全 文 ：第 19卷　第 1期
2001年 3月 　　　　　
广西师范大学学报 (自然科学版 )
JOURNAL OF GU ANGXI NO RM AL UN IV ERSITY
　　　　　 Vo l. 19　　 No. 1
March　 2001
收稿日期: 2000-12-25
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39760007)
作者简介: 杨继华 ( 1935— ) ,男 ,广西桂林人 ,广西师范大学教授
沙田柚花柱 S-糖蛋白的纯化和 N-端序列测定
杨继华　饶桂荣　薛妙男
(广西师范大学生物学系 ,广西桂林 541004)
摘　要 :以人工自花授粉 3 d后的沙田柚 (Citrus grandis var. Shatinyu Hort. )花柱为材料 ,切取 1 /2部位处花
柱组织 ,匀浆后 ,进行抽提和硫酸铵盐析 ,得到 35%级分的蛋白质粗提液 ,此液经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ,
显示出 9条蛋白质带 ;经 Con A-Sepha ro se 4B亲和柱层析 ,特异峰 ( S# )仅显示 1条蛋白质带 ,恰好是 35%级
分中近正极端的 2种蛋白质中的一种最优势蛋白质 ;部分生化性质测定结果表明 ,该蛋白质为碱性糖蛋白 ,糖
含量为 9. 2% ,由 2个亚基组成 ,相对分子质量分别为 38. 0 ku, 32. 0 ku,等电点分别约为 7. 5, 7. 2;生物活性
测定结果表明 ,该蛋白质能抑制离体 ( in vit ro )萌发自花花粉花粉管的生长 ;氨基酸序列分析表明 , 32. 0 ku组
分 N-端 15个氨基酸序列与矮牵牛 ,花烟草等的 N-端相应序列极相似 .
关键词: 沙田柚 ;花柱 S-糖蛋白 ;亲和层析 ; N-端氨基酸序列
分类号: Q513. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001 -6600( 2001) 01 -0072 -08
近年来 ,对高等植物自交不亲和性研究已成为植物生殖生物学和植物分子生物学研究的一个热点 .
目前普遍认为 ,自交不亲和性在遗传上是受具复等位基因的 S-位点 ( S-Locus)控制 ,由 S基因编码的决
定植物自交不亲和性的关键功能性蛋白质就是 S-位点特异糖蛋白 ,即 SLSG.不亲和性就是由花粉 (管 )
的识别物质 (因子 )和雌蕊组织 (柱头和花柱 )的 SLSG发生相互识别、拒绝或排斥反应 ,即是一种分子行
为 .至今 ,对这种分子行为的合理解释尚未完全明朗化 .研究发现 ,花柱的 SLSG是一种优势蛋白质 ,占
花柱总蛋白质的 5% ,主要分布于花柱引导组织的细胞间质中 .目前 ,对于花柱的 SLSG的氨基酸组成、
N-端序列、糖基分析及其基因的 cDN A克隆等研究已有不少报道 [1～ 4 ] ,已经提出了“胞内抑制学说” [ 5]和
“膜受体学说” [6 ]以求解释这种不亲和机制 .
90年代以来 ,杨继华、薛妙男等对沙田柚自交不亲和性的细胞学基础和生化基础进行了一系列较
深入的研究 [7～ 15 ] .在此基础上 ,作者进一步采用亲和层析和电泳相结合的方法 ,分离纯化沙田柚花柱特
异糖蛋白 ,并对其生物活性及生化性质进行了全面研究 .
1　材料与试剂
1. 1　材料
广西柑桔研究所 (桂林市 ) 10～ 15年生酸砧沙田柚结果树自花授粉 3 d后的花柱 .
1. 2　主要试剂
ConA-Sepha ro se 4B( Pha rmacia公司 ) ;α-Methyl-D-Mannopy ranoside, Bis ( Fluka公司 ) ; PM SF,
PV P, DT T, Urea , Tris, Cads,甘氨酸 (均为进口分装 ) ; PV DF膜 ( Bio-RAD);等等 .
