全 文 ：热带亚热带植物学报　2015， 23(5)： 511 ~ 517
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2015–01–19　　　　接受日期： 2015–04–27
基金项目： 国家自然科学基金项目-中国特产濒危蕨类水韭科植物生殖生物学研究(31170294)资助
作者简介： 沈玮(1990~ )，男，硕士研究生，主要从事植物生殖生物学研究。E-mail: 1150267996@qq.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: 99bd@163.com
云贵水韭雌配子体发育及其濒危机制的研究
沈玮1，谭桂娟2，刘子玥1，路靖1，刘保东1*
(1. 哈尔滨师范大学，黑龙江省普通高等学校植物生物学重点实验室，哈尔滨 150025；2. 北京吉鼎立达生物科技有限公司，北京 101105))
摘要： 为了解云贵水韭(Isoetes yunguiensis)的生殖过程和濒危原因，采用人工培养获得其雌配子体，用半薄切片法观察雌配子
体发育过程。结果表明，云贵水韭的大孢子萌发率约为 26%；雌配子体异养，终生都在大孢子细胞壁内发育；颈卵器发育只有 2
枚颈沟细胞而无腹沟细胞。雌配子体发育停止在游离核时期、颈壁细胞数量偏少或排列紊乱、颈沟细胞异常、卵细胞凋亡等可
能是导致生殖濒危的原因。同时，游离核是水韭生殖生物学研究和系统学研究的重要环节之一；缺失腹沟细胞可能是水韭类简
化性进化的特征之一。
关键词： 云贵水韭；雌配子体；颈卵器；濒危
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.05.005
Female Gametophyte Development and Endangered Mechanism
Research in Isoetes yunguiensis
SHEN Wei1, TAN Gui-juan2, LIU Zi-yue1, LU Jing1, LIU Bao-dong1*
(1. Harbin Normal University, Key Laboratory of Plant Biology, College of Heilongjiang Province, Harbin 150025, China; 2. Beijing Jidinglida
Biological Technology Co., LTD, Beijing 101105, China)
Abstract: In order to understand the reproductive process and endangered reason of Isoetes yunguiensis, its
female gametophytes were obtained by artificial culture, the development of female gametophyte was observed
by using semithin section technology. The results showed that the germination rate of megaspore was 26%. The
female gametophyte was heterotrophic, and developed in megaspore wall throughout its lifetime. There were only
two neck canal cells and no ventral canal cell in archegonium development of I. yunguiensis. The main reasons led
to reproductive endanger could be female gametophyte development stop in free nuclear stage, less neck wall cell
or arranged disorders, neck canal cell abnormal, apoptosis of egg, and so on. Meanwhile, free nuclear is one of
important steps in reproductive biology and systematics study of Isoetes. The missing ventral canal cell might be a
characteristic of simplicity evolution of Isoetes.
