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蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响
江月玲 林植芳v 彭长连 田 ·2／2
(广州师范学院生物系．广州 51o400) (中国科学院华南植物研究所．广州 510650) t ．，，
摘要 经蛋白质化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺 (NBS)、T-N(BTD)和对 一氯汞苯甲酸( CMB)处
理的盐藻细胞光台速率下J雌．0 1 7 mlno1／L的 PCMB和 0 07 mmol／L的 NBS可完全抑制光台放氧。
在藻细胞的可见光(400—700 nm)区吸收光谱中，三种修饰剂都J雌低了整个波段的吸收。 在两个主要
吸收峰中，678 nm吸收值的下降略大于 436 nⅢ的下降。 在紫外光谱区 (2O0—300 rim)，pCMB和
BTD使原吸收峰(203 ikrn)值明显降低，NBS处理使吸收峰红移 13 nm。 细胞胀破后紫外光谱出现更
显著变化， 峰位移至 223 nm (BTD)、 250 nm BS)， 或至 214—237 ikrn而呈一 个 宽的平 台
(pCMB) 紫外差示吸收光谱显示 210 nm的负峰： 随修饰剂浓度增大，负差示峰可穆到 225 rim
(NBS)、245 5 rol(pCMB)和 212 rim (BTD)o
关键词 盐藻；蛋白质修饰剂
分类号 Q175
；
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EFFECTS OF PROTEIN M ODIFIERS ON
PHOTOSYNTHESIS IN D A ￡三 删
Jiang Yueling
rD 口rm of Biolooy．Guangzhou Teachers Corlege，Guangzhou 51040(I)
Lin Zhifang Peng Changlian
(South China Institute of Botany．Academia Sinica Guangzhou 510650)
Abstract Three protein modifers，butanedione(BTD)，N-bromosuccinimide【NBS)and
p-chloromercurihenzoic acid (p CMB)，were used to treat ceils of a green marine alga，
Dunatiella satina． The photo synthetic oxygen evolution and absorption spectra were
studied by oxygen electrode and spectrophotometer．
All 0f the used modifiers inhibited the photosynthetic rate of DunaIietta satina to a
certain exterit．The inhibition was 14．6％ (BTD,0．21 mmo1]L),21．4％ (NBS，0．02 retool／L)l
and 39．7％ (p CMB，0．1 retool／L)，respectively．A complete loss of photosynthetic capacity
was found in the presence of 0．17 mmol／L pCMB or 0．7 mmol／L NBS．
The absorbance in visible wavelength of 400—700 nm was reduced by thre modifiers·
The decre：ase of main absorption peak at 678 nm was slightly larger than that of another
main peak at 436 nm．In ultraviolet spectra(200—300 nm)of D．satina cels，treatment of
口CM B and BTD de,creased the absorbance of the 203 nm peak， while NBS treatment
jnduced a red shift of wavelength about 13 rim．After hypoosmotic shocking of cels，the
1996-10-16收稿 ； 1997-09-22修回
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热带亚热带植物学报 第 6卷
