全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 829~831 829
收稿 2013-04-25　　修定 2013-06-24
资助 国家自然科学基金(31000723)和湖南省普通高等学校教学
改革项目(湘教通[2012]401号)。
* 通讯作者(E-mail: ymljack@126.com; Tel: 0731-58291416)。
一种植物组织原花色素显微观察的冰冻切片方法
严明理*, 刘丽莉, 王帅斌, 药园园
湖南科技大学生命科学学院, 湖南湘潭411201
摘要: 本文介绍了一种适合于植物组织原花色素观察的冰冻切片方法。采用酸性香草醛或对二甲氨基肉桂醛溶液对植物
组织中的原花色素类物质进行染色, 于–80 ℃冰冻30 min后, –20 ℃下切片。这种方法能够快速观察到原花色素在细胞中的
分布, 并为观察植物组织中易溶于丙酮和醇类的物质提供简便和快速的切片技术。
关键词: 原花色素; 冰冻切片; 显微观察

A Suitable Cryo-Sectioning Method for Visualizing Proanthocyanidins in Plant
Tissues by Light Microscopy
YAN Ming-Li*, LIU Li-Li, WANG Shuai-Bin, YAO Yuan-Yuan
School of Life Science, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan, Hunan 411201, China
Abstract: This research provides a new cryo-sectioning technique for visualizing proanthocyanidins-containing
elements in plant tissues. The procedure consisted of steps as follows. First, the proanthocyanidins were stained
by vanillin acidic solution or p-dimethylaminocinnamaldehyde acidic solution. Then the samples were frozen at
–80 ℃ for 30 min and sectioned at –20 ℃. The distribution of proanthocyanidins in cells could be quickly
observed after applying this method. This described sectioning method is suitable for visualizing the substances
which are more or less soluble in acetone-water and hydroalcoholic mixtures.
Key words: proanthocyanidins; cryo-sectioning; light microscopy
植物组织冰冻切片作为一种快速、高效的技
术, 可以缩短常规石蜡切片复杂的处理过程, 减少
对样品组织结构的损伤。在细胞免疫化学和原位
杂交等研究中, 冰冻切片能更好地保持细胞内生
物分子的活性, 冰冻切片技术在动物和人体的组
织研究中已被广泛应用, 但在植物领域中对用于
观察易溶于丙酮和醇类的物质的冰冻切片技术报
道不多(陈丹和赵洁2005; 刘剑锋等2006; 宁代锋等
2008)。
原花色素(proanthocyanidin)属于类黄酮, 也称
为缩合单宁(condensed tannin), 在芥菜、葡萄和苹
果等的种子和果实中都有原花色素存在(Wolfe等
2003; Sano等2013; Yan等2011)。原花色素对人类
的营养和健康有重要的作用, 在抑制癌症和心血
管疾病方面有一定的效果, 能抑制DNA和蛋白质
的氧化损伤, 对炎症和过敏反应等也有一定的疗
效(Bagchi等2003; Tsao等2005; Stevenson和Hurst
2007; Liu等2012; Aron和Kennedy 2008)。由于原
花色素需求量迅速增加, 因此寻找高含量的产原
花色素的植物和研究原花色素在植物中的分布非
常必要。
原花色素在植物体内未被氧化时是无色的,
能同酸性香草醛(vanillin)溶液反应产生红色产物,
