全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 793~802 793
收稿 2013-04-09　　修定 2013-04-28
资助 国家重点基础研究发展计划(2012CB944803)、浙江省
科技计划(2011C22059)和浙江省博士后项目择优资助
(Bsh1202082)。
* 通讯作者(E-mail: yzhu1974@hotmail.com; Tel: 0571-
86419102)。
灌浆期高温影响水稻胚乳储藏物质代谢相关基因表达的研究
徐恒1, 郭小雨1,2, 朱英1,*
1浙江农业科学院病毒学与生物技术研究所, 杭州310021; 2河北师范大学生命科学院, 石家庄050024
摘要: 为了探讨灌浆结实期高温对水稻籽粒储藏物质以及储藏物质代谢相关基因的影响。我们利用人工气候室设置高温
(最高温度35 ℃/最低温度28 ℃)和常温(最高温度28 ℃/最低温度20 ℃) 2个温度处理灌浆结实期的粳稻品种Dongjin, 检测
胚乳中储藏物质以及储藏物质代谢相关基因的表达。结果表明, 高温处理后水稻种子垩白明显增加、重量减小、总淀粉
含量和直链淀粉含量下降。高温处理后支链淀粉链长分布也有了明显的改变, DP10~20的短链减少, 而DP>20的中长链明
显增加。高温处理后淀粉合成相关基因GBSSI和BEIIb的表达量减低。大部分质体转运蛋白和淀粉合成相关基因在高温处
理早期表达量增加, 而后期下降。高温处理后, 多数储藏蛋白基因如GLUB、RAG-1、RM1和PROL14表达量下降。该研究
结果将有助于我们了解水稻灌浆期高温影响种子中储藏物质积累的分子机制。
关键词: 高温; 水稻; 胚乳; 储藏物质
Effect of High Temperature on Expression of Genes Involved in Storage Mate-
rials Accumulation in Rice Endosperm
XU Heng1, GUO Xiao-Yu1,2, ZHU Ying1,*
1Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310021, China; 2College of Life
Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China
Abstract: To elucidate the effects of high temperature on grain-filling key genes involved in storage materials
accumulation, a Japonica rice Dongjin was grown under high temperature (35 ℃/28 ℃) and control
temperature (28 ℃/ 22 ℃) during the filling stage. The results indicated that grains ripened under high
temperature resulted in the occurrence of grains with various degrees of chalky appearance, decreased grain
weight and low total starch contents and amylose contents. Amylopectin chain length distribution was also
significantly changed under high temperature, with smaller proportion of short side chains (DP 10–20) and
larger proportion of long chains (DP>20). Several starch synthesis-related genes, such as granule-bound starch
synthase I (GBSSI) and branching enzymes, especially BEIIb gene were down-regulated under high temperature.
The expression levels of most of the plastid transporter protein genes and starch synthesis genes were up at
early and mid-stage of high-temperature treatment, and down at late stage. The expression levels of the seed
storage protein gene GLUB, RAG-1, RM1 and PROL14 were decreased under high temperature. This work
helps us understand the molecular mechanism of how high temperature affecting storage material accumulation
during the grain-filling stage in rice.