chemical modification of proteins resulted in much obvious changes in ultraviolet spectra
patterns UV spectrum showed a wide absorption pIateau in the range of 2 1 4 nm to
237 nm when cells were treated with p CM B，but in the presence of BTD or NBS red
shifts from initial peak(203 nm)to 233 lm or to 250 nm，respectively，with declining
peak height were observed
A negative differential peak at 210 nm was displayed for modifed cels in ultraviolet
differential absorption spectra．It was further shifted to 225 nm (NBS)，245．5 nm (pCMB)
and 2 1 2 nm (BTD)，when the modifers concentration increased to 5 mmoI／L The
possible reason for the reduction of the photosynthetic rate by protein modifiers is
discussed．
Key words Dunaliella salina； Protein modifier； Photosynthesis； Absorption spectrum
许多蛋白质的化学修饰剂常被用于研究酶类话性部位的氨基酸残基组分 这些化学修饰剂
的作用在于能专一地对酶结构中的某一功能基团进行共价修饰，影响酶的活性及其动力学反应
过程l J 经修饰的蛋白质与酶的吸收光谱和荧光光谱往往发生了不同程度的变化，反映了其分子
构象的变动 过去的这些工作常以高纯度的单一的酶蛋白为研究对象，而细胞和生物活体中皆
由具复杂结构与生理功能的多种蛋白体系组成 一种蛋白质修饰剂的导^可能将对多种蛋白质
中有关功能基团进行修饰，从而引起机体内重要生理特性的变化、然而目前对此知之甚少。
单细胞盐藻是一种海生绿藻，其细胞外只覆盖着一层富含糖蛋白和神经氨酸的可塑性甚强
的外膜口J，没有细胞壁，细胞内有一个很大的杯状叶绿体，光合放氧速率较高口I4】 蛋白质含量 占
干重的 30％is1 因此它是一种探讨蛋白质修饰与细胞光合功能关系的较理想的材料 本文以盐
藻为对象，研究了几种蛋白质化学修饰剂对盐藻的光合速率及吸收光谱特性的影响，为阐明具
有多酶体系和复杂蛋白结构的完整细胞的蛋白构象和光台功能的关系等提供一些依据
1 材料 与方法
盐藻Dunatiela salina l009由华南植物研究所生理室提供 藻细胞在含 2 mol／L NaC1的
ASP培养基中，25℃，200／~moI m 光下培养 25 d 试验前将藻液于 800 g离心 l0 miU，
收集藻细胞重悬浮于 2 mol／L NaCI待用
参照彭长连等以前的方法用氧电极法测定光合放氧速率 。 反应液含 2 moI／L NaC1．
10 mmoI几 NaHCO ，50 mmoI／L磷酸缓冲液pH7．5 测定时控制温度 25℃ 及光合作用饱和
光强 400#mol m ～。 试验共用三种蛋白质化学修饰剂， 即精氨酸残基修饰剂丁二酮(BTD，
butanedione)，色氨酸和酪氨酸残基修饰剂 N_溴代琥珀酰亚胺(NBS，N-bromosuccinimide)和
琉基修饰剂对 ．氯汞苯甲酸(pCMB，p-chloromercuribenzoic acid)。 修饰剂加入藻细胞液中
10 min后，作光合放氧速率测定， 30 min后作吸收光谱测定 部 分试 验还加胰蛋 白酶
(Trypsin)作比较。 修饰剂和胰蛋白酶浓度见实验结果中各图。 吸收光谱 (200—300 nm及
300—700 rim)和紫外差示吸收光谱(200—300 nm)以Beckman Du-7 HS分光光度计作自记扫
描，参照林植芳 的方法 吸收光谱测定时以修饰剂为空白对照，消去修饰剂 自身的吸收。 差
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第 1期 江月玲等：蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响
示吸收光谱测定用双杯法，以含缓冲液和修饰剂各一杯 (皿)相联作为参比，而样品光束中含相
联的一杯盐藻加修饰剂和一杯修饰剂溶液。 每个测定的盐藻浓度相 同， 相 当于含 叶绿 素
20 g。
2 试验结果
2．1 化学修饰剂对盐藻光台放氧速率的影响
三种化学修饰剂 (NBS，pCMB和BTD)皆能
