruit．
Key words： ‘Shatianyou’pommelo(C r maxima CV．Shatianyou)；Citrus huanglongbing；Citrus yelow
shot；Pathogen morphology；Polym erase chain reaction(PCR)
柑桔黄龙病 (Citrus huanglongbing)是世界柑
桔生产上的一种毁灭性病害，在我国南方柑桔产区
尤为严重。本病主要通过嫁接和木虱虫媒传染，一
般 认 为 病 原 体 是 一 种 类 细 菌 (bacteria-like
organism,BLO)，多在寄主筛管细胞和薄壁细胞中
分布，只侵染柑桔属、金桔属和枳属植物【1-4]。目前，
柑桔黄龙病的检测方法主要包括电镜观察网、荧光
诊断法 旧、血清学检测法 圆及聚合酶链式反应
(PCR)[1川等。由于电镜观察和荧光诊断法都不够稳
定可靠，因此现在只是作为一种辅助检测方法。血
清学检测法虽然 以其简捷灵敏的特点成为 目前应
用最为广泛的一种检测方法，但是它也存在着效价
收稿 日期 ：2ool—l2—3l 接 受日期 ：2002．-0 _o5
基金 项 目 ：国家 自然 科学 基 金 (39870539)；广 东省 自
然科学基金 (980478)； 广东百项创新工程
(99B05902X)．
低、很难检测未显病症材料的BLO等缺点。聚合酶
链式反应 (PCR)则以其准确、灵敏而且还能检测出
未显病症材料的BLO等优点逐渐得到应用。邓晓
玲、田亚南等曾先后利用 PCR技术检测出蕉柑、红
江橙、芦柑及福桔等多个柑桔品种的黄龙病病原嗍。
沙田柚作为柚类的一个优质品种，近年来在全
国尤其是广东发展很快。1998年，全国柚类栽培面
积 l8．26 hm2，占柑桔总栽培面积的 l1．75％，居柑桔
类的第一位，其中沙田柚的面积占柚类栽培面积的
45．25％，在广东更占到 6o％以上。随着柚类栽培面
积的不断扩大，各种传染性病原体病害也在逐渐扩
展，以前很少在柚类中发现的黄龙病已在珀溪蜜柚
中鉴定出来嘲。本文通过电镜观察与 PCR扩增，已
初步检测出带有黄龙病病原体的沙田柚病株，从而
可为今后选育沙田柚无毒苗木及病害的防治提供
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8 热带亚热带植物学报 第11卷
必要的早期诊断方法。
1 材料和方法
材料 供试的感病材料为表现斑驳症状的
沙田柚(Citrus maxima(Buro．)Merr．CV．Shatianyou)
病叶，采自广东省梅JlI,市南口镇柚果园。作为正对
照材料的甜橙病叶采 自温室内嫁接接种的病苗，带
有典型的黄龙病症状。保持在温室内的健康一年生
桠柑实生苗作为负对照材料。
电镜技术 参照柯冲等的方法[51，略有改进。
取 沙 田 柚 病 叶 与 健 康 叶 的 叶 脉 部 ，切 成
1 111 x 2 rain小块，戊二醛、锇酸双固定，乙醇梯度
脱水，Epon 812包埋。包埋块经超薄切片机 LKB一1
切片，铅盐和铀盐双染色后，在厄M一1010型透射电
镜下观察。r
PCR引物的设计 参照邓 晓铃等 [刀 和
Vilechanoux等[1q报道的方法，根据柑桔黄龙病病
原体的亚洲株系 一2．6的 DNA序列设计PCR引
物。引物 1(P。)与 Il一2．6的 DNA序列的 134-153
位核苷酸同源，碱基序列为：5’一GCGTTCATGTAG
AAGTTGTG一3’。引物(P2)与Il一2．6的DNA序列的
514—533位核苷酸互补，碱基序列为：3’一ATCTC
AGTCGGTGGACATCC一5’。DNA扩增片段大小为
400bp。
模板 DNA的提取 采用 CTAB法从沙田柚
病叶中提取和扩增病原体 DNA[1q。取 0．5 g病叶叶
脉，剪碎，加入液氮磨成粉末状：加入 CTAB缓冲液
混匀，分装于 Eppendorf管中；用苯酚 ／氯仿、氯仿 ／
异戊醇抽提 2—3次，取上清液 ，加入 1／10体积
3 mol／L NaOAc(pH7．O)及 2倍体积 无水 乙醇于
- 20~C过夜；于 4℃下 16 000×g离心 20 min弃上清
液，分别用 70％和 95％的乙醇洗沉淀各 1次，用风
筒吹干并在室温下放置 5 min干燥 DNA沉淀。
PCR扩增反应 PCR试剂盒采用广州华美
生物工程公司的 PCR Kit试剂。PCR反应体系的总
体积为5O ul，反应体系包括：10×PCR反应缓冲液
5 ul，2mol／L心汀P 5 ul，P1和 P2各 1 ul(物质的
量为25 pmo1)，模板DNA 2 la1，灭菌双蒸水35 la1，
最后加入 Taq DNA聚合酶 1 ul(3 U ul )，混合
后 置于 PCR仪 (PERK ELMER GeneAmp PCR
System 2400)上进行扩增反应。反应条件为：94℃变
性 5 min后 ，依 94℃ 变 性 1 min一 55℃ 退 火
1 min一72℃延伸 1 min(最后一次 10 min)JIF~序进行
