全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月 441
收稿 2010-01-15 修定 　2010-04-29
资助 “十一五 ” 科技支撑项目(2006BAD07A04)和国家自然
科技资源平台项目(2 00 5D KA21 40 3)。
* 通讯作者(E-mail: yinghsu@263.net; Tel: 028-85417281)。
一个麻疯树胞质 II类小热激蛋白基因 JcHSP17.5的克隆和异源表达
朱勋路, 朱习红, 辜小苹, 徐莺 * , 陈放
四川大学生命科学学院, 成都 610065
提要: 从麻疯树胚乳cDNA文库中得到分子量大小约为17.5 kDa的细胞质II类小热激蛋白基因, 命名为JcHSP17.5, GenBank
登录号为GU320741。通过构建外源表达载体, 将JcHSP17.5基因分别在大肠杆菌以及酿酒酵母中过量表达来研究基因的
耐热和耐渗透压胁迫能力, 发现两种重组菌在逆境下都较对照组生活力有显著提高。推测JcHSP17.5在麻疯树生长过程中
可能与麻疯树耐热、耐旱以及耐离子胁迫相关。
关键词: 麻疯树; 小热激蛋白; 基因表达; 耐热; 耐渗透压
Cloning and Heterologous Expression of a Cytosolic Class II Small Heat Shock
Protein Gene (JcHSP17.5) from Jatropha curcas L.
ZHU Xun-Lu, ZHU Xi-Hong, GU Xiao-Ping, XU Ying*, CHEN Fang
College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China
Abstract: JcHSP17.5, an approximately 17.5 kDa cytosolic class II small heat shock protein (HSP) gene was
cloned from a Jatropha curcas endosperm cDNA library (GenBank accession number is GU320741). To verify
its possible function, the thermally and osmotically tolerant characteristics were tested by overexpressing the
recombinant JcHSP17.5 gene in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, respectively. The results showed
that the recombinant cells exhibited significantly improved viability in both thermal and osmotic stress condition
compared with the control. It suggested that the JcHSP17.5 represented an example of a HSP which was
capable of protecting cells against environmental extreme.
Key words: Jatropha curcas; small heat shock protein; gene expression; thermotolerance; osmotolerance
在胁迫环境下, 生物体内会产生一组分子量大
小在 15~42 kDa的蛋白, 被称为小热激蛋白(small
heat shock proteins, sHSPs) (Vierling 1991, 1997)。
小热激蛋白具有分子伴侣功能(Horwitz 1992; Jakob
等 1993), 能在不依赖ATP的情况下阻止在逆境胁
迫下的变性蛋白的累积以及保护蛋白的正确折叠
(Beissinger和Buchner 1998), 从而减少胁迫对生物
的伤害。植物小热激蛋白都是由核基因编码, 根据
DNA序列相似性分析、免疫交叉反应以及胞内定
位方法, 小热激蛋白可以分为5类(Waters等1996),
其中 2类(CI和CII)分别定位于胞质或是细胞核内
(Scharf等2001), 其余3类分别定位于质体 (Vierling
1991)、内质网(Helm等 1995)和线粒体(LaFayette
等 1996)。小分子热激蛋白表达可受多种因素诱
导, 例如高温、低温、干旱、重金属离子、氧
化物胁迫、种子发育、激素刺激等(Sun等 2001)。
在环境胁迫条件下, 小热激蛋白迅速大量表达, 其
积累量随温度升高和胁迫时间的延长而增加; 在胁
迫解除后, 小热激蛋白会持续很长时间, 其半衰期
在 30~50 h (DeRocher等 1991)。外源表达的小热
激蛋白在逆境情况下可以发挥分子伴侣作用(Yeh
等1997; Joe等2000), 阻止变性蛋白的积聚(Collada
等 1997), 保护蛋白的正常折叠与表达。
麻疯树是具有耐干旱、耐高温、耐贫瘠生长
特点的一种含油植物。在热带及亚热带干热河谷
有大量的野生群落。通过研究麻疯树中小热激蛋
白的耐热、耐旱作用机制, 可以对其它作物提高抗
逆能力, 发现高效抗逆基因提供帮助。虽然对麻疯
树的研究已经经历了10多年, 但是对麻疯树的抗逆
机制还缺乏比较系统的研究报道。本文报道了
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JcHSP17.5基因克隆以及在大肠杆菌与酵母中异源
表达的情况, 测定该基因编码的蛋白对大肠杆菌和
酵母菌在高温胁迫以及高渗透压胁迫下细胞存活率
的增强效果, 从而揭示该基因对麻疯树在逆境生存
条件下的相关胁迫的耐受作用大小。
材料与方法
1 生物信息学分析
将从不同发育时期麻疯树(Jatropha curcas L.)