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2001. 01. 016
2　实验方法
2. 1　蛋白质的提取
取自花授粉 3 d后距柱头端约 1 /2处的新鲜花柱为材料 ,称重 ,并按质量体积比 1∶ 5加入
0. 1 mol /L Tris-HCl缓冲液 ( pH7. 8,含 10 mmol /L NaCl , 10 mmo l /L EDT A-2Na, 1 mmol /L CaCl2 ,
1 mmo l /L DT T, 1 mmol /L PM SF, 1 mmol /L PV P) ,参照 Broo thaerts[1 ]等和 Jahnen等 [2 ]方法 (有改
动 ) ,加入少许石英砂 ,冰浴中充分研磨成匀浆 ,于 4°C抽提 30 min,冰冻离心 ( 0°C, 12 000 r /min,
15 min ) ,上清液按 0. 209 g /mL室温下加入固体 ( N H4 ) 2 SO4至 35%饱和度 ,于 4°C静置过夜 ,次日于
同样条件下冰冻离心 ,弃去上清液 ,沉淀部分用缓冲液 ( 0. 05 mo l /L Tris-HCl, 0. 15 mol /L NaCl,
pH7. 8)溶解 ,用 ddH2O透析去盐 ,聚乙二醇浓缩后 ,于离心管分装 ,置- 20°C下备用 .
2. 2　蛋白质含量的测定
按 Bradfo rd法进行 ,取 5 m L显色液 (含 0. 01% G-250, 5%的 95%乙醇 , 10%的 85% H3 PO4 )和
0. 1 mL蛋白质液混合 , 2 min后于 7230型分光光度计 595 nm处比色 ,测 OD值 ,用 BSA做标准曲线 .
2. 3　亲和层析法纯化 S-糖蛋白 [16, 17 ]
将 35%级分的蛋白质粗品用 ConA-Sepharose 4B亲和柱层析 ,柱长为 20. 0 cm,直径为 1. 0 cm.上
样前 ,用洗脱缓冲液 ( 0. 05 mo l /L Tris-HCl, 0. 15 mol /L NaCl , pH7. 8)平衡至少 2 h或过夜 .上样量为
2 mL(约 1. 620 mg) ,先用相同的缓冲液洗去未亲和 (吸附 )上的蛋白质 ,待缓冲液流洗至核酸蛋白检测
仪上 A280 < 0. 02时 ,换用含 0. 2 mol /L α-D-葡萄糖和 0. 2 mo l /L α-甲基 -D-甘露糖苷的同种缓冲液进
行梯度洗脱 ,流速为 10 mL /h,收集特异峰 ( S# ) ,用聚乙二醇浓缩 10倍 ,去盐去糖 ,于 - 20°C下保存备
用 .
2. 4　聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用平板装置 ,不连续系统 ,凝胶大小为 13 cm× 11 cm× 0. 1 cm ,分离胶浓度 10% ,浓缩胶浓度
4% ,电极缓冲液为 Tris-Gly( pH8. 3) ,稳流 20 m A,当指示剂距末端 1 cm处停止电泳 .
PAGE电泳胶板用考马斯兰 G-250染色 (含 0. 01% G-250, 5%的 95%乙醇 , 10%的 85% H3 PO4 ) ;
糖蛋白采用 Alcian blue染色 ( 12. 5%三氯乙酸 ,固定 30 min; 1%过碘酸钠 ,氧化 60 min; 0. 5%偏重亚硫
酸 ,还原 30 min; 0. 5% Alcian blue染色 4 h ) ; SDS-PAGE电泳胶板用考马斯兰 R-250染色 (染色液:
1% R-250, 7%冰乙酸 , 50%甲醇 ;脱色液: 7%冰乙酸 , 20%甲醇 , 1. 5%甘油 )
2. 5　 S-糖蛋白的部分生化性质的测定
2. 5. 1　糖含量的测定
采用苯酚 -硫酸法进行 ,取 2 m L样品液 ,加苯酚试液 1 mL,摇匀 ,迅速加入浓硫酸 5 m L,静置
5 min,置沸水浴中加热 15 min,冷至室温 ,于 490 nm处测吸光度 .以葡萄糖做标准曲线 .