3O个循环。反应完毕后，取 PCR扩增底物 lO la1，用
1．2 g L 琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。每
次扩增反应均设空白负对照及含病原体 DNA的正
对照各一个，每项试验均重复 3次。
2实验结果
2．1沙 田柚病株症状
我们调查发现，在广东梅州已有大面积的沙田
柚发病，其中以南 田镇最为严重，发病率达 20％以
上。该病症状以夏秋梢最为明显，春梢则不明显，与
柑桔黄龙病极其相似。在发病初期部分新梢黄化，
出现 “黄梢 ”，黄梢最初 出现在树冠项部，后渐扩
散，经 1-2年发病；病叶初期表现花叶症状，再逐渐
发展成典型的斑驳症状(图 1)，在后期大部分脱落；
枝条从上端向下枯死，最后全株死亡；病树次年春
季提前开花，花小畸形，果实萎缩，果质不佳。
2 3 4
图 l沙田柚病叶症状 (1-3为病叶，4为健康叶)
Fig．1 Disease symptom in leaves of’Shatianyoupommelo
(1-3，diseased leaves；4．healthyleaf)
2．2电镜观察
在透射电镜下观察沙田柚斑驳叶片的切片，前
后 4次采集的样本均可以观察到类似的病原体。病
原体多数呈圆形或椭圆形，少数呈不规则形，大小
在 50-600Ril×100-1 000Ril之间。其外围的单位
膜是由三层膜构成的，内外层的电子密度较浓，而
中间层的电子密度较稀，厚度约在 20 Ril左右 (图
2A，B)。内部含有似核糖蛋白体质粒及脱氧核糖核
酸线粒体的结构(图 2A)。箭头所示病原体正处于二
分裂状态(图 2B)。这种病原体在形态、大小及构造
上均与以前报道的柑桔和蜜柚的黄龙病病原—类
细菌(BLO)基本相 。健康样本的电镜切片均未
观察到类似的病原类细菌。
2．3 PCR检测
我们采用 PCR技术成功地从感病的沙田柚叶
片样本中检测到带有黄龙病病原体 DNA的 PCR
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第 1期 董高峰等：沙田柚黄龙病病原体的电镜观察与 PCR检测 9
产物，与作为正对照的已感染柑桔黄龙病的甜橙样
本的DNAPCR产物具有相同的分子量，均为400bp，
而作为负对照的健康桠柑实生苗样本均表现阴性
反应。上述结果表明：叶片表现典型斑驳症状的沙
田柚以及作为正对照的甜橙样本都能检测到黄龙
病病原体，而在作为负对照的健康桠柑实生苗样本
中则无法检测出黄龙病病原体 (图 3)。
I5l7bp—
l0aObp一
500b口一
300bp一
,-40(~p
图 3 PCR检测沙田柚黄龙病病原体
图2沙田柚病树叶脉韧皮部薄壁细胞内的病原体 g‘。 gen
(A：20000倍；B：10000倍，箭头示病原体处于二分裂状态) I
． 100bpDNAladder分子量标准物 100bpDNAladdcrmslggl-：2．健
Fig、2’S~ youpommelospathogen in par~chymacelofvein 康桠柑实生苗 Samplefromhealthy seedling ofPonkonmandarin； 3．
phloemofdiseasodl∞￡arowinB~owingbinaryfission 检测沙田柚 ’Shatianyou’pommeloa~mple；4 表现典型黄龙病症状的
×20ooo；B。×10000) 孳 瞅．帆哼 湖 。exp懈 g typical sy呷岫 。f
3 讨论
关于柑桔黄龙病病原体，以前有很多争论，现在
一 般认为是一种类细菌，以木虱作为传播媒介 91。
目前又有人提出该病原是一种细菌，称为韧皮部杆
菌 (Liberobacter asiaticum) 习。我们根据所观察的
沙田柚病原体形态结构，仍将其归为类细菌。
应用 PCR技术对柑桔黄龙病病原体的 DNA
进行体外扩增，可以准确、有效地检测出黄龙病病
原体。由于 PCR扩增的引物 P-和 P2是根据柑桔黄
龙病病原体亚洲株系 h-2．6的 DNA序列设计的，
对该病原体具有特异性，因此在供检测的样本中，
只有感染了柑桔黄龙病病原体的样本才能扩增出
特异性的电泳谱带。由此也进一步证明我们检测的
沙田柚病株带有柑桔黄龙病病原体。另外，由于通
过 pCR技术可以扩增获得大量的病原体 DNA，因
此对于那些 已感染了柑桔黄龙病病原体但因量少
还未显症状的柑桔样本，仍可以利用 PCR检测出
来，这点是血清法所无法比拟的嘲。
综上所述，电镜观察和 PCR技术均证明沙 田柚
的典型 ‘斑驳’症状是由柑桔黄龙病病原体侵染所
导致的，这对于我们今后有计划地开展沙田柚无毒
苗木的选育和病害的早期防治具有重要的意义。此
外，电镜观察和 PCR技术还可以运用到其它果树病
原体类病害的早期检测中去，在及时控制病害的蔓
延、提高水果的产量和质量方面发挥必要的作用。
致谢 本实验承蒙华南农业大学植物病理室邓晓
铃老师帮助做了大量的工作，在此表示衷心感谢。
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