全 文 ：第 28卷第 1期
2008年 2月
林　产　化　学　与　工　业
ChemistryandIndustryofForestProducts
Vol.28 No.1
Feb.2008
余甘子树皮提取物抗氧化及清除
自由基活性初步研究
　　收稿日期:2007-08-10
　　基金项目:国家 “十一五 ”科技支撑计划(2006BAD18B0403)
　　作者简介:汪咏梅(1964-),女 ,浙江义乌人 ,副研究员 ,主要从事植物资源化学利用研究
　＊通讯作者:陈笳鸿 ,研究员 ,主要从事植物资源化学利用研究;E-mail:chen-jiahong@163.com。
WANGYong-mei　
汪咏梅 , 陈笳鸿＊ , 吴冬梅 , 徐 曼 , 吴在嵩
(中国林业科学研究院林产化学工业研究所;国家林业局林产化学工程
重点开放性实验室 , 江苏 南京 210042)
摘　要:　余甘子树皮提取物的主要成分为局部棓酰化的聚原翠雀定-原花青定混合物 ,具有强抗
氧化活性的化学结构特征。试验结果表明 , 采用超声波强化提取 、冷冻絮凝沉降和大孔树脂吸附等
方法提取分离获得的目标产物对 1, 1-二苯基-2-苦基-肼(DPPH)自由基的清除效率平均达
91.13%, 略高于茶多酚;对金属离子 Fe2+的络合能力达 358mg/g;抑制脂质过氧化能力强于马尾松树皮提取物。研究
表明余甘子树皮提取物可望进一步开发成为新型天然抗氧化及自由基清除剂。
关键词:　余甘子;树皮提取物;原花色素;抗氧化剂;清除自由基
中图分类号:TQ91　　　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:0253-2417(2008)01-0011-05
PrimaryStudyonAntioxidativeandRadicalScavengingActivitiesof
ExtractsfromPhylanthusemblicaL.Bark
WANGYong-mei, CHENJia-hong, WUDong-mei, XUMan, WUZai-song
(InstituteofChemicalIndustryofForestProducts, CAF;KeyandOpenLab.on
ForestChemicalEngineering, SFA, Nanjing210042, China)
Abstract:ThemajorcomponentofextractsfromPhylanthusemblicaL.barkiscomposedofpartiallygalloylatedpolymericpro-
delphinidinsandprocyanidinswhichindicatestrongantioxidativecharacterfromtheirchemicalstructure.Experimentaldata
showedthatthetargetproduct, preparedbyultrasonicextractionandpurification, couldscavengeradical(e.g.DPPH, scaven-
gingrate91.13%, higherthanwhichofteapolyphenol(TP)), complexmetalions(e.g.Fe2+, 358mg/g)andinhibitlipid
peroxidation.Thisprimarystudyresultsindicatedthattheextractswouldbehopefulydevelopedasanewsortofnaturalantioxi-
dantandradicalscavengingagent.
Keywords:PhylanthusemblicaL.;barkextracts;proanthocyanidins;antioxidant;radical-scavenging
余甘子(PhylanthusemblicaL.)又名余甘 、油柑 ,大戟科叶下珠属乔木或灌木 ,我国主要产区分布于
福建 、江西 、台湾 、广东 、海南 、广西 、四川 、贵州和云南等省区 ,国外分布于印度 、斯里兰卡 、中南半岛 、印
度尼西亚 、马来西亚和菲律宾等国[ 1] 。余甘子果实具有清热 、凉血 、消食健胃 、生津止咳 、抑菌等药用功