对盐藻 的光台放氧 速率产 生抑 制作用， 低浓
度下，0．21 mmol／L的 BTD抑 制光 台放 氧速
率14．6％，0 02 mmol／L的NBS抑 制 21．4％，而 g
0 1 mmol／L的 PCMB抑制 39．7％。 抑制效应随 兽
修饰剂浓度增高而加剧。从-~t,修饰剂所用浓度及 二
其对盐藻光合速率的抑制 ％ 看来 (图 1)，NBS的
抑制 作用最 强， BTD 较 弱， PCMB的作用 居
中。0．17 mmol／L的PCMB和0．07 mmo]【／L的NBS
即能完全抑制盐藻的光合放氧，而 0 42 mmol【／L的
BTD只抑制 25％ 的放氧速率。 可见盐藻蛋 白质中
色氮酸和酪氮酸残基的被修饰，可明显降低盐藻的
光合功能
2．2 化学修饰剂对盐藻吸收光谱的影响
在300—700 nm波段中，盐藻细胞显示436 nm、
图 1蛋白质修饰剂对盐藻光台作用速率的抑制
Fig．1 The inhibition of protein modife~ oil
photosynthetic rate in DunalieRa salina
图中数字为修饰剂浓度 mmol儿
Th e number abore each ∞ tumn is the
concentration (mmof，L)of mod~lers
678 nm 的吸收峰和 478 nm 的吸收肩，这与French报告 Euglena细胞水悬液具 675 nm 和
436 nm吸收Fl相似 PCMB(0 l7 roanol／L)和BTD (0．21 mmol／L)减弱盐藻的光吸收，但对
整个渡谱形状没有影响(图 2B)。 然而，BTD使 678 nm的吸收下降 6．5％，436 nm下降 10％，
因而提高了436 nm／678 nm吸收比值。在胰蛋白酶的作用下，吸收光谱的三个高值点皆明显
下降，且 436 nm 峰变宽 (图 2A)。
盐藻的紫外吸收光谱(200—300 nm)只有一个单峰 203 nm。 pCMB作用后，203 nm吸
收下降，260 nm呈现低谷，280 nm的吸收略有回升。 BTD也使 203 nm 吸收降低且峰形加
宽 NBS(O．02 mmol／L)对紫外区的吸收有显著的影响，原峰位向长波方向漂移 13 nm，出现
于 216 nm处，且近280 nm也有较高的吸收(图3)。 与图2的长波区吸收相比，短波区吸收
光谱的变化较明显，尤以NBS的作用敛应较大。 这表明盐藻的紫外吸收光谱特性受到了蛋 质
化学修饰剂的干扰。 图3还可见，胰蛋白酶对盐藻内蛋白质的降解作用，也导致紫外吸收峰红
移到 223 nm，峰值下降，且在 240—260 nm区间也有较高的吸收
如果将盐藻细胞放于蒸馏水中低渗胀破，使细胞内含物流出，再与上述的蛋白质修饰剂反
应，结果引起紫外吸收光谱更为显著的变化(图4)。 胀破藻对照的吸收峰出现于212 nm，BqD
作用后的紫外峰移至 223 nm处，NBS修饰后的吸收峰红移到 220 nm，与对照相差 38 nm，峰
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d 热带亚热带植物学报 第 6卷
值明显降低，而pCMB则诱致了214—237 tim的一个宽而平的高峰。 这些加剧的变化，可能
是细胞脓破使其内舍物 I_n0蛋白质更易于和化学修饰剂相互作用之故。
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波长 Wa~ nvh (nra)
图 2 蛋白质修饰剂和胰蛋白酶对盐藻吸收光诰的影响
Fig 2 Efccls of protein 几10d_hc and t~ypsin on absorption spCCll of Dunaliela sati．a
1，3 时J!c{Control；2 Trypsin(100 g ml。)，4 PCMB(017retool／L)；5 BTD札21 mmol；L)
波 长Wavelength fnm
图 3 蛋 白质修 饰 剂和胰 蛋白酶 对盐 藻紫外
吸收光谱 的影 响
Fig 3 EflL"cts of pmtem modH~ and trypsin on
uttravinlet absorption spcctra of
D~ltta r,ieI ra salirta
1 对吼 CQnlrQ L；2．pCMB[0【7 131too『f
3．BTD(0 21 mmo L／L)； 4 NBSf0．02 mmo| )
5 Trypsin(1O0 g ml"。)
波长 Wavctength(nm)
围 4 蛋 白质修饰剂和胰蛋白酶对 盐 藻胀破细 胞
紫外吸收光谱的影响
Fig．4 Efccts of protein modifers and trypsin o
ul rravioIct absorl~tion spz,ctra in hypoomostic
shock cells of DllnMietla sal[ha