Key words: high temperature; rice; endosperm; storage materials
温度是影响植物生长发育的主要环境因素之
一。植物种子的萌发、生长、开花和结实都与温
度有密切关系。水稻是喜温植物, 一般要求生长
温度在22~28 ℃之间, 温度过高或过低都会影响生
长。水稻对高温热害最敏感的时期为减数分裂期
到开花期, 次敏感时期为灌浆期。花期高温能引
起颖花高度不育, 直接降低结实率, 从而使水稻减
产; 灌浆期高温除了造成千粒重和结实率明显降
低外, 更造成稻米品质变差, 例如总淀粉含量下
降、粗蛋白含量增加、垩白增多、糊化温度升高
和胶稠度变硬等等(Cheng等2005; Zhong等2005;
Yamakawa等2007; Li等2011)。
植物生理学报794
最初人们对高温影响稻米品质的研究主要集
中在生理生态水平, 包括: 灌浆结实期高温会造成
水稻灌浆速率加快、叶片光合效率下降和储藏物
质积累相关酶活性改变等(程方民等2003; Cheng
等2005; 滕中华等2008; Li等2011)。利用不同时
间播种或人工气候箱模拟不同的灌浆期温度, 人
们鉴定出水稻品种间温度敏感性存在差异(Dhali-
wal等1986; 程方民等2000, 2001)。对灌浆结实
期水稻进行不同时段高温处理的结果表明, 灌浆
前期的高温对水稻垩白、淀粉结构和品质影响
较大 , 而后期影响较少(程方民等1996; 盛婧等
2007)。程方明等(2003)的研究表明高温下水稻
籽粒灌浆前期的淀粉积累速度加快 , 但相对持
续时间较短, 灌浆过程在开花后10~14 d就基本
结束。
随着近年来分子生物学的发展, 人们开始尝
试探索高温影响稻米品质的分子机理。稻米品质
的形成过程就是籽粒中淀粉的生物合成和积累过
程。参与水稻胚乳中淀粉合成的主要酶有蔗糖合
成酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀
粉分支酶和淀粉去分支酶(Jeon等2010)。高温对
稻米品质的影响是通过降低稻米的总淀粉含量,
改变稻米中的直链淀粉含量以及支链淀粉的链
长、聚合度以及链数来实现的, 因而高温对稻米
品质的影响也必定是通过调节这些关键酶的合成,
活性以及它们之间的相互作用来实现的。‘日本
晴’水稻若在灌浆期受高温胁迫, GBSSI (granule-
bound starch synthase)基因的表达量下降2倍左右
(Yamakawa等2007)。这一结果与Lin等(2005)用蛋
白组学方法分析到的高温可抑制GBSSI蛋白的表
达量是一致的。Yamakawa等(2007)通过对高温处
理灌浆期种子的基因芯片数据分析得到了胚乳中
淀粉合成酶的表达图谱, 结果表明高温会引起种
子中淀粉合成酶基因的表达差异, 除了Wx基因外,
SBEIIb等基因的表达也受到高温抑制。进一步, 转
录组学和代谢组学的结果也证实, 高温抑制蔗糖
合成酶、蔗糖酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉
合成酶和淀粉分支酶的表达, 从而影响淀粉合成
(Yamakawa等2010)。这些结果说明某些参与淀粉
合成的关键酶基因对高温的响应可能是在转录水
平上被调控的。
蛋白质是水稻种子中仅次于淀粉的储藏物,
大约占5%~8%。蛋白质含量不仅影响水稻营养品
质, 而且还影响着水稻外观品质、加工品质以及
食用品质(Tashiro等1991; Hamaker和Griffin 1993)。
灌浆结实期高温对水稻种子中不同的储藏蛋白影
响也不同, 灌浆结实期高温处理早期各种储藏蛋
白积累均增加, 而在高温处理后期醇溶谷蛋白积
累减少。灌浆结实期高温胁迫明显抑制了编码13-
kDa醇溶谷蛋白的基因表达, SDS-PAGE和免疫印
迹法分析表明高温下储藏蛋白中13-kDa醇溶谷蛋
白明显减少(Yamakawa等2007)。
综上所述, 灌浆期高温可明显改变稻米中储
藏物质的积累 , 但温度如何影响稻米中包括淀
粉、蛋白质和脂类等储藏物质积累的分子机理仍
不清楚。
本文以粳稻品种Dongjin为材料, 通过人工气