能 [ 2] ,可加工成为食品 、饮料 、保健品 、药品和化妆品 [ 3] 。余甘子树皮是我国栲胶产品的生产原料之一 ,
含单宁 30% ～ 40%[ 4-5] 。余甘子树皮单宁属原花色素类 ,主要成分为局部棓酰化(约 25%)的原翠雀
定-原花青定(3∶1)混合物 [ 6-7] 。近年来关于余甘子资源开发利用主要围绕余甘子人工栽培和果实的加
工利用 ,从其树皮中提取具有抗氧化及清除自由基功能的生物活性物质尚未见报道 。众多研究已确认
原花色素(proanthocyanidins)类植物多酚具有抗氧化及清除自由基的生物活性 [ 8-9] 。从葡萄籽 、松树皮
提取原花青定(原花青素)已有大量报道。原花色素属黄烷-3-醇化合物 ,其生物活性的强弱与分子中
12　 林　产　化　学　与　工　业 第 28卷
的酚羟基的数量及其取代位置有关 [ 10-11] 。B环上相邻的酚羟基多则活性强;C环上羟基的局部棓酰化
也使活性增强。由此分析 ,以局部棓酰化的原翠雀定为主要成分的毛杨梅树皮原花色素 、余甘子树皮原
花色素与以原花青定为主要成分的松树皮原花色素相比 ,应具有更强的抗氧化 、清除自由基的生物活性
功能。作者对毛杨梅树皮提取物和余甘子树皮提取物的制备方法及其生物活性功能进行了试验研究 ,
前者的研究结果已见报道 [ 12]并取得国家发明专利 [ 13] ,本文作者继续报道余甘子树皮提取物的抗氧化
及清除自由基活性功能的研究 。
1　实 验
1.1　原料和主要试剂
余甘子树皮 ,广西武鸣栲胶厂提供 ,经净化 、粉碎(1 ～ 2mm),含水分 16%,含单宁 36.8%(干基)。
AB-8型大孔吸附树脂 ,天津南开大学化工厂 。 1, 1-二苯基-2-苦基-肼(DPPH),美国 Sigma公司。茶
多酚(TP-95,质量分数 95.43%),其中儿茶素 63.1%, EGCG40.92%,浙江派诺生物技术有限公司。
儿茶素(质量分数 92.7%),水分 2.96%,安徽歙具茶叶生物碱厂 。马尾松树皮提取物 ,原花青素质量
分数 90.7%(正丁醇 /盐酸法测定)。食用调和油 ,饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸之比为 1∶7.4,其中抗氧
化剂 TBHQ质量分数为 0.01%,市售。Tween-60,上海助剂厂。壳聚糖 、乙酸 、香兰醛 、盐酸 、正丁醇 、甲
醇 、硫酸亚铁铵等均为国产分析纯试剂 ,水(一级水)。
1.2　主要仪器设备
主要仪器:KH-200 DB型数控超声波处理机 ,昆山禾创超声仪器有限公司;层析柱:玻璃 , 内径
29mm,长 500mm(AB-8型大孔吸附树脂 ,装柱体积(BV)为 235mL);SENCO-R型旋转真空蒸发器 ,上
海申生科技有限公司;数显水浴恒温振荡器 , SHA-CA型 ,江苏荣华公司;FD-1型冷冻干燥机 ,日本
EYELA公司;Nicolet-FT-IR550型红外光谱仪 ,美国;UV/VISLambda-6型紫外 /可见分光光度计 ,美国
PerkinElmer公司。
1.3　制备方法
1.3.1　超声波强化提取　树皮 320g,用水作提取剂 。树皮与水 1∶5(g∶mL)。超声波频率 20kHz,功
率 200W。提取温度 50 ～ 55℃,提取时间 1h。过滤去渣 ,得滤液。
1.3.2　絮凝沉降处理　在强搅拌下趁热向 1.3.1节制得的滤液中滴加 1%壳聚糖-乙酸溶液(壳聚糖
用量为树皮粉质量的 0.05%)。冷至室温后置于约 5℃冰箱内静置 24h,分出上层清液 ,测定浓度并
计算固含量 。
1.3.3　活性炭吸附处理　在 1.3.2节制得的清液中投入活性炭(固含量的 20%)和 EDTA-2Na(固含
量的 0.5%),在搅拌下升温至 80 ～ 85℃,处理 0.5h。过滤去炭 ,测滤液浓度 ,待作树脂吸附分离的上
柱液。
1.3.4　树脂吸附分离　对层析柱先按树脂使用要求进行预处理(醇洗 、碱洗 、酸洗 、水洗)。用 2.2BV
量上柱液(质量分数为 3.6%)以 1.75BV/h速率正向走柱;用水以 2BV/h速率洗柱至洗出液无色;用
2.2BV量的 70%(体积分数)的乙醇以 1.75BV/h速率洗脱得产物的乙醇溶液;减压蒸除乙醇;真空冷
冻干燥得粉状目标产物。
1.4　鉴别方法
1.4.1　原花色素反应　采用 Porter法 [ 14] 。在带有空气冷凝管的烧瓶中按比例将产物试样的甲醇溶液