2. 5. 2　蛋白质相对分子质量的测定
采用 SDS-PAGE不连续系统 ,分离胶 12% ,浓缩胶 4% ,用考马斯亮兰 R-250染色 .已知蛋白质的
相对分子质量对数与其迁移率成反比 ,以各标准蛋白质的迁移率为自变量 ,相对分子质量对数为因变量
作标准曲线 ,测出未知蛋白质的迁移率 ,根据标准方程就可求出其相对分子质量 .
标准蛋白质相对分子质量范围为 14. 4～ 97. 4 ku,由 6种蛋白质组成:兔磷酸化酶 B( 97. 4 ku) ,牛
血清白蛋白 ( 66. 2 ku) ,兔肌动蛋白 ( 43. 0 ku) ,牛碳酸酐酶 ( 31. 0 ku) ,胰蛋白酶抑制剂 ( 20. 1 ku) ,鸡蛋
清溶菌酶 ( 14. 4 ku) (上海丽珠东方产品 ) .
2. 5. 3　蛋白质等电点的测定
参照 Vesterberg和何忠效等方法进行 .两性电解质 Ampho line的 pH范围为 3. 5— 10,先进行预电
泳 ,恒压 200 V 15 min, 300 V 15 min, 400 V 30 min,更换电极液后 ,加样电泳 ,恒压 450 V 8 h,
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800 V 1 h后结束 ,染色 ,拍照 ,用精密 pH计测定胶的 pH梯度 ,并作 pH梯度曲线 .
2. 6　 S-糖蛋白的生物学活性鉴定及核酸酶活性测定 [10, 18 ]
采集新鲜花粉进行离体萌发 ,培养基为 BK S-15溶液 ( 15%蔗糖 , 0. 01%硝酸钾 , 0. 02%硫酸镁 ,
0. 01%硼酸 , 0. 003%硝酸钙 , 0. 025 g /L氯霉素 , 0. 1%明胶 , pH5. 6) ,分别加入 50μL和 100μL(约
42μg, 84μg )特异峰 ( S# )浓缩液 ,进行 2组实验 ,同时进行对照组实验 ,于培养箱 30°C恒温培养 8 h,
取出镜检并计数 .
以酵母 RNA为底物 ,用高氯酸沉淀蛋白质法进行 ,反应缓冲液为 0. 1 mo l /L咪唑 -HCl( pH7. 5)
和 0. 01 mol /L KCl在 37°C水浴中保温 30 min,在波长 260 nm下测其 A值 .定义: 一个酶单位为在
37°C, pH7. 5,波长 260 nm的条件下 ,使 A值增大 1. 0所需的酶量 .
2. 7　 S-糖蛋白的 PVDF(聚乙烯叉二氟 )膜印迹和 N-端序列测定
参考 Matsudai ra[19 ]的方法 ,用北京六一厂电转移装置进行: ( 1)切取所需 SDS-PAGE胶 ,浸入
CAPS(环己胺丙磺酸 )缓冲液 ( 10 mmol /L CAPS( pH11) , 10%甲醇 )约 5 min,以除去 Tris和甘氨酸 .
同时 ,将 PV DF膜浸入 100%甲醇约 10 s,再浸入 CAPS缓冲液 .另外将转膜用海绵、滤纸也浸入另一容
器内的 CAPS缓冲液 ; ( 2)安装转膜装置 , 150 mA恒流 1. 5 h; ( 3)取出 PV DF膜 ,以 ddH2O淋洗后 ,浸
入 100%甲醇约 10 s; ( 4)染色 ( 0. 1% R-250, 1%乙醇 , 40%甲醇 ) 1～ 2 min,重复脱色 3次 ; ( 5)用
ddH2O淋洗后 ,置于干净滤纸上晾干 ;切取目的斑点 ,由氨基酸序列分析仪测定 N-端序列 .