候室设置高温(最高温度35 ℃/最低温度28 ℃)和常
温(最高温度28 ℃/最低温度20 ℃), 对灌浆期水稻
进行不同温度处理。利用qRT-PCR技术系统地分
析了高温处理不同时间(1、5和9 d)后种子中各类
储藏物质代谢相关基因的表达, 结合高温处理后
种子中淀粉, 蛋白质等储藏物质理化指标的变化,
初步探讨了灌浆结实期高温影响稻米中储藏物质
积累的分子机理。
材料与方法
1 植物材料及处理方法
本文以粳稻品种Dongjin (Oryza sativa ssp
japonica cv. Dongjin)为材料, 利用人工气候室设置
高温(最高温度35 ℃/最低温度28 ℃)和常温(最高
温度28 ℃/最低温度20 ℃) 2个温度处理, 温室湿度
60%。在孕穗期, 分别选取生长一致植株30株, 带
泥挖取, 避免伤根移入方桶中, 每桶栽2株, 放置在
常温人工气候室中生长。将开花后水稻进行标记,
开花后5 d (排除高温对颖花发育和授粉的影响)的
水稻分别移入高温和常温处理的人工气候室中处
理, 处理1、5和9 d (分别为开花后6、10和14 d)取
材, 每个时间点取标记好的籽粒20粒, 然后提取总
RNA。
水稻胚乳RNA的提取使用Tiangen的植物
RNA提取试剂盒, 分别取10粒不同温度处理1、5
徐恒等: 灌浆期高温影响水稻胚乳储藏物质代谢相关基因表达的研究 795
和9 d的种子, 然后取出胚乳。提取的RNA经过凝
胶电泳和BECKMAN分光光度计检测, 使用DNa-
seI (RNase-free) (Takara D2270)消化残留的DNA,
第一链cDNA合成使用Goscript Reverse Transcrip-
tion system反转录试剂盒(Promega A5001)。
2 淀粉品质测定
总淀粉含量测定采用淀粉测定试剂盒 (K-
TSTA, Megazyme, Ireland)。
直链淀粉含量测定采用Tan等(1999)方法。
支链淀粉链长分布测定方法: 称取5 mg米粉,
使用Pseudomonas amyloderamosa isoamylase (Sig-
ma Aldrich Corporation, St.Louis, USA)消化, 然后
使用配备脉冲安培检测器和CarboPac PA20阴离子
交换柱为色谱柱的高效阴离子交换色谱-脉冲安培
检测法测定(HPAEC-PAD) (Model ICS3000, Dion-
ex, CA, USA)。
粗蛋白含量采用微量凯氏定氮法(Yamakawa
等2007)。
3 qRT-PCR
qRT-PCR使用SYBR green I荧光染料法, 仪器
为BIO-RAD的CFX96。qRT试剂盒使用iQ SYBR
Green supermix (BIO-RAD 170-8882AP)。每样品
重复3次。内参基因为UBQ10, 基因表达量采用参
照基因的δcT法。δcT=2ct (reference)−ct (target)计算出目
标基因在不同温度处理不同灌浆时期的相对表达
量。显著性分析采用双尾非配对t-检验。*表示
P<0.05,**表示P<0.01。
PCR引物见表1。
表1 定量PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of qRT-PCR
Genbank登录号 基因名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) 扩增长度/bp
LOC_Os08g25734 OsAGPS2b AACAATCGAAGCGCGAGAAA GCCTGTAGTTGGCACCCAGA 186
LOC_Os01g44220 OsAGPL2 AGTTCGATTCAAGACGGATAGC CGACTTCCACAGGCAGCTTATT 96
LOC_Os03g52460 OsAGPL3 AAGCCAGCCATGACCATTTG CACACGGTAGATTCACGAGACAA 131
LOC_Os06g06560 OsSSI GGGCCTTCATGGATCAACC CCGCTTCAAGCATCCTCATC 279