与正丁醇-盐酸(95∶5,体积比)、 2%硫酸铁铵(溶于 2mol/L盐酸溶液)混合 ,在 95℃下反应 40min。
取出后冷却至室温。观察反应液的颜色 ,生成深红色花色素 ,表明产物为原花色素。用分光光度计测定
其最大吸收波长 λmax。
1.4.2　紫外分光光度法测百分吸收系数　紫外百分吸收系数是物质的一种特性常数。配制质量分数
为 0.003 88%的产物-甲醇溶液 ,用 1cm比色皿在 277nm处测定吸光值。计算百分吸收系数(E1%1cm),
与原花色素文献值进行对比。
第 1期 汪咏梅 ,等:余甘子树皮提取物抗氧化及清除自由基活性初步研究 13　
1.4.3　产物的红外光谱　KBr压片 ,对产物作红外谱图进行比较和鉴别。
1.5　原花色素含量的测定方法
测定产物中原花色素含量应采用正丁醇-盐酸法较为适合 ,但因试验时未获得适合的原花色素标准样
品而采用香草醛-盐酸法测定。 0.05g(准确至 0.000 1g)产物溶于 100mL甲醇作为试液。在用铝箔遮光
的容量瓶内加入 4%香草醛-甲醇溶液 6mL,浓盐酸 3mL和试液 1mL,混合后在(20±2)℃下静置
15min;立即以甲醇为参比在 500nm处测吸光值 。同时做空白试验。按儿茶素对照样直线方程计算原花
色素含量。儿茶素对照样的直线方程按上述方法通过测定不同质量浓度(0.2×10-4 ～ 1×10-4 g/mL)儿
茶素-甲醇溶液的吸光值获得。其一元回归方程为:A=16.525×103c+0.146 1, r=0.999 5。
1.6　生物活性功能测定方法
1.6.1　清除自由基能力的测定　现代医学研究表明 ,人类多种疾病常与体内过剩的 、有害的自由基有
关 。以 DPPH自由基为清除目标 ,进行目标产物的清除自由基体外试验 。原理是 DPPH自由基与清除
剂提供的电子配对结合 ,使 DPPH的特征紫色消失 ,从而评定清除剂的活性。试验方法:配制 DPPH-甲
醇溶液和清除剂(目标产物试样)-甲醇溶液 ,按一定比例混合后在 λ517nm处(以甲醇为参比)跟踪测
定吸光值。当吸光值持续下降至恒定不变时 ,记录时间(tS)和吸光值(AS)。计算清除效率(ES, %)和
清除速率(VS, mg/(g·min))。按上述同样方法对常用自由基清除剂茶多酚(TP)进行对比试验 。
ES=(A0 -AS)/A0 ×100%;　　VS=(m1 ×ES)/(m2 ×tS)
式中:A0—不加清除剂的 DPPH溶液的吸光值;m1—试液中 DPPH的质量 , mg;m2—试液中清除剂的质
量 , g;tS—达到吸光值恒定时需要的时间 , min。
1.6.2　络合金属离子能力的测定　以 Fe2+为试验对象。原花色素多酚与 Fe2+的络合物呈蓝色 ,其最大
吸收波长位于 500 ～ 600nm处 [ 15] 。用硫酸亚铁配制离子质量浓度为 0.482 0g/L的 Fe2+试液和质量浓
度为 1.002g/L的目标产物水溶液 。在每份 5mL的目标产物水溶液中分别加入 0、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、
3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0mL的 Fe2+试液 ,再用水定容至 10mL。在常温下分别振荡 15min,在 578nm处
分别测定吸光值(A)。A值持续增大直至恒定不变 ,表明产物与 Fe2+的络合已达到饱和 ,记录加入目标
产物水溶液的毫升数 ,由此计算络合 Fe2+的能力 。
1.6.3　抑制油脂氧化能力的测定　以市售食用调和油为试验底物 ,为排除干扰 ,试验前先按文献 [ 16]
方法用乙醇-水萃出其中的抗氧化剂 TBHQ。在锥形瓶内精确加入 12mg目标产物(底物的 0.04%),
溶于 6mL的 40%乙醇中;加入 30g底物油和 40mgTween-60,乳化 。同时配制空白试液 、马尾松树皮
提取物试液和茶多酚试液作对比试验 。将各试液同置于(60±2)℃恒温振荡水浴内 ,每 6h取样一次测
定过氧化值(VPO)[ 17] 。分别计算各试液对油脂氧化的抑制率(EI):EI=(VPO空白 -VPO试样)/VPO空白 。
2　结果与讨论
2.1　提取分离效率
考虑原花色素类植物多酚的易氧化和热敏性 ,试验中采用较温和的条件下(50 ～ 55℃)辅以超声波强