3　实验结果
3. 1　 S-糖蛋白的分离纯化及部分生化性质
3. 1. 1　分离纯化
实验结果表明 ,花柱粗提液 35%级分蛋白质经 PAGE检测 ,共有 9条蛋白质带 ,其中靠近正极端的
2种蛋白质占优势 ,含量相对较多 (图 1a) ,糖蛋白染色只显示这 2条蛋白质带 (图 2a ) ,经 ConA-
Sepharose 4B柱层析后的特异峰 ( S# ) ,检测出只有 1条糖蛋白带 (图 3) ,正好是 35%级分中的最优势蛋
白质 (图 1b, 2b) .
图 1　花柱蛋白质的 PAGE图谱　　　　　　　　　　　　　　　图 2　花柱糖蛋白的 PAGE图谱
a.沙×沙 35%级分蛋白质染色 a.沙×沙 35%级分糖蛋白染色
b.特异峰 S# 蛋白质染色 b.特异峰 S# 糖蛋白染色
74 　　　　　　　　　　　　　　　广西师范大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷
图 3　沙×沙 35%级分蛋白质过
Con A-Sepha ro se 4B柱层析图谱
3. 1. 2　糖含量及糖基分析
用苯酚-硫酸法测得 S-糖蛋白的糖含量为
9. 2% ,由于 S-糖蛋白是经过 ConA-Sepharo se 4B
柱层析后通过解吸附得到的 ,而 ConA能与α-D-葡
萄糖和α-甲基-D-甘露糖苷特异结合 ,因此 ,凡是含
有这 2种糖基的蛋白质经过 ConA亲和柱时均能与
ConA结合 ,由此可知 ,所纯化的花柱 S-糖蛋白的糖
基为葡萄糖和甘露糖的单一组分 .
3. 1. 3　相对分子质量
S-糖蛋白经 SDS-PAGE电泳后 ,显示 2条蛋白
质带 (如图 4) ,相对分子质量分别为 38. 0 ku,
32. 0 ku,表明由 2个亚基组成 .
3. 1. 4　等电点
聚焦电泳结果表明 S-糖蛋白为碱性蛋白质 ,亚
基Ⅰ ( 38. 0 ku)的 pI为 7. 5,亚基Ⅱ ( 32. 0 ku)的 pI
为 7. 2,如图 5.
图 4　 S-糖蛋白的 SDS-PAGE图谱及模式图　　　　　　　　图 5　 S-糖蛋白的 IEF-PAGE图谱及模式图
3. 2　 S-糖蛋白的生物活性及核酸酶活性测定结果
所进行的 3组实验中 (图 6) ,对照组花粉萌发良好 ,花粉管生长呈现集体效应 ,而实验Ⅰ 组 (加
50μL S-糖蛋白 )的花粉能够萌发 ,但花粉管的长度明显较短 ,而实验Ⅱ组 (加 100μL S-糖蛋白 )的花粉
管更短 ,以出芽形式出现后停止生长 .由此看来 ,加入的花柱 S-糖蛋白的量越多 ,花粉管生长的抑制程
度就越强 ;但所有实验组与对照组花粉的萌芽率几乎相等 (约为 56% ) ,表明加入的花柱糖蛋白不抑制
花粉的萌发而抑制花粉管的生长 .
核酸酶活性测定结果表明 ,花柱 S-糖蛋白显示很高的核酸酶活性 ,能强烈降解酵母菌 RNA,酶活
为 118 U /mg.