LOC_Os06g12450 OsSSIIa GCTTCCGGTTTGTGTGTTCA CTTAATACTCCCTCAACTCCACCAT 54
LOC_Os08g09230 OsSSIIIa GCCTGCCCTGGACTACATTG GCAAACATATGTACACGGTTCTGG 334
LOC_Os05g45720 OsSSIVb ATGCAGGAAGCCGAGATGTT ACGACAATGGGTGCCAAGAT 75
LOC_Os06g04200 OsGBSSI AACGTGGCTGCTCCTTGAA TTGGCAATAAGCCACACACA 218
LOC_Os02g32660 OsBEIIb ATGCTAGAGTTTGACCGC AGTGTGATGGATCCTGCC 261
LOC_Os08g40930 OsISA1 TGCTCAGCTACTCCTCCATCATC AGGACCGCACAACTTCAACATA 132
Os04g0164900 OsPUL ACCTTTCTTCCATGCTGG CAAAGGTCTGAAAGATGGG 202
LOC_Os06g51084 OsBEI TGGCCATGGAAGAGTTGGC CAGAAGCAACTGCTCCACC 191
LOC_Os02g06640 UBQ10 TGGTCAGTAATCAGCCAGTTTGG GCACCACAAATACTTGACGAACAG 81
LOC_Os03g55090 OsPHOL TTGGCAGGAAGGTTTCGCT CGAAGCCTGAAGTGAACTTGCT 66
LOC_Os05g32710 OsISA2 TAGAGGTCCTCTTGGAGG AATCAGCTTCTGAGTCACCG 170
LOC_Os10g26060 GluA ACAAAGAGAAGGATGTGCTTAC ATTCTTTATCCGCATTGCCAAC 263
LOC_Os02g15178 GluB CAAGACAAACGCTAACGCCTTC TCGATAATCCTGGGTAGTATTG 194
LOC_Os02g15090 GluD AAAGACAATTTCGGACCCTACG TTAGGAACTGGTAACCCCGCTG 200
LOC_Os05g41970 Glb-1 AGGTTCCAGCCGATGTTCC CATGCTCTCCTCGTAGCTCCTC 135
LOC_Os07g10580 RM1 TTGTGCAGCAACTACAGCTG CGGAGCAATGTAGTAGTTAG 131
LOC_Os05g26480 Prol14 ACAACTCCAGCAGTTTGGTG CAAGGGTGGTAATGGTACTG 137
LOC_Os07g11360 RA GTTCTCGGTATTGCTCCTCGT GGCTGTAGACTTGGTGGTGGT 83
LOC_Os08g08840 OsGPT1 GCAAGCACTGAGGCCAATTTTG AAGGAACAAGAAACGAGCAACATAGAC 113
LOC_Os07g33910 OsGPT2-3 GGATTGAAGAAGACTCGATGCGA GGCTTGAATAATGCCATCTTGG 211
LOC_Os05g07900 OsBT1-1 CTGGAATCGGATGAAACTCGTGTA TCAGCAGAAATCAGTTATTGGACATG 149
LOC_Os02g10800 OsBT1-2 TGATTGTGCATGGGTGTGATG AACAGAGGAAATCGAATCCTACG 132
LOC_Os06g40050 OsBT1-3 TTGCTAGCGTCGGTCTCAAAG GCAATGATCAGCGAACGGAA 94
LOC_Os01g45910 OsNTT1 AGAGAGCGAAGCTACTGCAACTGA CCCACTGCAATCATTCTCCTACCT 112

植物生理学报796
实验结果
1 高温处理后水稻种子表型
灌浆期高温处理后, 种子垩白明显增加(图
1-A), 并对水稻种子重量有明显影响, 常温生长的
Dongjin种子千粒重为26.2 g, 而高温处理后减少到