种子胚乳构建的cDNA文库中克隆到的一段序列测
序后, 利用相关软件分析DNA序列编码的蛋白特
性: 用 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)工具
进行同源性搜索; 用 ExPASy网站(http://au.expasy.
org)的 Compute pI/Mw程序进行生物信息学分析,
计算预测蛋白的分子量、等电点的理论值; 用Pfam
Search寻找蛋白功能结构域; 用SignalP程序分析氨
基酸序列中是否存在信号肽; 用HMMTOP程序预
测跨膜结构。选用部分已报道的植物 I类和 II类
小热激蛋白氨基酸序列, 应用MEGA4软件构建系
统发育树。
2 载体构建
2.1 原核表达载体构建 根据编码区序列设计 5端
引物(5 TCGGATCCATGGATGTCAGGTTC-
GTAGG 3, 含 BamHI酶切位点)和 3端引物(5
GCAAGCTTTCAAGCAATTTTAACCTCAA 3, 含
HindIII酶切位点)进行扩增。PCR产物经纯化后
用 BamHI和HindIII双酶切消化, 将酶切后片段与
同样双酶切的 pET32a (具有氨苄霉素筛选标记)载
体采用 T4连接酶连接并转入 TOP10感受态细胞,
在含氨苄霉素的培养基上筛选阳性重组克隆。重
组质粒经 PCR和酶切验证无误后转入 BL21(DE3)
大肠杆菌表达菌株。
2.2 酵母表达载体构建 根据 In-Fusion Dry-Down
PCR Cloning Kit (Clontech)使用说明设计引物, 连
接 PCR产物与载体。根据 pYES2操作手册和 S. c.
EasyComp. Transformation Kit (Invitrogen)构建和
筛选阳性重组克隆。
3 重组菌蛋白表达
选取正确的表达菌株在添加了氨苄霉素(50
mg·L-1)的 LB液体培养基中于 37 ℃震荡培养至
OD600为1.0后, 于新鲜培养基中稀释至OD600为0.6,
培养 2 h, 添加诱导剂 IPTG至终浓度 1 mmol·L-1, 继
续培养 4 h。各取 1 mL处理后的大肠杆菌离心回
收, 加入50 μL SDS细菌裂解液, 沸水煮4 min裂解
细胞, 吸取 20 μL点样, 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
分析。
挑取阳性酵母菌于含 2%棉籽糖的液体SC-U
预培养培养基中培养, 待OD600达到0.4后, 加入2%
半乳糖诱导 8 h。取 1 mL菌液离心回收。参照
pYES2操作手册采用玻璃珠方法裂解细胞, 加入50
μL SDS细菌裂解液, 沸水煮 4 min, 吸取 20 μL点
样, 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
4 高温胁迫实验
采用上节方法培养后, 分别取 1 mL大肠杆菌
和酵母菌液于 50 ℃中进行热胁迫处理, 分别于处
理 0、30和 60 min时取样, 大肠杆菌稀释 5 000倍,
酵母稀释 20 000倍, 分别取 100 μL菌液铺于固体
培养基上, 前者于 37 ℃过夜(3组重复), 次日统计
菌落数量, 后者于 28 ℃过夜(3组重复), 2 d后统计
菌落数量。
5 渗透压胁迫实验
采用与高温胁迫处理相同的方法, 分别将两种
菌液于添加了 0、0.5和 1 mol·L-1 NaCl的培养基
中处理 1 h后涂板统计。
实验结果
1 JcHSP17.5生物信息学分析
在对麻疯树胚乳 cDNA文库测序后经 BlastX
比对发现一个与蓖麻(Ricinus communis)细胞质 II
类小热激蛋白(GenBank登录号为XP_002516106)
同源性达到89%的cDNA序列, GenBank登录号为
GU320741, 将该序列编码的蛋白命名为麻疯树细胞
质 II类小热激蛋白。根据测序结果分析, 该 cDNA
序列包含转录起始位点与多聚腺苷酸加尾信号, 含
完整开放阅读框(ORF), 为全长序列。该 cDNA序
列全长 693 bp, 5非编码区 29 bp, 3非编码区 191
bp, ORF为 474 bp, 编码一个具有 157个氨基酸的
蛋白, 经 ExPASy网站(http://au.expasy.org/)在线工
具预测编码蛋白等电点为 6.15, 分子量大小为 17
559.23 Da, 没有信号肽, 不含跨膜结构。通过搜
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索 Conserved Domain Database (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/)发现 JcHSP17.5在序列 C端有大小为