3. 3　 S-糖蛋白的 N-端氨基酸序列测定
前述 S-糖蛋白在 SDS-PAGE图谱上显示 2条蛋白质带相对分子质量分别为 38. 0 ku, 32. 0 ku,经
PVDF膜印迹和 R-250染色 ,亦显现出同样的 2条蛋白质带 .我们选切了 32. 0 ku蛋白质带用于 N-端
75第 1期　　　　　　　　　　 杨继华等:沙田柚花柱 S-糖蛋白的纯化和 N-端序列测定　　　　　　　　　　
15个氨基酸序列测定 ,所得结果是: AFEYMQLV LQWPASF.与相关资料 [2, 3 ]提供的测序结果进行比
较 ,该序列与矮牵牛 (P . hybrida ) 33. 0 ku,花烟草 ( N . alata ) 32. 0 ku,秘鲁番茄 28. 0 ku等的糖蛋白极
为相似 (图 7) .
a　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 b
　 c
　　　图 6　不同剂量花柱 S-糖蛋白对离体花粉萌发的影响
　　　 a.正常萌发花粉 (× 400) ;
b.加 50μL S# 的萌发花粉 (× 400) ;
c.加 100μL S# 的萌发花粉 (× 400)
沙田柚花柱糖蛋白 32. 0 ku
矮牵牛 (P . hybrida )糖蛋白 33. 0 ku
花烟草 (N . alata )糖蛋白 32. 0 ku
秘鲁番茄 ( L . peruv ianum )糖蛋白 28. 0 ku
1
A
P
A
Y
F E Y
F E Y
F E Y
F E Y
5
M
M
M
L
Q L V L
Q L V L
Q L V L
Q L V L
10
Q
T
T
Q
W
W
W
X
P
P
P
P
A S
P A
I T
T T
15
F
F
F
F
图 7　沙田柚花柱与其他植物糖蛋白氨基酸序列的比较
4　讨论
4. 1　 ConA-Sepharose 4B柱亲和层析纯化沙田柚花柱 S-糖蛋白的方法分析
纯化蛋白质的常用方法主要有超滤、凝胶过滤、纤维素层析、亲和层析、电泳等 ,一般采用其中的一
种或几种的有机结合 ,尤其是亲和层析及 HPLC的应用最为广泛 .已有不少文献报道了控制植物自交
76 　　　　　　　　　　　　　　　广西师范大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷
不亲和性的 S-特异糖蛋白 ( SLSG)的分离纯化方法 [1, 2 ] ,所纯化的 S-蛋白几乎均为糖蛋白 ,相对分子质
量为 20～ 40 ku之间 ,等电点为 6. 0～ 10. 0之间 . Nishis和 Hinata等 [20 ]研究发现 SLSG有与 ConA相
结合的特性 .有实验证明南瓜柱头表面经 ConA处理后 ,自花花粉不能萌发 ,或花粉管生长受阻 [21 ] .根
据以上资料 ,结合本实验室的实验条件及实验目的 ,作者选用了 ConA-Sepha ro se 4B(以琼脂糖凝胶
Sepharose 4B为载体 ,耦联伴刀豆球蛋白 A即 Concanava lin A,并制成固相化 )亲和柱 ,由于 ConA能特
异结合α-甲基 -D-甘露糖苷和 α-D-葡萄糖 ,因此 ,凡含有上述糖基的 S-蛋白就能与 ConA Sepharose柱
发生亲和吸附 ,而不能形成特异结合的杂质则流出 ,然后再用含有葡萄糖或甲基糖苷的缓冲液洗脱 ,释
放出被吸附的 S-蛋白 .前已述及 ,本实验所提取的花柱 35%级分粗蛋白质 ,共有 9条蛋白质带 ,蛋白质
种类相对较少 ,糖蛋白染色只显示近正极端的 2条带 ,这说明只有 2种糖蛋白 ,过 ConA-Sepha rose 4B
柱时 ,含有与 ConA特异结合的糖基则被分离纯化出来 .实验结果表明 ,花柱 35%级分粗蛋白质中只有
一种糖蛋白被吸附上 ,它含有α-D-甘露糖苷和 α-D-葡萄糖 ,也暗示了它是沙田柚花柱 S-特异糖蛋白的
极大可能性 .用 ConA-Sepha ro se 4B亲和柱从 9种蛋白质中纯化出一种特异的糖蛋白 ,是该方法在本实
验中表现的极大优点所在 ,也是实验得以继续的前提 .
