全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 102~106102
收稿 2010-09-13 修定 　2010-11-03
资助 国家 “863” 计划项目(2006AA100108-3-1)和辽宁省教
育厅科学技术研究项目(2 00 8 6 23 )。
* 共同通讯作者(E-mail: houlx2006@126.com, Tel: 0531-
83179184; E-mail: syaua@163.com, Tel: 024-88487163)。
番茄耐低温相关基因的 SRAP 标记筛选
郭彩杰 1, 侯丽霞 2,*, 崔娜 1,*, 韩明利 1
1 沈阳农业大学生物科学技术学院, 沈阳 110161; 2 山东省农科院蔬菜研究所, 山东省设施蔬菜生物学重点实验室, 国家蔬菜
改良中心山东分中心, 济南 250100
摘要: 以番茄耐低温和不耐低温基因组DNA为材料进行SRAP分析, 共筛选了 225对SRAP引物, 其中 27对引物在两池之
间表现差异, 经测序只有Me2Em5扩增出与番茄耐低温相关的差异性片段, 大小约为 273 bp, 该片段仅在耐低温植株中稳
定扩增。经Blast分析比对, 该片段与已报道的PEG和低温诱导后在沙冬青幼苗中表达基因的 cDNA片段同源。根据差异
片段序列设计特异引物, 将M2E5-273标记成功转化为更稳定的SCAR标记。
关键词: 番茄; 耐低温; SRAP; 分子标记
Identification of the Specific SRAP Marker Associated with Cold Resistance of
Tamoto
GUO Cai-Jie1, HOU Li-Xia2,*, CUI Na1,*, HAN Ming-Li1
1Biological Science and Technology College, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China; 2Institute of Vegetables,
Shandong Academy of Agricultural Science, Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetable of Shandong Province, National
Center for Vegetable Improvement (Shandong), Jinan 250100, China
Abstract: SRAP (sequence-related amplified polymorphism) was used to analyze the genome DNA of cold-
resistanced tomato and normal tomato. Total 225 pairs of SRAP primers were used. The amplification of
twenty-seven primers was polymorphic in the two lines. Only the Me2Em5 primer had fragment that was highly
homologous with cold-resistanced plant testing. And a 273-bp specific band M2E5-273 was detected in cold-
resistanced tomato but not in normal tomato. Analysis of the sequence showed that this fragment was highly
homologous with Ammopiptanthus mongolicus seedling PEG and cold-induced transcript-derived fragment.
After cloning and sequencing, specific primers were designed to transform the SRAP marker to more stable
SCAR marker, which was named M2E5-273.
Key words: tomato; cold-resistanced; SRAP; molecular marker
番茄是一种起源于热带的喜温蔬菜作物(李书
德 1995)。多数番茄品种在温度低于 10 ℃时生长
发育受阻, 当温度低于6 ℃时表现明显的冷害症状
(Geisenberg 和 Stewarst 1986)。低温胁迫下, 对番
茄的生长、光合作用和酶活性都有不同程度的影
响, 严重的损害了番茄的产量和品质。近些年来,
国内外将现代生物技术应用于番茄耐低温的育种
中, 将传统的育种方法与现代生物技术相结合, 使
具有耐低温的番茄品种不断在生产中应用。
序列相关扩增多态性(sequence related ampli-
fied polymorphism, SRAP)又称为基于序列扩增多态
性(sequence based amplified polymorphism, SBAP),
是一种基于 PCR 的分子标记, 它具有简便、中等
产量、重复性好、高共显性、易分离条带及易
测序等优点, 尤其它可以检测基因的可译读码框