24.6 g (表2)。高温处理后Dongjin籽粒粒长由平均
5.19 mm降到5.09 mm, 粒宽由平均2.84 mm降到
2.77 mm, 而粒厚则无明显变化(表2)。因此, 高温
处理造成的种子重量下降可能主要是由于籽粒粒
长和粒宽减少。总淀粉含量在高温处理后也明显
下降(图1-B), 由正常生长温度下的73%降低至高
温生长下的68%。灌浆结实期高温对稻米蛋白质
含量影响很大, 常温条件下Dongjin蛋白质含量为
7.57%, 高温条件下蛋白质含量增加到10.23% (图
1-C)。直链淀粉含量是受高温影响较大的一个指
标, 高温处理显著减低了直链淀粉含量。常温条
件下Dongjin直链淀粉含量为19.99%, 高温条件下
直链淀粉含量降为16.55% (图1-D)。从图1-E可以
看出高温处理后支链淀粉链长分布也有了明显的
表2 不同温度处理水稻籽粒粒长、粒宽、粒厚和千粒重
Table 2 Comparisons of seed width, thickness, length under
different filling temperatures
粒长/mm 粒宽/mm 粒厚/mm 千粒重/g
常温 5.19±0.09 2.84±0.11 2.14±0.07 26.2±0.2
高温 5.09±0.14 2.77±0.1 2.13±0.08 24.6±0.3

改变, DP10~20的短链减少, 而DP>20的中长链明
显增加。
图1 不同温度处理水稻籽粒总淀粉含量、总蛋白含量和直链淀粉含量和支链淀粉链长分布的差异
Fig.1 Comparison of grain weight, starch contents, apparent amylose content and the fine structure of amylopectin in Japonica
rice Dongjin under different filling temperatures
A: 种子外观; B: 总淀粉含量; C: 总蛋白含量; D: 直链淀粉含量; E: 支链淀粉链长分布; 所有数据测定均为3次重复。
以上结果表明: 灌浆期高温影响了稻米中储
藏物质的积累, 造成总淀粉含量下降和总蛋白含
量增加; 淀粉的结构和组成也发生变化。
2 高温胁迫下水稻胚乳贮藏物代谢相关基因的表
达模式
2.1 淀粉合成相关基因表达
淀粉合成的第一步是ADP葡萄糖焦磷酸化酶
(ADP-glucose pyrophosphorylase, AGP)将1-磷酸-
葡萄糖(G-1-p)和ATP转变成淀粉合成底物ADP-
Glc和ADP。对AGP的3个亚基AGPL2、AGPL3和
徐恒等: 灌浆期高温影响水稻胚乳储藏物质代谢相关基因表达的研究 797
AGPS2b基因的表达检测结果(图2)表明: AGPS2b
是在胚乳中表达丰度最高的AGP亚基基因, 能快
速响应高温胁迫, 在高温处理初期(高温处理1 d即
开花后6 d, D6)时表达量便迅速上升, 这种高表达
量虽然随着时间的推移慢慢减退, 但和对照处理
相比, 仍有明显升高; AGPL3基因在胚乳中表达丰
度最低, 它对高温的响应比AGPS2b略晚, 在高温处
理中期(高温处理5 d即开花后10 d, D10)时表达量
与对照处理相比有明显升高 , 之后逐渐回落。
AGPL2的表达受高温影响不大。种子中催化淀粉
合成起始的AGP基因在高温处理的前中期表达增
强表明高温处理前中期的淀粉合成可能会加速。
胚乳中有5种淀粉合成酶, GBSSI负责直链淀
粉的合成, SS (I-IV) (soluble starch synthase)负责可
溶性淀粉的合成。由图3可知, GBSSI和SSIIa基因
均受高温抑制, 且在高温处理中期(5 d)时表达差异
最大; 而SSI和SSIIIa基因表达受高温诱导, 属于早
期响应基因, 在高温处理初期(1 d)即表现为表达量
显著上调; SSIVb的表达几乎不受环境温度的影
响。
水稻淀粉去分支酶(starch debranching en-
zyme, DBE)可以分为异淀粉酶(isoamylase, ISA)和