4. 2　沙田柚花柱 S-糖蛋白在沙田柚自交不亲和反应中的作用机制初探
前已述及 ,目前所纯化的控制植物自交不亲和反应的花柱 S-蛋白几乎均为糖蛋白 ,相对分子质量
约为 20～ 40 ku不等 ,等电点为 6. 0～ 10. 0之间 .这似乎暗示了 SLSG这一生化特性的普遍性 .而我们
所纯化的花柱 S-糖蛋白由 2个亚基组成 ,相对分子质量分别为 38. 0 ku, 32. 0 ku,等电点分别为 7. 5和
7. 2,与现有资料报道的 S-蛋白的生化性质极为吻合 .
为了弄清自交不亲和反应的机理 ,最重要的是知道 S-蛋白的生物学作用 ,不少资料报道的结果表
明了它的作用具有普遍性 .对不亲和玉米 [22 ]的研究表明 ,离体培养条件下 ,花柱的 S-糖蛋白能抑制其同
源花粉管的生长 ,但却不影响萌发 ;在矮牵牛 ,花烟草和罂粟属 [23～ 25]等自交不亲和性植物材料中也观察
到此现象 .在活体植物上 ,自花授粉的花粉管生长的抑制作用是发生在花粉管生长到一定长度、特定时
期或授粉后某一时期 [7, 13, 26 ] .李润植等 [27 ]在对粉蓝烟草的研究中发现 ,具有核酸酶活性的 S-糖蛋白在一
定的范围内随着剂量的增加 ,花粉管生长的抑制效应加强 .本实验结果表明 ,所提纯的沙田柚花柱 S-糖
蛋白具有核酸酶活性 ,酶活为 118. 3 U /mg;在离体条件下 ,能抑制自花花粉管的生长 ,但不影响萌发 ;
加入 50μL和 100μL的 S-糖蛋白液效果明显不同 ,说明加入的 S-糖蛋白的量越多 ,抑制作用越显著 ,
这一结果与前人的研究趋向一致 .在沙田柚活体植物中 ,自花授粉后 3 d观察到花粉管生长到花柱 1 /2
左右处 (本实验的实验材料 )受阻从而停止生长 ,不能到达子房进行受精 [7, 13 ] ,这充分说明 ,我们所纯化
的花柱 S-糖蛋白是由花柱传导组织分泌产生 ,在花柱自花授粉 3 d后 , S-糖蛋白被大量表达并进入细胞
间隙的粘液基质中 ,而萌发后的花粉管就在此基质中向前生长 ,自交花粉管 (壁 )可能有一特殊物质 (受
体 ) ,能和 S-糖蛋白特异地相互识别 ,使得花柱 S-糖蛋白能特异进入管内发挥核酸酶的作用 ,降解管内
的 rRN A,使管内的蛋白质合成受阻 ,最终导致花粉管的生长停止 .但值得疑问的是:花柱 S-糖蛋白怎样
和自交花粉管 (壁 )上的识别因子 (受体 )相互识别的呢?这种受体又是什么?是否也是由 S-基因表达?它
的一系列生化性质又怎样?这将成为我们今后的研究重点 .可见 ,若能分离鉴定出花粉 (管 )的识别因子 ,
对于阐明配子体自交不亲和的分子机理将起到重要的作用 .