(ORFs)区域, 从而提高了扩增结果与表现型的相关
性。现已广泛应用于植物重要性状标记中(柳李旺
等 2004)。利用 SRAP分子标记技术标记番茄耐低
温相关基因还鲜见报道。本研究利用 SRAP 分子
标记技术, 标记番茄芽期耐低温相关的基因, 为番
茄耐低温育种提供优秀的标记, 加速育种进程, 实
现育种目标的可靠性。
技术与方法 Techniques and Methods
郭彩杰等: 番茄耐低温相关基因的 SRAP 标记筛选 103
材料与方法
1 试验材料
构建遗传群体, 利用番茄(Lycopersicon esculen-
tum Mill.)耐低温株系Lucky F8和不耐低温株系番青
获得杂交 F1 代, F1 代自交获得 F2 群体。材料由山
东省农科院蔬菜研究所提供。
2 耐低温池和不耐低温池的建立
取番茄F2代种子, 28 ℃光照培养箱预培养 36
h, 然后放入 11 ℃恒温培养箱内(Majid 1999; 赵福
宽等 2001; 王孝宣等 1996; Gemel 和 Saczynska
1989), 每24 h挑选一次, 能够萌发的种子为耐低温
番茄群体, 不萌发的为不耐低温番茄群体。将两类
型种子分别播种于山东省农科院蔬菜研究所温室穴
盘, 获得健壮幼苗。
3 DNA提取
从耐低温群体和不耐低温群体中各选择90株
健康单株, 4~5 叶期时, 每株取健康无病害嫩叶, 洗
净后用快捷性植物基因组DNA提取试剂盒提取番
茄 DNA, 用紫外分光光度计测定浓度并稀释至 15
ng·μL-1, 存放于-20 ℃备用。
4 SRAP分析
参照 Li 和 Quiros (2001)、陈涛(2007)、陈峰
等(2007)、Ferriol 等(2003)和林忠旭等(2003)方法
进行SRAP引物设计, 由上海生物工程有限公司合
成, 引物及序列见表 1。
20 μL PCR反应体系: 2×Taq PCR MasterMix 10
μL; 正反向引物各 1 μL; 模板 1 μL (15 ng·μL-1),
ddH2O 补足 20 μL。程序: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,
35 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 5 个循环; 94 ℃ 1 min, 50
℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35个循环; 72 ℃ 10 min, 4 ℃
保存。扩增产物在 6% 变性 PAGE 凝胶上分离, 银
染法显带。2×Taq PCR MasterMix 和 DNA 提取试
剂盒均购自北京天根生化科技有限公司; 6% PAGE
胶购自上海生物工程有限公司。
5 差异性片段回收、测序及 SCAR 转化
在变性聚丙烯酰胺凝胶胶板(银染法)干燥后,
滴10 μL ddH2O, 10 min后, 用灭菌干净刀片切下差
异性片段, 放入1.5 mL EP管中, 加入20 μL ddH2O,
95 ℃水浴锅中加热 10 min, 作为 PCR 模板, 4 ℃备
用。取 2.5 μL 上清液做模板, 再扩增的引物和反
应条件和原来相同, 配制 50 μL 的反应体系。50
μL PCR产物点入1.5%琼脂糖上检测, 扩增出与原
来大小相同的片段, 用胶回收试剂盒(北京百泰克生
物技术有限公司)回收条带, 连接到PMD-18T上, 转
化大肠杆菌并测序。利用DNAMAN去载体序列后
进行分析及 Blast 相似性比较。根据 SRAP扩增的
差异条带序列, 利用 Primer5.0 设计特异引物。
表 1 SRAP 引物序列
Table 1 The primer sequences used in SRAP reaction
编号 正向引物(5 → 3) 编号 反向引物(5 → 3)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
Me6 TGAGTCCTTTCCGGTAA Em6 GACTGCGTACGAATTGCA
Me7 TGAGTCCAAACCGGTAG Em7 GACTGCGTACGAATTCAA
Me8 TGAGTCCAAACCGGAAC Em8 GACTGCGTACGAATTCTG
Me9 TGAGTCCAAACCGGAGT Em9 GACTGCGTACGAATTCGA
Me10 TGAGTCCAAACCGGTCC Em10 GACTGCGTACGAATTCAG
Me11 TGAGTCCAAACCGGTGC Em11 GACTGCGTACGAATTCCA
Me12 TGAGTCCAAACCGGATG Em12 GACTGCGTACGAATTATG
Me13 TGAGTCCAAACCGGACA Em13 GACTGCGTACGAATTGTC
Me14 TGAGTCCAAACCGGTTG Em14 GACTGCGTACGAATTACG
Me15 TGAGTCCAAACCGGTGT Em15 GACTGCGTACGAATTAAG
植物生理学报104
6 SCAR标记的PCR扩增和群体验证分析
特异PCR扩增的反应体系总体积20 μL包括:
模板 DNA 为 15 ng、引物浓度 0.5 μmol·L-1、Mg2+
浓度 1.5 mmol·L-1、dNTPs 浓度 0.2 mmol·L-1、Taq
DNA 聚合酶 0.5 U。PCR 反应条件: 94 ℃预变性