Key words: Isoetes yunguiensis; Female gametophyte; Archegonium; Endangered
水韭科(Isoetaceae)为石松类原始维管植物，具
有独特的系统演化地位，是植物界较为孤立的类
群，起源或分布中心尚不明确[1]，全世界约有 200
种，少量而零散地分布在北半球的热带亚热带地
区，多为水生或半水生，对原生环境较为依赖，是
研究古生态及物种演化的活化石[2]。我国产 5 种，
其中云贵水韭(Isoetes yunguiensis)是云贵高原特有
种，仅少量分布在云南昆明及贵州平坝的狭窄山沟
或浅沼地带[3]。长期以来，云贵水韭被误判为宽叶
水韭(I. japonica)，2002 年王青锋等依据其孢子形
512 第23卷热带亚热带植物学报
态、染色体数目等主要特征，将其作为新种发表[4]。
云贵水韭的野生种群呈间断式分布，数量急剧减
少、濒临灭绝，被列为国家一级重点保护物种[5–6]。
目前对水韭属植物的研究多集中在生态习
性[7]、种类鉴定[8]、形态结构[9]、细胞遗传[10–11]、生理
生化[12]等方面，其叶舌结构[13]和孢粉学[14]一直是
研究重点。相对而言，水韭属的生殖研究较少，
Motte[15]对 I. lithophila的孢子萌发率等进行了研究；
刘虹报道了中华水韭(I. sinensis)孢子的无菌培养和
温度对大孢子萌发率的影响[16]；路靖报道了中华水
韭雌配子体及胚胎的发育，对云贵水韭的雌性特征
进行了一般性描述[17–18]。对雌配子体发育的特征
性结构，即游离核、生殖辅助细胞的来源和分化、颈
沟细胞的形态结构和位移等对卵受精的影响等尚
无细致观察，在有性生殖的结构性障碍和生理性障
碍方面缺乏深入研究。Huang 等[19]曾报道台湾水
韭(I. taiwanensis)雌配子体表面的颈卵器数量不等；
Cochran[20]对水韭的精子进行了超微观察。Nayar[21]
和吴兆洪[22]都指出配子体与胚胎可以为蕨类植物
分类提供重要依据，认为生殖结构不仅决定了生殖
功能的强弱，而且具有稳定的系统学意义。云贵
水韭由于种群数量很少，极难获得有性世代的活材
料[11]，本文用半薄切片法深入细致地研究了云贵水
韭雌配子体尤其是颈卵器的发育规律，为揭示云贵
水韭的生殖规律和生殖濒危原因，以及科学预测其
濒危趋势提供理论依据和技术支撑。
1 材料和方法
云贵水韭(Isoetes yunguiensis)由中国科学院昆
明植物研究所成晓研究员于 2011 年 9 月提供，原
产地为贵州省平坝，凭证标本保存在哈尔滨师范大
学植物标本室(HANU)。
按照路靖[18]的培养方法，大孢子经 5% NaClO
溶 液 消 毒 8 min 并 充 分 水 洗 后，接 种 在 改 良 的
Knop’s 培养基上，改良之处是所用溶剂为原产地
土壤浸出液(蒸馏水与土壤质量比为 4∶1)。定期在
显微镜下观察大孢子的萌发率，将不同发育阶段的
雌配子体在倒置显微镜下精确剥离大孢子壁后，用
FAA 固定液固定，常规半薄切片法切片并用甲苯胺
蓝染色，用 Olympus-BX53F 显微成像系统观察并
照相。
2 结果和分析
2.1 雌性发育的基本特征
云贵水韭大孢子近圆球形，萌发率为 26%，大
孢子的纵切面(图 1: 1)可见其细胞质均匀，三裂缝
明显，孢子壁分 3 层，其中周壁和外壁结合紧密，厚
度达 10~20 μm，内壁较薄；大孢子培养 7~10 d 后吸
涨萌发 (图 1: 2)，原生质均匀，且含有大量的颗粒状
营养物质，在内壁和中壁之间形成宽约 30 μm 的空
腔；孢子培养 30~50 d 雌配子体多数发育成熟(图 1:
3)，由大量的富含营养物质的薄壁细胞组成，雌配
子体的绝大部分都被大孢子壁包裹，只是沿大孢子
的三裂缝开裂处稍有隆起，并在隆起的顶端分化有
颈卵器，每个雌配子体能先后产生 6~14 个颈卵器。
雌配子体终生没有同化功能，一旦大孢子所储存的
营养物质消耗殆尽，雌配子体也会随之枯萎。
颈卵器(图 1: 4) 由雌配子体的表皮细胞分化而
来，分为颈部和腹部两部分，颈部由 16 个细胞以每
层 4 个共 4 层围成具有颈沟的颈壁，颈沟狭窄；幼
嫩的颈卵器腹部无腹壁细胞，近底部只有一枚半球
形或更扁平的卵细胞以及上方的两枚呈圆片状的
颈沟细胞，卵细胞核明显，核周围有较大的质地透
明的椭球形区域。
云贵水韭的颈卵器由幼嫩(图 1: 5)到成熟(图 1:
12)，大约需要 10~20 d。其间，卵细胞一直位于颈卵
器腹部最下方，随着颈卵器的发育，其厚度不断增
大，上缘周边向上突起，逐渐形成厚底圆盘状(图 1:
6, 7, 9~11)，底部也向侧下方产生隆起(图 1: 12)；两
枚颈沟细胞在颈卵器成熟过程中的形态和位置变
化明显：首先第一颈沟细胞向上提升，并在正上方
形成钝刺状突起，突起的尖端伸向颈沟(图 1: 5~7)，