100个氨基酸的 α-晶体蛋白保守区域, 属于 α-晶
体 - 热激蛋白 23 类超基因家族( α- c r ys t a l l i n -
Hsps_p23-like superfamily)特有结构域。同时,
JcHSP17.5氨基酸序列也具有典型的II类保守结构
域。
2 JcHSP17.5系统进化分析
选取已报道的部分植物的I类或II类小热激蛋
白氨基酸序列, 经 Clustal W比对后, 采用MEGA4
软件, 选择内分枝测试(interior branch test)中的邻
接法(neighbor joining tree)构建分子进化树, 预测
JcHSP17.5蛋白的生物进化地位。
从图 1的分子进化分析中可以看出, 细胞质 I
类小热激蛋白聚为一群, 细胞质II类小热激蛋白聚
在另一群上。JcHSP17.5分布在胞质 II类小热激
蛋白分支上, 且与蓖麻胞质II类小热激蛋白最近, 从
而也提示 JcHSP17.5是胞质 II类小热激蛋白。
图 1 几种植物小热激蛋白的分子进化树分析
Fig.1 Phylogenetic analysis of small heat shock proteins from some plants
上分支为 II类小热激蛋白, 下分支为 I类小热激蛋白。各氨基酸序列 GenBank登录号为: 麻疯树(Jatropha curcas), GU320741;
蓖麻(Ricinus communis), XP_002516106; 李(Prunus salicina), ACV9325; 向日葵(Helianthus annuus) (II), P46516; 棉花(Gossypium
hirsutum), ABW89469; 油菜(Brassica rapa), ABV89637; 玉米(Zea may), NP_001148454; 拟南芥(Arabidopsis thaliana), NP_196763;
欧洲板栗(Castanea sativa), CAA08908; 胡萝卜(Daucus carota), P27396; 大豆(Glycine max), P05478; 紫苜蓿(Medicago sativa),
P27880; 豌豆(Pisum sativum), P19243; 向日葵(Helianthus annuus) (I), AAB63311。
3 JcHSP17.5蛋白功能的验证
根据上文所述方法分别构建大肠杆菌和酵母
菌的空白载体和重组载体, 分别命名大肠杆菌空白
载体和重组载体为pET32a和pET32a-HSP, 酵母菌
空白载体和重组载体分别为pYES2和pYES2-HSP。
以空白载体为对照, 分别在高温(50 ℃)和高渗透压
(0.5和 1 mol·L-1 NaCl)情况下检测 JcHSP17.5蛋白
对重组菌抗逆能力提高的效果。
3.1 蛋白表达 在重组菌诱导后用SDS-PAGE检测
蛋白表达情况, 在重组大肠杆菌和重组酵母菌中分
别出现大小为 35 kDa (图 2)和 17.5 kDa左右的新
蛋白条带(图 3)。
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3.2 高温胁迫 由图4-c中可以观察到, 在50 ℃高温
胁迫下重组大肠杆菌细胞存活率下降速率缓于对照
组。在胁迫 30 min后, pET32a和 pET32a-HSP的
细胞存活率分别下降至 16%和 26%, 而 60 min处
理后, 分别有 1%和 3%的细胞存活。重组菌与对
照相比, 细胞存活率在 30和 60 min处理后分别提
图 2 HSP在重组大肠杆菌中的表达
Fig.2 Expression of HSP in recombinant E. coli cells
1: 诱导后的 pET32a; 2: 未诱导的 pET32a-HSP; 3: 诱导后的
pET32a-HSP。*: 35 kDa左右的新蛋白条带; **: 17 kDa左右
的 p E T 3 2 a 表达标签。
图 3 HSP在重组酵母诱导后的表达
Fig.3 Expression of HSP in recombinant
S. cerevisiae cells after inducing
1: pYES2; 2: pYES2-HSP。*: 17.5 kDa左右的新蛋白条带。
高了 72.5%和 200%。从图 4-d中可以观察到, 在
50 ℃高温胁迫下重组酵母菌细胞存活率同样高于
对照。在 30 min时存活率分别为 49%和 38%, 在
60 min时存活率分别为 36%和 25%。重组菌相比
对照, 细胞活力在两个时段分别提高 28 .9% 和
44%。结果显示, 在高温胁迫条件下重组菌的细胞