化的提取手段 ,借助超声波的空化作用缩短提取时间。采用水作为提取剂 ,因为研究者普遍认为水溶性较
好的低聚原花色素呈现较强的生物活性 ,而且有成本低廉 、操作安全和利于后续操作的特点。 320g余甘
子树皮 ,提取 、去渣后 ,滤液用壳聚糖絮凝沉降分离去除树胶 、多糖和高聚单宁等 ,得到 1 100mL清液 ,固含
量为 6.5%,得率 22.3%。根据作者以往对毛杨梅树皮提取的经验 ,此效果属中等水平。由于本试验研究
的主要目的是验证余甘子树皮提取物的抗氧化及清除自由基活性 ,故未对提取工艺条件作进一步的优选。
清液经活性炭处理和树脂吸附分离得到的目标产物中含原花色素 97.3% ～ 101.4%(香草醛-盐酸法 ,以
儿茶素为对照样)。由于香草醛-盐酸法不能区分聚原花色素和在产物中存在的单体 ,测值往往偏高 ,测定
结果只用于表示产物分离的效果 ,不能确切地表示产物的纯度。
2.2　目标产物的鉴别结果
2.2.1　原花色素反应　按 1.4.1节 ,对目标产物进行正丁醇-盐酸原花色素反应 ,观察到生成物溶液呈
14　 林　产　化　学　与　工　业 第 28卷
典型的红色;最大吸收波长(λmax)550nm,表明目标产物属原花色素。
2.2.2　紫外百分吸收系数　按 1.4.2节 ,用紫外分光光度法测定目标产物的紫外百分吸收系数为
155,与文献 [ 7]报道余甘子树皮原花色素的值相近 ,表明目标产物为预期的原花色素。
图 1　目标产物的红外光谱图
Fig.1　IR-spectrumoftheproduct
2.2.3　红外光谱 　按 1.4.3,测得目标产物的红外光谱图
(见图 1)。由图 1可见具有下列特征吸收:在 1534cm-1处属
于 B环伸缩振动吸收;在 729和 736cm-1处的吸收属 B环
C—H面外弯曲振动;在 1030、 1200、 1336cm-1的吸收应属于
C—H面内弯曲振动;在 1691cm-1有属于 C O伸缩振动吸
收 ,表明有棓酰酯存在 。以上特征吸收与文献 [ 7, 18]报道相
符 ,证明目标产物的主要成分是局部棓酰化的原翠雀定 -原
花青定混合物。
2.3　目标产物的生物活性功能
2.3.1　清除 DPPH自由基能力　按 1.6.1节 ,进行目标产物
和 TP的清除 DPPH自由基体外试验 ,结果表明目标产物有较强的清除自由基活性(见表 1)。
表 1　清除 DPPH自由基的效果
Table1　ScavengingefficiencyonDPPHradical
m(DPPH)∶m(清除剂)
m(DPPH)∶m(scavenger)
吸光值恒定需要的时间 /min
timeatconstantabsorbence
目标产物
product
茶多酚
TP
清除效率 /%
scavengingeficiency
目标产物
product
茶多酚
TP
清除速率 /(mg·g-1·min-1)
scavengingrate
目标产物
product
茶多酚
TP
1.25∶0.70 2 2 91.8 90.6 820 809
1.25∶0.56 3 2 91.4 90.6 680 1011
1.25∶0.42 7 2 90.2 89.0 384 1324
从表 1可见 ,在试验条件下目标产物对 DPPH自由基的清除效率平均为 91.13%。在相同质量比
的情况下 ,目标产物和茶多酚对 DPPH的清除效率处于同一水平 ,前者略高于后者 。当加入清除剂量相
对较少时 ,茶多酚的清除速率快于目标产物。原因可能由于测定是在试液静止状态下进行 ,分子的扩散
速度和分子结构所导致的空间位阻会产生影响 ,分子相对较小的茶多酚与 DPPH的反应会快于聚合度
相对较高的目标产物 。研究者通常以清除剂的半抑制浓度(EC50)值的大小来衡量清除剂的能力强弱。
也有研究者 [ 19]认为 ,单纯用 EC50不足以表征清除剂的能力 ,提出引入清除时间因素 ,以 EC50与达到半
抑制的时间(tEC50)乘积的倒数来表示抑制效率。本研究提出用自由基清除速率(即单位质量的清除剂
平均在 1min内清除的自由基的质量)作为衡量清除剂能力强弱的特征值 ,以反映清除剂与自由基的质
量比与清除速率之间的影响关系。
表 2　目标产物络合 Fe2+的能力
Table2　ComplexingabilityoftheproducttoFe2+
试验序号
testNo.