但颈沟直径基本保持不变(图 1: 8)；第二颈沟细胞
始终紧贴卵细胞的凹陷面并随之下陷(图 1: 5~7,
9~11)；两个颈沟细胞随着间距的加大，都向外分泌
粘液状物质(图 1: 10~12)，颈卵器的腹壁逐渐明显，
腹壁细胞由雌配子体营养细胞直接演化而来。
颈卵器成熟后，两枚颈沟细胞几乎同时解体，
卵细胞由厚底圆盘状(图 1: 13) 膨胀成近球状(图 1:
14)，体积迅速增大的同时，先是细胞核周围出现
较大的透明区域(图 1: 15)，随着卵细胞胞质变浓，
透明区域逐渐减少(图 1: 16)。颈卵器发育过程如
图 2。
第5期 513沈玮等：云贵水韭雌配子体发育及其濒危机制的研究
图 1 云贵水韭雌配子体及其颈卵器的发育。S: 裂缝; Ep: 外壁; M: 中壁; P: 原生质; En: 内壁; G: 配子体; Nw: 颈壁细胞; N1: 第一颈沟细胞; N2:
第二颈沟细胞; Nu: 细胞核; E: 卵。1: 大孢子纵切面; 2: 雌配子体发育初期; 3: 成熟雌配子体纵切面; 4: 颈卵器纵切，示两个颈沟细胞刚刚分裂; 5:
颈卵器纵切，示颈沟细胞下沉; 6: 颈卵器纵切，示两个颈沟细胞间出现空腔; 7: 颈卵器纵切，示卵细胞上方进一步凹陷; 8: 颈卵器颈部横切; 9: 颈
卵器纵切，示卵细胞体积增加; 10: 颈卵器纵切，示颈沟细胞间充满泡沫状物质; 11: 颈卵器纵切，示颈沟细胞周围泡沫状物质进一步积累; 12: 颈
卵器纵切，示卵细胞底部向一侧延伸，细胞核周围出现浅色区域; 13: 颈卵器纵切，由雌配子体营养细胞特化出的颈卵器腹壁; 14: 颈卵器纵切，示
颈沟细胞凋亡，卵细胞体积加大，胞质染色不均; 15: 卵细胞核周围浅色区域进一步加大; 16: 颈卵器横切，示成熟的卵。
Fig. 1 Development of female gametophyte and archegonium of Isoetes yunguiensis. S: Stomium; Ep: Epispore; M: Mesospore; P: Protoplasm; En:
Endospore; G: Gametophyte; Nw: Neck wall cell; N1: 1st neck canal cell; N2: 2nd neck canal cell; Nu: Nucleu; E: Egg. 1: Vertical section of megaspore;
2: Early stage of female gametophyte; 3: Vertical section of mature female gametophyte; 4: Vertical section of archegonium, two neck canal cells just
dividing; 5: Vertical section of archegonium, neck canal cell sink; 6: Vertical section of archegonium, cavity between two neck canal cells; 7: Vertical
section of archegonium, further sinking above egg; 8: Transverse section of archegonium neck; 9: Vertical section of archegonium, egg volume increase;
10: Vertical section of archegonium, foam was fulled between neck canal cells; 11: Vertical section of archegonium, foam further accumulate around
neck canal cells; 12: Vertical section of archegonium, bottom of egg extend to the side, light area around nucleu; 13: Vertical section of archegonium,
archegonium ventral wall specialized from vegetative cell of female gametophyte; 14: Vertical section of archegonium, neck canal cell apoptosis, egg
volume increase, cytoplasmic uneven dyeing; 15: Light areas around nucleu increase; 16: Transverse section of archegonium, mature egg.