也能同酸性对二甲氨基肉桂醛(p-dimethylamino-
cinnamaldehyde, DMACA)溶液反应产生蓝色产物
(Li等1996; Debeaujon等2000)。由于原花色素易溶
于丙酮和醇类溶液, 在显微观察时, 不宜采用传统
的石蜡切片和脱水方法, 因此需要寻找一种植物
材料非固定的切片方法。为了解决植物组织原花
色素易溶于丙酮和醇类溶液的问题, 有些研究报
道把植物组织中的原花色素与咖啡因(caffeine)或
外源蛋白反应形成不溶于乙醇的复合物(Debeau-
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报830
jon等2000; Brillouet和Escoute 2012), 然后再脱水
包埋, 但这些操作相对比较复杂, 耗时较长, 植物
组织的原花色素会迁移。目前有关原花色素原位
观察的冰冻切片研究尚未见报道。
芥菜型油菜NILA的种皮中含原花色素(Yan等
2011), 我们以此为材料, 通过优化染色和切片条
件, 找到了一种快速且灵敏度较高的切片方法, 在
光学显微镜下就可以很清楚地观察到原花色素在
植物组织中的分布。
材料与方法
材料为授粉后20 d的芥菜型油菜NILA (Bras-
sica juncea L.)幼嫩种子。
采用能与原花色素结合的染料香草醛或
DMACA, 参照文献(Li等1996; Debeaujon等2000;
Sharma和Dixon 2005)的方法进行染色, 并将染色
环境改为较弱酸性。香草醛溶液配制时, 把0.5 g香
草醛(Sigma)加入100 mL的2 mol·L-1盐酸中, 充分
溶解。配制DMACA溶液时, 把0.1 g DMACA (Sig-
ma)加入50 mL的3 mol·L-1盐酸中, 充分溶解, 然后
加入浓度为55%的乙醇50 mL。
把授粉后20 d的芥菜型油菜种子放在载玻片
上, 分别用上述溶液完全覆盖种皮, 在常温下染色
15~20 min, 用吸水纸吸干染色液。把染好色的种
子放在滴有普通胶水的样品架上, 立即放到–80 ℃
的超低温冰箱中30 min, 使材料迅速冷却并固着在
样品架上。然后把样品架放在–20 ℃预冷的YD-
190冰冻切片机(中国金华益迪医疗设备厂生产)内
进行切片, 切片厚度为20~30 μm, 用干净的载玻片
接住切片并立即在显微镜(Olympus)下观察。
结果与讨论
选取种脐部分进行显微观察的结果表明, 切
片中能看到不同层细胞, 香草醛与原花色素结合
产生的红色物质(图1-A)及DMACA与原花色素结
合产生的蓝色物质(图1-B)均清晰可见, 由此很容
易发现原花色素分布的细胞层。
冰冻切片法的优点在于快速简便、易操作,
而且适用于细胞免疫化学和原位杂交等的研究。
此法不需要样品经过长时间的脱水包埋, 能保证
细胞内物质的稳定性, 更好地反映样品的实际情
况。绝大多数植物新鲜样品都有大量的水分, 水
分在样品的冰冻过程中极易形成冰晶, 从而破坏
细胞结构。由于常规冰冻切片法无法解决这一问
题, 本研究采用–80 ℃快速冷冻, 使植物样品基本
保持良好的结构(图1)。
在以前的原花色素检测中, 一般都采用较高
浓度盐酸的DMACA溶液或香草醛溶液(Li等1996;
Brillouet和Escoute 2012; Sharma和Dixon 2005), 但
本研究中所用的授粉后20 d的芥菜型油菜种子非
常幼嫩, 强酸性环境容易使其组织软化腐烂, 无法
辨认细胞层次; 而染色溶液的酸度过低, 原花色素
图1 芥菜型油菜授粉后20 d的种子切片
Fig.1 Sections of B. juncea seed at 20 d after pollination
A: 香草醛染色; B: DMACA染色。SC: 种皮; Em: 胚; P: 原花色素分布的部位。标尺=15 μm。
严明理等: 一种植物组织原花色素显微观察的冰冻切片方法 831
不易染上色且染色时间加长。因此, 我们调整了
染色时的盐酸浓度, 使幼嫩植物组织中的原花色
素能染上色, 但组织又不发生腐烂。对于幼嫩植
物器官而言, 由于器官中含水量高, 切片太薄不易
成片, 切片太厚则不适宜观察, 本研究经多次优化
选择了20~30 μm的厚度, 刚好能够看到每层细
胞。本文结果为产原花色素植物的寻找和原花色
素在细胞中的初步定位提供了一种简单而快速的
方法, 如果要求更精确, 则还需要选用适合的包埋
和切片方法。
参考文献
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