糊精酶(pullulanase, PUL)。编码异淀粉酶的2个基
因ISA1和ISA2的表达对于高温的响应比较相似, 在
高温处理早期表达明显上调, 随着时间的推移表
达逐渐减弱, 至高温处理后期表达甚至低于对照
处理。糊精酶基因PUL和淀粉磷酸化酶(plastidial
starch phosphorylase)基因PHOL的表达总体来说是
受高温抑制的, 只是在高温处理的初期表达有略
微的上升(图4)。
两种淀粉分支酶(starch branching enzyme,
BE)基因BEI和BEIIb, 对高温响应模式不尽相同,
BEI基因的表达受高温快速诱导, 至高温处理的中
后期才开始出现下调; 而BEIIb基因的表达却一直
受高温抑制(图4)。
我们的结果显示淀粉合成相关的酶基因在高
温下的表达大致分为三种模式, 一种是高温下表
达受持续抑制或初期略有上调但之后明显抑制,
总体表现为下调, 例如GBSSI、SSIIa和BEIIb等; 一
种是高温处理初期表达明显上调, 后期逐渐回落,
如SSI、SSIIIa、ISA1和ISA2等; 最后一种是高温对
其表达几乎没有影响, 例如SSIVb基因。对绝大多
数淀粉合成相关基因, 高温处理的初期就已经开
始有明显的表达变化。
2.2 糖转运蛋白相关基因表达
糖相关的一些转运蛋白在水稻淀粉合成中起
着重要的作用, 一些质体上的糖转运蛋白在淀粉
合成代谢中参与碳流通。有3个基因编码葡萄
糖-6-磷酸/磷酸转运体(glucose 6-phosphate/phos-
phate translocator, GPT), 其中GPT1和GPT2-1在胚
乳的中表达量较高, 而GPT2-3表达量相对较低。
GPT1基因对高温的响应最为敏感, 在高温处理的
前期和中期明显上调, 中期之后逐渐回落, 直至与
对照相似。高温处理对GPT2-1和GPT2-3基因表达
的影响不大(图5)。
水稻中共有3个编码定位在淀粉体膜上的
图2 不同温度处理水稻灌浆胚乳中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的相对表达量差异
Fig.2 comparison of expression profiles for AGP-ase gene under different filling temperatures
植物生理学报798
图3 不同温度处理水稻灌浆胚乳中淀粉合成酶基因的相对表达量差异
Fig.3 comparison of expression profiles for starch synthase gene under different filling temperatures
图4 不同温度处理水稻灌浆胚乳中分支酶和去分支酶基因的相对表达量差异
Fig.4 comparison of expression profiles for starch branching enzymes and starch debranching enzymes gene under
different filling temperatures
徐恒等: 灌浆期高温影响水稻胚乳储藏物质代谢相关基因表达的研究 799
ADP-glucose转运蛋白基因(brittle-1 protein, BT1):
BT1-1、BT1-2和BT1-3。这3个基因在胚乳中表达
丰度有着很大的差异。BT1-3最高, 而BT-1和BT1-2
较低。这3个BT1基因表达响应高温的模式也不尽
相同。BT1-2和BT1-3类似, 在高温处理的初期明
显上调, 随着处理时间的延长, 逐渐回落至对照水
平。BT1-1基因在高温下一直处于表达略有下调
的状态。NTT (plastidic nucleotide transport protein)
基因编码质体膜上的ATP/ADP转运蛋白 , 水稻
NTT1基因的表达在高温处理前期略有下调, 中后
期与对照相比无明显变化。葡萄糖转运蛋白
(plastidic glucose translocator)基因GlcT的表达量在
高温处理前中期略有上调, 中后期回落并逐渐变
为下调(图5)。
综上结果表明, 对于大部分质体转运蛋白在