存活率相对于对照有明显提高, 说明 JcHSP17.5蛋
白在生物遭受高温胁迫时, 具有维持生物细胞生活
力的功能。
3.3 渗透压胁迫 在图 5-c中, pET32a对照组在含
0.5和 1 mol·L-1 NaCl的培养基中分别处理 1 h后,
细胞存活率为 71%和51%, 重组菌 pET32a-HSP的
细胞存活率则是 92%和68%。重组菌与对照相比,
细胞活力在0.5和1 mol·L-1的NaCl处理后分别提高
29.5%和 33%。在图 5-d中, pYES2对照中细胞存
活率分别是67%和52%, pYES2-HSP中细胞存活率
分别为 88%和 71%。重组菌与对照相比, 细胞活
力在0.5和1 mol·L-1的NaCl处理后分别提高31.3%
和 36 .5%。
测定结果显示, 在高渗透压胁迫的情况下, 过
表达JcHSP17.5对重组菌的细胞存活率有很明显的
提高, 说明 JcHSP17.5蛋白在生物遭受高渗透压胁
迫时, 具有维持生物细胞生活力的功能。
讨　　论
麻疯树细胞质 II类小热激蛋白在NCBI中的
BLAST比对结果显示, 同源性最高的是蓖麻的胞质
II类小热激蛋白, 与其余几种植物的胞质 II类小热
激蛋白同源性也比较高(图 1)。在 JcHSP17.5的氨
基酸序列 C端大约有包含 100个氨基酸的 α-晶体
蛋白保守区域。小热激蛋白 C端保守区域可分为
保守序列 I和保守序列 II, 中间有不同长度的亲水
域。在保守序列 I中, 具有小热激蛋白共有的氨基
酸残基 Pro-X(14)-Gly-Val-Leu, 保守序列 II的共有
序列为Pro-X(14)-VaI/Leu/Ile-Val/Leu/Ile (Waters和
Vierling 1999)。细胞质 II类小热激蛋白具有 II类
特有的N端与 C端保守区域(Waters等 1996)。N
端除保守域外则是差异很大的氨基酸序列, N端序
列的多样性决定了HSP蛋白结合底物的情况(Basha
等 2006)。
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图 4 高温胁迫对菌落数及细胞存活率的影响
Fig.4 Effect of heat stress on cell number and viability
a和 c: 大肠杆菌表达系统; b和 d: 酵母表达系统。
小热激蛋白通常是在生物受到逆境胁迫(温
度、重金属、氧化、干旱、外源激素等)后出
现大量表达的。如 CsHSP17.5等与温度胁迫相关
(Craig等 1993; Thieringer等 1998; Soto等 1999),
AtHsp17.7-CII (Sun等 2001)与渗透压胁迫相关,
HaHsp17.6-CI (Almoguera和 Jordano 1992)与脱落
酸胁迫相关, OsHsp26.6-P (Lee和Vierling 2000)与
氧化胁迫相关, MsHsp18.2-CI (Gyorgyey等1991)与
重金属胁迫相关。Almoguera和 Jordano (1992)研
究发现, 向日葵种子胚发育阶段也会有HSP的表达。
JcHSP17.5是从发育时期的种子胚乳cDNA文库中克
隆的, JcHSP17.5可能在种子胚发育阶段得到表达来
对抗种子胚发育阶段遭受的高温及干旱胁迫。
从外源表达情况来看, JcHSP17.5有较强的改
善高温和高渗透压胁迫的能力(图 4和图 5)。外源
表达的JcHSP17.5蛋白在高温和高渗透压逆境条件
下发挥分子伴侣作用(Yeh等1997; Joe等2000), 结
合宿主蛋白, 阻止变性蛋白的积聚(Collada等1997),
保护蛋白的正常折叠与表达, 从而提高细胞的存活
率。
麻疯树是一种热带植物, 生长在干旱贫瘠地区,
有较强的耐高温和耐干旱能力。麻疯树小热激蛋
白参与抗逆境胁迫过程, 为麻疯树正常生长提供保
护作用。揭示麻疯树小热激蛋白与麻疯树抗逆能
力的关系有助于将麻疯树小热激蛋白应用于一些抗
逆能力较弱的植物品种, 提高植物的抗逆能力。而
且小热激蛋白在体外无ATP的情况下也能起到分
子伴侣作用(Beissinger和Buchner 1998), 或许可以
为保护一些易失活的蛋白酶提供一定参考。
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图 5 NaCl胁迫对菌落数及细胞存活率的影响
Fig.5 Effect of NaCl stress on cell number and viability
a和 c: 大肠杆菌表达系统; b和 d: 酵母表达系统。
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