1对照Con~ol；2．pCMB(0【 retool／L)
3 BTD(0．21 retool,L)；4．Trypsin(【[)u E ml )，
5 NB$f0 02 mmol／L1
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第 1期 江月玲等：蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响 5
2．3 化学修饰剂对盐藻紫外差示吸收光谱的影响
图 5是经修饰的盐藻细胞紫外差示吸收光谱，可见三种修饰剂PCMB，NBS和 BTD在浓度
较低时(图 5中的曲线2，3，5)，紫外差示吸收光谱中皆有一个在 210 nm附近的负峰， 以NBS
处理的负峰最为明显。 修饰剂浓度增高至各为5 mmol ，负差示峰问出现差别。 BTD处理者
红移仅 2 nm，NBS修饰的负差示峰从 21O 5 nm移至225 nm，pCMB修饰的则漂移到 245．5 nm，
其效应 甚至大于 NBS。 修饰剂之问在相同的较高浓度 (5 mmol／L)以及不同的低 浓度下
(0．07 mmol／L或 0．2 mmol／L)所出现差示吸收光谱变化上的差异，可能与盐藻的蛋白质组
成，结构特性及其与修饰剂接触的程度有关。较高的修饰剂浓度引起紫外差示光谱较深刻的变动，
推测是在较高浓度下可结合于多种蛋白质的相应氨基酸残基，引起其构象或结构较强烈变化的
一 种综合效应。
3 讨论
图 5 蛋白质修饰剂处理的盐藻细胞的紫外差示光谱
Fig 5 Uifa-av]olet diferential spectra of Dunallella salina cells treated by pmtein modifiers
l pCMB 5 retool／L； 2．pCMB 0 2 mmol／L； 3 BTD 0．2 retool／L；
4 BTD 5 mmolL；5 NBS 0．07 mmol／L； 6 NBS 5 mmol【儿
对盐藻细胞蛋白质的半胱氨酸残基，精氨酸残基和色氨酸、酪氨酸残基的化学修饰，明显
地抑制了盐藻的光合作用(图 1)，表明这些氨基酸残基是制约盐藻光合活力的因子。 盐藻细胞
可见光谱与叶绿素提取液的吸收光谱(未表示)相近，表明其吸收光谱主要与光合色素的吸光特
性有关。 通常 660—670 nm和 430 nm是叶绿素 a的吸收峰，450—490 nm是包括叶绿素 b
和类胡萝 b素的吸收峰。 经修饰的盐藻在 678 nm和436 nm吸收降低以及436 nm／678 nm吸收
值升高，说明光合色素尤其是叶绿素 a含量有所下降。 然而，可见光谱受修饰剂影响的程 不
如紫外光谱和光合放氧速率，即光合色素数量的轻度下降不是修饰剂抑制光合作用的主要原
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6 热带亚热带植物学报 第 6卷
因。 林植芳等近期用叶绿素荧光技术的研究表明，化学修饰剂 NBS，pCMB，BTD和 DEPC
fDiethylpyrocarbonate)可使菠菜的Ps II失活，显著降低原初光化学效率 Fv／Fm，光化学猝灭
系数 qP和光合电子传递的量子效率西PSiit 。 因此，推测文中的修饰剂抑制盐藻的光合作用
也可能与抑制光合作用中能量的转移、分配和利用以及部分失活PS II有关。
光系统反应中心，光合膜色素蛋白复合体和光合作用碳代谢酶类的组成中皆含有重要的氨
基酸残基，如精氨酸、色氨酸和琉基等[9,10t，对维持光合器结构的稳定性和功能具有重要的作
用。 从本文中蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的抑制效应以及对吸收光谱的改变程度看来 (囤
1—3)，三种修饰剂相比，NBS的抑制效果最为显著，意味着蛋白质和酶类中的色氨酸与酪氨
酸残基对盐藻细胞光合功能的正常运行可能起着更重要的作用 光合器功能取决于叶绿体结构
的完整性。 张正东等曾以胰蛋白酶作为结构修饰剂研究其对ot‘绿体膜结构和功能的影响，发现
胰蛋白酶可钝化PSII氧化侧和还原剂的电子传递，5O g rnl 的胰蛋白酶抑制DCIP的光还原
近 50％t“l。 本文中胰蛋白酶引起盐藻的完整或胀破细胞在可见光区吸收的下降和紫外光区吸收
波长的红移及吸收峰值降低，其变化趋势与用三种蛋白质修饰剂(NBS，BTD和 pCMB)的效应
近似，这从一个侧面反映了这些修饰剂对光合作用的抑制与影响叶绿体中功能蛋白正常的结构
或构象有关。
从紫外吸收光谱与紫外差示光谱的研究通常可获得生物大分子结构与功能关系的有意义信
息。 紫外光谱中的远紫外区(1 85—245 nm)是肽键的吸收峰，与蛋白质的肽链构象相关；近紫
外区(240—320 nm)的吸收则主要是蛋白质侧链上的芳香氨基酸残基所贡献l_ 。 盐藻细胞经三
种化学修饰剂作用， 主要 的变化皆发生于远紫外区， 出现了峰位 红移和 峰值下 降现象