高温处理早期表达量上调, 而在高温处理中后期
出现回落甚至下调。
2.3 储藏蛋白相关基因表达
水稻中的谷蛋白 (g lu t e l i n , GLU)主要由
GLUA、GLUB、GLUD等基因编码, RM1 (Cys-rich
图5 不同温度处理水稻灌浆胚乳中糖转运蛋白基因的相对表达量差异
Fig.5 Comparison of expression profiles for starch metabolism-related plastidic translocator gene under
different temperature treatments
植物生理学报800
13-kDa prolamin)和PROL14 (cys-poor 13-kDa pro-
lamin)基因负责13-kDa谷醇溶蛋白的合成, RP10
(10-kDa prolamin)基因负责10-kDa富硫醇溶蛋白
的合成, GLB-1 (α-globulin)基因负责球蛋白的合
成, 种子过敏原蛋白RAG-1 (rice seed allergenic pro-
tein)基因负责14-16-kDa水稻白(清)蛋白的合成。
我们对高温下这些储藏蛋白相关基因进行了检测,
从图6中可以看出, 在检测的8个储藏蛋白基因中
GLUB、PROL14、GLUA、RP10和GLUD在种子
中表达量很高, 而GLB-1相对表达量较低。根据这
些储藏蛋白响应高温的表达模式的不同, 可以分
为三种类型。第一种类型如GLUB、RAG-1、RM1
和PROL14这几个基因在高温处理初期(1 d), 表达
量几乎不变, 随着处理时间增加, 表达量均出现明
显下调。第二种类型GLUA和RP10表达在高温处
理初期(1 d)和中期(5 d)时, 表达量几乎不变, 而在
高温处理后期开始出现明显上调。第三种类型谷
蛋白GLUD的表达在高温处理初期, 中期和后期,
其表达量都和对照比较相似, 基本不受高温处理
影响。
这一结果表明高温处理的中后期对种子储藏
蛋白相关基因的表达影响较大。
图6 不同温度处理水稻灌浆胚乳中储藏蛋白基因相对表达量差异
Fig.6 comparison of expression profiles for seed storage proteins gene under different filling temperatures
讨　　论
ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成过程中
的第一个酶, 它在淀粉合成过程中起着关键作用,
是淀粉合成途径中的限速酶。大量研究表明AGP
为异源四聚体, 它包含2个大亚基(APL; 51 kDa)和
2个小亚基(APS; 50 kDa) (Okita等1990)。这些基
因的表达受到严格的时空调控, 编码大亚基的多
个基因的表达具有很强的特异性, 其表达只限于
某些特定的组织或者受到特定的条件诱导。小亚
基OsAGPS2b和大亚基OsAGPL2是胚乳中淀粉合
成中起主要作用的2个亚基(Lee等2007)。本研究
的结果显示OsAGPS2b基因在胚乳中表达丰度最
高且能被高温快速诱导并持续较高水平的表达,
OsAGPL3基因在胚乳中表达丰度不高但也受高温
强烈诱导。AGP作为淀粉合成的限速酶, 它的部
分亚基在高温下表达明显增强可能是促使高温下
前期种子灌浆速率明显加快的一个重要原因。
水稻中的淀粉合成酶基因可分为5个亚族10
个基因, 在水稻胚乳中SSI、SSIIa、SSIIIa、SSIVa
和GBSSI表达量较高(Hirose等2004; Ohdan等
2005)。负责直链淀粉合成在GBSSI基因在高温下
的表达受抑制, 与高温条件下Dongjin籽粒直链淀
粉含量下降相符合。可溶性淀粉合成酶SSIIa基因
徐恒等: 灌浆期高温影响水稻胚乳储藏物质代谢相关基因表达的研究 801
的表达同样也受高温抑制, 而SSI和SSIIIa的表达量
在高温处理早期受到高温诱导, 而后期则明显下
降, 推测这与高温下灌浆前期种子灌浆速率明显
提高, 而最终种子中总淀粉含量明显下降直接相
关。
水稻胚乳中淀粉分支酶主要有BEI和BEIIb。