8 min; 94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 29 个
循环; 72 ℃延伸 10 min。1.5% 琼脂糖凝胶电泳检
测。先对基因池进行验证, 然后对耐低温池和不耐
低温池进行单株DNA验证。电泳产物进行琼脂糖
凝胶成像观察分析。
实验结果
1 引物筛选
用225对SRAP引物对番茄耐低温基因池和不
耐低温基因池DNA进行引物筛选, 大部分引物在两
系间扩增图谱相同, 表明两系间具有基本相同的基
因组DNA序列, 但有27对引物在耐低温DNA池中
表现出差异,部分 SRAP 引物筛选如图 1。
图 1 部分 SRAP 引物筛选
Fig.1 Part of Screened SRAP primers
单数条带为耐低温基因池 D N A; 双数条带为不耐低温基因池 D NA。箭头示有差异的带。
图 2 差异片段序列
Fig.2 The sequences of specific DNA bands
序列中带下划线的 3 5 个碱基为对应的上游引物与下游引物序列。
2 特异片段测序和序列分析
回收由 27 对引物扩增的差异性片段, 测序结
果表明引物 Me2Em5 扩增的差异性片段与番茄耐
低温基因有关, 片段大小为 273 bp (图 2)。经Blast
比较分析, 该片段与已报道的PEG和低温诱导后在
沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)幼苗中表达基
郭彩杰等: 番茄耐低温相关基因的 SRAP 标记筛选 105
因的 cDNA (GenBank登录号为GO355492)的序列
相似性为 97%, e 值为 4e-67。
3 SRAP标记的 SCAR 转化
根据差异目的片段序列, 设计特异引物: 上游
引物为 5 CACAAGGGGCTCTTTACGT 3, 下游引
物为5 TAAAGGGAACAAAAGCTGGAG 3。首先
在耐低温池和不耐低温池进行PCR扩增, 获得差异
后对耐低温和不耐低温池中各15个单株逐个进行
扩增。该引物在耐低温池中稳定扩增出一条特异
条带(图 3), 在 200~300 bp 之间, 与设计的片段大
小一致, 而不耐低温池单株中均没有扩增出相应的
条带(图略) , 表明已成功将该 SRAP 标记转化为
图 3 SCRA引物在耐低温池单株中的 SCRA扩增
Fig.3 The amplified profiles by SCAR primer in cold-resistanced tomato
M: 100 bp DNA Ladder DL1500。
SCAR 标记。
为了分析该标记与耐低温的遗传图距, 进一步
用90株耐低温单株和90株不耐低温单株进行琼脂
糖凝胶电泳分析, 在180株单株组成的群体中没有
发现交换单株, 表明该标记与耐低温基因紧密连锁。
讨　　论
番茄的耐低温是复杂的数量性状, 由多个基因
控制, 也受环境因素的影响。对番茄的耐低温研究
中大部分集中在生理指标的测定上, 如超氧化物歧
化酶(SOD)活性、丙二醛的含量、可溶性糖的含
量、叶绿素的含量等(张渝洁 2008)。近年来, 对
于番茄耐低温性状的选择正在由传统的表型选择向
DNA 分子水平的基因选择发展。黄锡志等(2001)
利用 RFLP 分子标记构建了番茄的基因连锁图, 把
2个抗冷性基因和3个番茄种子发芽期抗冷性相关
的基因在基因连锁图上进行了明确的定位。赵福
宽等(2002)以番茄耐冷性基因系为试材, 采用RAPD
分子标记技术, 从280个随机引物中筛选出一个在
两池间具有多态性的引物OPF14, 证明了该引物扩
增出的特异性片段是一个与番茄耐冷性相连锁的
RAPD 标记。
SRAP 分子标记具有简便、高共显性、易于
分离条带和易测序等优点, 最初应用于芸苔属植物
油菜中, 现在已广泛的应用于粳稻(张丽等 2007)、
棉花、马铃薯、柑橘、大蒜、辣椒、黄瓜、
芹菜、拟南芥、小麦等的植物研究中(徐操和赵
宝华 2009) , 也有在杨树中应用研究(刘艳萍等
2008)。本研究利用 SRAP 分子标记, 建立了番茄
发芽期耐低温和不耐低温池, 从225对引物中筛选
出 27 对有差异的特异性片段, 经过回收、连接载
体、转化和测序后, 得到一对引物 Me2Em5, 其扩
增出的特异片段与 PEG和低温诱导后在沙冬青幼
苗中表达基因的cDNA片段的基因片段同源, 相似
值为 97%。目前做番茄耐低温的DNA水平的试验
较少, 在低温诱导过程中的方法也不尽相同, 而本
试验的试材在处理的方法与低温诱导沙冬青有相似
之处, 测序片段在 NCBI上的比对结果与沙冬青相
似值也较高。
由于 SRAP 分子标记的不稳定性, 易受外界环
境影响, 根据测序的结果, 设计稳定的 SCAR 引物,
用SCAR引物进行了基因池单株验证。耐低温池单
株琼脂糖凝胶电泳验证时, 由于提取DNA浓度存在
差异, 大倍数稀释后由于个别模板量不足存在亮度
稍有模糊的现象, 耐低温的基因池中的单株DNA都
在 200~300 bp中扩增出片段, 不耐低温基因池单株
中无此片段, 经过群体验证后, 没有发现交换单株,
表明该标记与耐低温基因紧密连锁, 成功的转化成
SCAR标记。这为番茄耐低温种子发芽的分子标记
建立了更稳定、更为简便、更易快速的操作, 既
为番茄耐低温育种提供优秀的标记, 又为加速育种
进程、实现育种目标的可靠性提供理论基础。
植物生理学报106
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