Fe2+试液加入量 /mL
Fe2+solutiondosage
吸光值
absorbency
1 0 0.018
2 1.0 0.329
3 1.5 0.358
4 2.0 0.389
5 2.5 0.424
6 3.5 0.490
7 4.0 0.588
8 4.5 0.587
9 5.0 0.588
2.3.2　络合金属离子的能力　过渡金属离子 ,例如铁
的不同氧化态(Fe3+、 Fe2+),能引发和催化脂质过氧化
反应。原花色素类多酚具有络合多种金属离子的能
力 ,从而可抑制或阻断脂质氧化的链式反应。按1.6.2
节方法 ,试验结果表明目标产物与 Fe2+络合物呈蓝
色 ,用分光光度计实测其最大吸收波长 (λmax)
578nm,与文献 [ 9]报道的原花色素-铁络合物相符。
在目标产物水溶液中 ,逐次递增加入亚铁试液并跟踪
测定吸光值 ,到加入 4mL后吸光值不再增加 ,表示已
达到饱和络合 (见表 2)。由此计算得每克产物络合
Fe2+能力为 385mg,表明产物具有较强的清除铁离子
能力。
第 1期 汪咏梅 ,等:余甘子树皮提取物抗氧化及清除自由基活性初步研究 15　
2.3.3　抑制脂质氧化能力　按 1.6.3节 ,分别对目标产物 、马尾松树皮提取物(PC)和 TP的抗氧化能力
进行对比试验。由于 3种试样均为植物多酚 ,难于在油中溶解和均匀分散 ,试验中添加了适量 Tween-60,
在(60±2)℃恒温水浴中采取振荡手段使试样的醇-水溶液与油乳化。每 6h分别取样测定 VPO(以meq/kg
计),计算每个时间段各试样的 EI并进行比较。测定值见表 3(表中 VPO均为两次平行试验的平均值)。
表 3　抑制脂质氧化的效果
Table3　Inhibitionefficiencyoflipidoxidation
加入试样　　
samplesadded　　
0～ 6h
VPO/
(meq·kg-1) EI/%
7 ～ 12h
VPO/
(meq·kg-1) EI/%
13～ 18h
VPO/
(meq·kg-1) EI/%
19 ～ 24h
VPO/
(meq·kg-1) EI/%
空白 blank 4.23 6.12 9.65 15.35
产物 product 3.65 13.7 4.31 29.6 4.16 56.9 4.62 69.9
马尾松树皮提取物
extractsofmassonpine
bark
3.69 12.8 4.04 34.0 4.46 53.8 5.67 63.1
茶多酚 TP 3.89 8.0 3.91 36.1 3.79 60.7 4.33 71.8
　　由表 3测定值可见 ,目标产物对脂质氧化有较强的抑制作用 。表中各时间段 VPO变化出现某些不规
律性 ,原因可能是由于试样不能在油脂中完全均匀分散 ,因此以整个时间段(24h)的总效果衡量就比较
清晰。各试样对脂质氧化的抑制能力强弱为:马尾松树皮提取物 <目标产物 <茶多酚 。
3　结 论
余甘子树皮提取物的主要成分为局部棓酰化的原翠雀定-原花青定混合物;采用超声波强化提取 、
冷冻絮凝沉降和大孔树脂吸附等方法提取分离获得的目标产物对 DPPH自由基的清除效率平均达
91.13%,略高于茶多酚(TP);对金属离子 Fe2+的络合能力达 358mg/g;抑制脂质过氧化能力强于马尾
松树皮提取物。研究表明 ,目标产物具有较强的抗氧化及清除自由基的活性功能 。研究结果尚未见有
相关报道 ,可为以余甘子树皮提取物为原料进一步开发新型天然抗氧化剂提供理论与技术基础 。
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