(圉3，4)。 NBS氧化色氨酸生成氧化吲哚，引起 250 nm吸收增大，pCMB修饰蛋白质的巯基
形成巯醇基在 250—255 i／m有吸收I”。 Okunuki也曾指出，蛋白质在 245 nm的吸收峰是由
于-SH的解离{”I。 我们观察到紫外吸收峰 250 nm及紫外差示光谱的负245．5 nm吸收峰分别 出
现于 NBS修饰的胀破盐藻细胞或高浓度 pCMB修饰的藻细胞中(图4，5)。 这与两种修饰剂对
蛋白质中相应氨基残基修饰的结果相符。 这些结果可见，修饰剂的作用除了专一地修饰相应的
氨基酸残基，还可非专一性地改变蛋白质肽链的构象，从而降低了光合作用能力。 Nagnuson
等以另一种巯基的修饰剂 NEM (N一乙基马来酰亚胺)处理菠菜叶绿体，发现 NEM 可与偶聪因
子CFI的 亚单位上的-SH基结合而抑制光合磷酸化 这也许是盐藻光合作用受 pCMB影
响的原因之一
参考文献
I 杨寿钧， 钱世钧，盂广震 氨基酸残基的化学修饰．张树政，孟广曩，何忠效主编．酶学研究技术．北京 科学出
版社 ， 1987，289—322
2 Grirtzhurg M Dunalielfa，a green a a adapted to salt Adv Rot R ，1987，14：92,一l 83
3 BeG．Amotz A．,4_vron M The biotechnolog3~of m ss culturh~g Dunalielfa for p兀]du c1 of commercial interest In：
Cresswel R C et aI．eds Algal Biotech~ology Lo rtgman，1989，92—1 I4
4 彭长连、林植芳，孙谷畴等．两种盐藻光舍作用特性的比较．海洋与湖沼， 1994、25(6)：606-61I
5 Corin~ T I．Sil~v*H J Eriola R J Photo~yr,thetic productiot~of Dumaliella b maEs from ~acur-a1．Eak wu．ter and
carbon dioxide．J Chem Tech Biotech．I984．34B：291—295
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第 1期 江月玲等：蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响 7
6 林植芳．恬性氧对盐藻光合作用和吸收光谱的影响．中国科学院华南植物研究所集刊， 第 】0集， 北京：科学出版
社， 1995．73—80
7 French C S Action spectra and optical properties of celuMr pigments In：W ithrow R B ed．Photoperiodism and
Re"luted Phenomenu in Plants and Animals．American Association for the Advancement of Science，*washington D C，
1959，】5-40
8 韩植芳，李晓萍，林桂珠等．蛋白质修饰剂、变性剂和活性氧对菠菜叶片光系坑 II光失活的影响 热带亚热带植物
学报， 】997，5(【)59—64
9 汤小仪．施教耐．色氩酸残基在磷酸烯醇武丙酮酸羧化酶催化功侥中的作用 植物生理学报， 1988，】4(I)：88—93
10 Kaiser W M Reversible inhibition of the Calvin cycle and activation of oxidative pcntose phosphate cycle in
isolated intact chlorop"1~ ts by hydrogen pe roxide．P】an【a．1979．145：377—382
1I 张正东．李良壁，谭克辑等．以蛋白酶作为结构修饰荆的叶绿体膜皇占构和功能的分析 植物学报．1980，22(1) 9—55
12 扬寿钧．紫外差示光谱．张树政，孟广震，何忠蚊主编．酶学研究拄术．北京：科学出版杜， 1987，338—346
1 3 Okun,ki K Denaturation and inaction of enzyme proteins．Adv Enzymt)l，1965，23：66—68
14 Ragnuson R P，McCa rty R E Influence of adenine rucleotide* Oil the inhibition of photophospharylatinn in
spinach chloroplasts by N-ethylmaleomJdc．J Biol Chem，1975，250：2593—2598
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