糖被喻为细胞表面的化学天线 ,在生物体内的最主要作用是识别和通讯 .实验表明 ,糖之所以能在
识别中起重要作用 ,主要是以其多糖链有惊人数目的异构体糖形为基础 .在动物受精识别中 ,糖蛋白的
糖链在识别中的作用研究较多 ,如精卵结合、海胆精卵识别等 ;在植物受精识别中 ,糖蛋白的糖链的作用
有待进一步研究 . Sharma[ 28]等在对 P. hybrida的自交不亲和研究中 ,发现花柱的 S-糖蛋白的识别反应
与其糖链有关 ,用凝集素封闭糖链可使其识别自体花粉的能力下降甚至完全丧失 .又有实验表明 , S-糖
蛋白上的糖链结构本身可能与自交不亲和性反应的特异性无关 ,即在花粉与雌蕊的识别过程中不起作
用 .但可肯定的是 , S-糖蛋白上的聚糖链在该蛋白质的一级结构上的相对位置对自交不亲和性的特异性
77第 1期　　　　　　　　　　 杨继华等:沙田柚花柱 S-糖蛋白的纯化和 N-端序列测定　　　　　　　　　　
将会产生一定影响 ,对于沙田柚花柱 S-糖蛋白糖含量仅为 9. 2% ,并含有葡萄糖和甘露糖基 ,其糖链在
识别反应中是否起何作用? 去糖链后的 S-蛋白是否具有生物活性? 无疑是令人感兴趣的课题 .
4. 3　沙田柚 S-糖蛋白的 N-端氨基酸序列测定
我们选切了经 PV DF膜印迹和 R-250染色的 32. 0 ku蛋白质带 ,用于 N-端 15个氨基酸序列测定 ,
所得结果与矮牵牛 33. 0 ku,花烟草 32. 0 ku,秘鲁番茄 28. 0 ku等糖蛋白相比较 [1, 3 ] , 15个氨基酸中有 9
个完全相同 ,具有同源性 ,这是它们在自交不亲和中的识别功能所共有的保守序列 .
参　考　文　献
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PU RIFICAT ION AND AM INO-TERM IN AL SEQU ENCIN G OF STY LE
S-GLYCO PRO TEIN S IN CI TRUS GRANDI S V AR. S HA T IN YU HORT.
YANG Ji-hua　 RAO Gui-rong　 XUE Miao-nan
( Depa rtment o f Biolog y, Guangx i No rmal Univ ersity, Guilin 541004 China )
Abstract: Styles of Citrus grandis var. shat inyu Hort. w ere chosen as experimental ma terial, which g rew
in only th ree days th rough arti fical po llination of their ow n. About 1 /2 style ti ssue w as cut , and tri tu-
ra ted as homogenei ty. 35% pro tenin so lution w as gained by use o f abst raction and salting out. The so-
lution show ed nine pro tein brands through PAGE. The so lution showed only one protein brand ( S
#
peak ) through ConA-Sepharo se 4B af fini tiv e ch romatog raphy co lumn which w as one of the two excep-
tional puo teins. The experiments w as done in o rder to determine the S# peak pro tein s pa rt biochemi-
cal natures. The results a re: S
#
peak protein w as basic g lycopro tein, suga r accounting fo r 9. 2% , and i t
w as made up of two subunits through SDS-PAGE, who se mo lecula r w eigh t w as 38. 0 ku, 32. 0 ku and
iso-elect ric point 7. 5, 7. 2. The search in protein seguence database reveals that the amino-terminal se-
quence of this 32. 0 ku gly copoly peptide is simi lar wi th that of P . hybrida , N . alata, and L . peru-
v ianum. In addi tion, S
#
peak pro tein s biochemical activ ity w as experimented. S
#
protein could restrain
the g row th of pollen tubes which germina ted in vi t ro.
Key words: Citrus grandis va r. shatinyu Hort. ; sty le S-glycopro tein; affinitiv e chromatog raphy; amino-
terminal sequence
(责任编辑　马殷华 )
79第 1期　　　　　　　　　　 杨继华等:沙田柚花柱 S-糖蛋白的纯化和 N-端序列测定