我们的结果显示BEIIb的表达量在高温下受抑制,
这与Jiang等(2003)用Northern blot分析方法获得的
结果类似。BEIIb缺失突变体水稻的支链淀粉中缺
少短侧链而富含长侧链, 垩白程度较重(Nishi等
2001)。BEIIb基因表达低于50%时, 垩白更为明
显。当转入野生型BEIIb后, 垩白性状恢复至野生
型(Tanaka等2004)。因此高温处理下水稻成熟籽
粒垩白增加以及支链淀粉中缺少短侧链而富含长
侧链的可能原因之一是BEllb表达量下调。
除了分支酶参与支链淀粉的合成外, 去分支
酶DBE也参与了支链淀粉的合成和去分支过程
(James等1995; Nakamura等1996)。水稻中普遍存
在2种去分支酶: isoamylase (ISA)和pulluanaese
(PUL)。在本研究中2个ISA基因(ISA1和ISA2)及
PUL基因的表达对于高温的响应比较相似, 在高温
处理早期表达明显上调, 随着时间的推移表达逐
渐减弱 , 至高温处理后期表达甚至低于对照处
理。高温灌浆结实期高温影响了DBE基因的表达,
从而影响了DBE对淀粉分支的修饰, 可能是导致
高温条件下水稻胚乳淀粉链长分布改变的原因。
总体来说, 高温条件下, 除了GBSSI, SBEIIb等少数
几个基因的表达持续受抑制外, 胚乳中大部分淀
粉合成相关基因在高温处理的前中期表达上调,
从而使灌浆速率(或淀粉合成速率)加快; 而高温条
件下叶温过高常常使光合效率降低, 合成淀粉的
原料供应不足, 从而导致淀粉粒之间空隙增大形
成气泡, 最终形成垩白。而高温处理后期淀粉合
成相关基因表达的迅速下降导致灌浆不足、最终
造成淀粉积累量下降、直链淀粉含量下降、淀粉
粒结构变化和稻米品质下降。
糖相关的一些质体转运蛋白在淀粉合成代谢
中参与碳流通, 在水稻淀粉合成中起着重要的作
用。本研究中检测的一些在水稻胚乳表达量较高
(推测可能在胚乳中起重要作用)的转运蛋白基因,
例如葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体(GPT1, GPT2-1)、
ADP-glucose转运体BT1-3和葡萄糖转运蛋白
(GlcT), 在高温处理的早中期表达明显上调, 而在
高温处理的中晚期表达迅速下降。这一表达模式
与大多数淀粉合成酶基因及淀粉合成起始基因的
表达模式一致, 它们一起促成了高温处理前中期
灌浆速率加快。而后期高温处理下这些基因表达
量的迅速下降导致灌浆不足．淀粉积累量下降。
蛋白质是水稻籽粒中仅次于淀粉的储藏物
质。我们的结果显示编码13-kDa醇溶蛋白的RM1
和PROL14基因在高温下变化最为显著, 高温处理
后 , 这2个基因的表达明显受到抑制。这与Ya-
makawa等(2007, 2010)报道的高温水稻种子中13-
kDa的醇溶蛋白含量明显降低的结果是相符的, 并
从分子水平进一步解释和验证了这一现象。另外,
种子过敏原蛋白基因RAG-1的表达也明显受高温
抑制。谷蛋白在稻米储藏蛋白中占了主要比例,
谷蛋白基因对高温胁迫的响应不尽相同。GLUA
在高温处理早期略有下调, 而在高温处理中后期
则明显上升。GLUB的表达受高温抑制明显。
GLUD的表达基本不受高温影响。虽然灌浆期高
温会造成籽粒总蛋白含量增加, 但是本研究中多
数储藏蛋白基因的表达在高温处理后抑制。而一
些芯片数据也表明高温处理后, 大部分储藏蛋白
的基因表达量受到抑制(Yamakawa等2007; 韦克苏
等2010)。我们推测高温下水稻籽粒中粗蛋白总量
增加可能并不一定和蛋白质合成能力的增强所引
起的, 可能是高温下淀粉和脂肪等储藏物含量降
低明显, 从而导致蛋白相对含量上升。
另外, 我们的研究还发现淀粉合成酶基因受
高温影响一般表现在处理的初期, 而蛋白合成基
因大多数是在处理初期变化不明显, 而到高温处
理的中后期有了明显的上调或下调, 这一结果表
明开花后5~10 d之内的高温对种子中的淀粉合成
影响较大, 而开花后10~15 d之内的高温可能对种
子中蛋白合成的影响较大。
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