514 第23卷热带亚热带植物学报
2.2 雌性败育现象
雌配子体败育有 3 个方面：一是大孢子败育(不
萌发)率高达 74%；二是部分雌配子体在游离核阶
段就停止了发育，始终不能细胞化(图 3: 1)；三是约
有半数的雌配子体能够分化出颈卵器，但颈卵器腹
部始终不能产生生殖细胞，颈卵器附近的多层营养
细胞的胞质都稀薄透明，营养物质只堆积在雌配子
体深处(图 3: 2)。
颈卵器败育有 4 个方面 : 一是感染败育，颈沟
开口一旦被菌类感染，其生殖细胞多数败育，表现
为生殖细胞胞质稀薄，不能正常分裂(图 3: 3)，腹腔
内细胞破碎化(图 3: 4)甚至全部解体(图 3: 5)；二是
颈壁细胞排列紊乱，颈沟不通，精子无法进入(图 3:
6, 9)；三是 2 个颈沟细胞异常，主要有体积过小(图
3: 6)或过大(图 3: 7~9)，或第一颈沟细胞不向上提
升(图 3: 9, 10)导致第二颈沟细胞产生多个指状突
起(图 3: 9, 12~14)或泡沫化(图 3: 14, 15)；四是卵细
胞体积膨大后胞质稀薄而失去活性(图 3: 11)或体
积不增加(图 3: 12, 13, 15)，即使是颈卵器腹壁已经
充分发育，卵细胞等也可能凋亡(图 3: 16)。上述多
种障碍可能在同一个颈卵器里发生 (图 3: 6, 9, 14,
15)。颈卵器败育的共同特征是卵细胞或颈沟细胞
发育不良(图 3: 3~16)。
3 讨论
卷柏(Selaginella tamariscina)是著名的耐旱植
物，可生长在极端干旱的裸岩缝隙中，在严重缺水
的条件下，其主要的生殖对策是配子体世代演化为
壁内发育，用大孢子细胞壁保护整个有性世代所
必须的水分[23]。云贵水韭尽管与卷柏同属石松类
(Lycophytes)，却是典型的水生植物，雌配子体终生
都在水中发育。既然生殖过程不存在水分限制的
问题，那么云贵水韭壁内发育的生物学意义就无法
解释。孟繁松[24]证实水韭类的祖先曾经长期生长
在古海岸地带，干湿不定甚至是严重干旱。云贵水
韭所在的云贵高原也经历了漫长的海岸抬升，因
此，本研究支持孟繁松的观点。中华水韭的雌性发
育及其结构[17–18]与云贵水韭基本相同，表明二者的
系统演化关系较近。
本研究观察到云贵水韭雌配子体常停留在游
离核时期，因细胞化进程受阻而败育。而油松(Pinus
tabulaeformis)的雌配子体也具有游离核，而且游离
核的形态结构、分裂状态不仅能直接决定配子体是
否败育，还具有稳定的遗传性[25]。因此，深入研究
雌配子体游离核的发育特征，可能是破解云贵水韭
生殖濒危机制的有效途径之一，也有助于揭示维管
植物生殖演化的系统学规律。
颈卵器(Archegonium)是苔藓植物、蕨类植物、
银杏、苏铁等类群的共同结构，是随着植物进化而
不断简化的雌性生殖器，是讨论高等植物进化的重
要依据[23]。一般认为蕨类植物颈卵器内具有 2 个
颈沟细胞(Neck canal cell)或 1 个颈沟细胞里具有 2
个细胞核和 1 个腹沟细胞(Ventral canal cell)，2 个
颈沟细胞由 1 个初生颈沟细胞(Primary neck canal
cell)分裂而来，腹沟细胞和卵细胞则是由中央细胞
图 2 云贵水韭颈卵器的发育过程。A: 原始细胞; P: 初生颈壁细胞; C: 中央细胞; NW: 颈壁细胞; NC: 初生颈沟细胞; E: 卵细胞; N1: 第一颈沟
细胞; N2: 第二颈沟细胞; V: 由配子体营养细胞特化的颈卵器腹壁。
Fig. 2 Development process of archegonium in Isoetes yunguiensis. A: Initial cell; P: Primary neck wall cell; C: Central cell; NW: Neck wall cell; NC:
Primary neck canal cell; E: Egg; N1: 1st neck canal cell; N2: 2nd neck canal cell; V: Archegonium ventral wall specialized from vegetative cell of
gametophyte.
第5期 515
图 3 云贵水韭雌配子体及颈卵器的败育结构。A: 颈卵器; M: 中壁; G: 配子体; NW: 颈壁细胞; GC: 生殖细胞; N1: 第一颈沟细胞; N2: 第二颈
沟细胞; D: 指状突起; E: 卵; F: 泡沫。1: 停止在游离核时期的雌配子体; 2: 着生有败育颈卵器群的雌配子体; 3: 颈卵器纵切面，示菌类感染后
卵细胞败育; 4: 颈卵器纵切面，示菌类感染后破碎化的卵细胞; 5: 老化的卵细胞; 6: 颈卵器纵切面，示颈沟不通、颈沟细胞发育不良; 7: 颈卵器
纵切，示颈沟细胞过大、卵细胞发育不良; 8: 颈卵器纵切，示颈沟细胞过大、卵细胞老化; 9: 颈卵器纵切，示颈沟不通、第二颈沟细胞侧向上产生
多个指状突起; 10: 颈卵器纵切，示第一颈沟细胞未产生盾刺状突起; 11: 颈卵器纵切，示败育的卵细胞; 12: 颈卵器纵切，示过大的第一颈沟细
胞; 13: 颈卵器纵切，示卵细胞萎缩; 14: 颈卵器纵切，示颈沟不通、第二颈沟细胞产生多个指状突起、第一颈沟细胞被泡沫状物质托起; 15: 颈卵
器纵切，示过熟的颈沟细胞和尚未发育的卵细胞; 16: 颈卵器横切，示解体的卵细胞。
Fig. 3 Abortive structures of female gametophyte and archegonium in Isoetes yunguiensis. A: Archegonium; M: Mesospore; G: Gametophyte; NW: Neck
wall cell; GC: Germ cell; N1: 1st neck canal cell; N2: 2nd neck canal cell; D: Digitation; E: Egg; F: Foam. 1: Female gametophyte stop in free nuclei stage;
2: Abortive archegoniums on female gametophyte; 3: Vertical section of archegonium, egg abortive infected by fungus; 4: Vertical section of archegonium,
fragment egg infected by fungus; 5: Aged egg; 6: Vertical section of archegonium, neck canal impassability, neck canal cell dysplasia; 7: Vertical section
of archegonium, neck canal cell oversize, egg dysplasia; 8: Vertical section of archegonium, neck canal cell oversize, aged egg; 9: Vertical section of
archegonium, neck canal impassability, many digitations above side of 2nd neck canal cell; 10: Vertical section of archegonium, no shield spike on 1st
neck canal cell; 11: Vertical section of archegonium, abortive egg; 12: Vertical section of archegonium, 1st neck canal cell oversize; 13: Vertical section of
archegonium, atrophied egg; 14：Vertical section of archegonium, neck canal impassability, many digitations above side of 2nd neck canal cell，1st neck
holded by foam；15: Vertical section of archegonium, overripe neck canal cell and undeveloped egg; 16: Transverse section of archegonium, disintegrated egg.
沈玮等：云贵水韭雌配子体发育及其濒危机制的研究
516 第23卷热带亚热带植物学报
(Central cell)分裂而来，初生颈沟细胞和中央细胞
是姊妹关系[26]，腹沟细胞因与卵细胞为姊妹关系而
不同于颈沟细胞[27]。本研究观察到云贵水韭颈卵
器的 2 个“沟细胞”是由 1 个细胞分裂而来，颈卵器
内只有颈沟细胞而无腹沟细胞。从系统演化的角
度来看，云贵水韭的中央细胞不再分裂而直接演化
为卵细胞，因此可以证明腹沟细胞要比颈沟细胞分
化晚，腹沟细胞主要生殖意义是辅佐卵细胞发育。
在水韭类存在着中央细胞的简化式退化。
云贵水韭的颈卵器在具有受精能力前，2 枚
颈沟细胞和 1 枚卵细胞在形态、位置等方面都有着
一定的变化规律，这是未见报道的。Karrfalt 等[28]
观察到 I. andicola 成熟颈卵器颈部近下方有一个
短管状通道，但长度不会穿过最外层的两层颈壁细
胞，与云贵水韭一样，颈沟细胞并不在颈沟内，只是
第一颈沟细胞在解体前曾沿颈沟底部向上产生 1
个钝刺状突起，认为这个突起应该有疏通颈沟、利
于精子游入的生理功能。
Huang[19]观察到台湾水韭(I. taiwanensis)雌配
子体表面可产生 5~12 枚颈卵器，路靖等[17]指出颈
卵器发育成熟后如果一直没有受精机会，过熟的颈
卵器就会逐渐枯死，新颈卵器不断产生，直到大孢
子内的养分耗尽为止，这应该是为了获得更多的受
精机会。本研究在支持上述结果的基础上，进一步
认为云贵水韭雌性败育的主要原因是颈卵器高度
简化且分化紊乱：由于颈卵器的腹壁细胞是由配子
体的营养细胞转化而来，又缺失腹沟细胞，这和蕨
类植物[22,27]相比，云贵水韭的卵发育得不到很好的
保护和滋养；颈壁细胞排列紊乱，颈沟不通；颈沟细
胞产生指状突起或泡沫化；卵细胞在体积膨大后，
常出现胞质稀薄而失去活性，而且这些障碍可能在
同一个颈卵器里发生。此外，大孢子败育率高达
74%、多数不能萌发，雌配子体发育初期常停留在
游离核时期、细胞化受阻，半数细胞化的雌配子体
不能产生颈卵器等，也应该是云贵水韭生殖濒危的
重要原因。
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沈玮等：云贵水韭雌配子体发育及其濒危机制的研究