全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1093
收稿 2009-08-20 修定 　2009-10-14
资助 国家自然科学基金(30570137)和河南省高等学校新世纪
优秀人才支持计划 (2005HANCET-14)。
* 通讯作者(E-mail: hongyu_yuan@263.net; Tel: 0376-
6 3 9 2 2 6 7 )。
一个新的茶树黄酮醇合酶基因的克隆和表达分析
谢素霞, 张媛, 郭凯琳, 王磊, 袁红雨 *
信阳师范学院生命科学学院, 河南信阳 464000
提要: Cs-COR113 (GenBank登录号: FE942098)为一受冷诱导的茶树黄酮醇合酶基因的 cDNA片段, 采用 RACE技术克隆
了这一基因的全长 cDNA, 命名为 CsFLS (GenBank登录号: FJ577509)。CsFLS cDNA序列全长为 1 303 bp, 5-UTR和 3-
UTR分别长 91 bp和 175 bp, 包含一个编码 336个氨基酸的完整开放阅读框。序列分析显示, CsFLS与烟草、矮牵牛、欧
芹、拟南芥的黄酮醇合酶的同源性分别为74%、75%、75%和63%, 含有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族2个保守的基序,
以及与黄酮醇合酶正确折叠有关的 2个保守的甘氨酸残基。CsFLS的表达受低温诱导, 但不受ABA诱导。
关键词: 茶树; 黄酮醇合酶; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of a Flavonol Synthase Gene from Camellia
sinensis
XIE Su-Xia, ZHANG Yuan, GUO Kai-Lin, WANG Lei, YUAN Hong-Yu*
Faculty of Life Sciences, Xinyang Normal College, Xinyang, Henan 464000, China
Abstract: Cs-COR113 is the cDNA fragment of a cold-induced flavonol synthase (FLS) gene of tea (Camellia
sinensis L.). The full-length cDNA, which was cloned using RACE (rapid amplification of cDNA ends) strategy
(designated as CsFLS, GenBank accession number: FJ577509), was 1 303 bp in length with a 91-bp 5-UTR and
a 175-bp 3-UTR, containing an open reading frame of 336 amino acids. CsFLS protein had homology to other
flavonol synthase from Nicotiana tabacum, Petunia hybrida, Petroselinum crispum, and Arabidopsis thaliana,
showing 74%, 75%, 75%, and 63% in amino acid identity, respectively. CsFLS contained two conserved motifs
of the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases and two glycine residues required for proper folding of the FLS
polypeptide. The expression of CsFLS was induced by low temperature, but not by ABA.
Key words: Camellia sinensis L.; flavonol synthase; gene expression
黄酮类化合物(flavonoid)是一类来自于丙二酰
辅酶A和苯丙氨酸的次生代谢物, 广泛存在于植物
界。黄酮醇是最为古老, 分布最广泛的一类黄酮类
化合物, 它们甚至在藓类和蕨类植物中也存在
(Stafford 1991)。在黄酮类化合物合成途径中, 黄
酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)催化二氢黄酮
醇转化为黄酮醇。FLS以及黄酮类化合物合成途
径中的黄烷酮 3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,
F3H)和花色素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)
均属于 2 - 酮戊二酸依赖型的双加氧酶 ( 2 -
oxoglutarate-dependent dioxygenase)家族, 它们的编
码基因都是由一个祖先基因进化而来(Pelletier等
1997)。F3H的作用是将黄烷酮转化为二氢黄酮醇,
二氢黄酮醇可以由FLS转化为黄酮醇, 在其被还原
为无色花色素(leucoanthocyanidin)后, 由ANS的催
化而转化为花色素。
植物体合成的黄酮类化合物具有多种生物学
功能。例如, 促进花朵着色吸引传粉者, 抵御病原
菌侵染, 在植物和微生物互作中参与信号传递, 保
护植物体免受紫外线的辐射等(Owens等 2008)。
在植物抗逆反应中尤为重要, 它可以屏蔽有害辐
射、结合植物毒素、通过控制生长素的运输调节
植物多种逆境的反应(Winkel-Shirley 2002)。黄酮
醇对人体还具有保健作用以及抗氧化、抗感染、
抗增殖和抑制血管增生的功能。
各种植物体内的黄酮类化合物合成基因是紫
外线(UV-B)应答基因。Ubi等(2006)的研究表明,
查耳酮合酶、F3H、二氢黄酮醇 4-还原酶、ANS
和UDP-葡萄糖:类黄酮 3-O-葡糖基转移酶基因受
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UV-B诱导。UV-B辐射可使苹果树体内的苯丙氨
酸氨解酶和查耳酮异构酶的活性增强 10~20倍。
我们曾在研究茶树的冷适应时用抑制差减杂交从茶
树的幼叶中成功分离到一个受低温诱导的 FLS基
因的 cDNA片段, 命名为 Cs-COR113 (GenBank登
录号: FE942098) (Wang等 2009)。本文根据该
cDNA片段的碱基序列设计引物, 以低温处理的茶
树幼叶 SMART cDNA文库为模板, 采用 RACE技
术分离得到了FLS基因的全长cDNA, 并采用Real-
time PCR技术研究了低温和ABA及UV-B对这一基
因表达的影响。
材料与方法
以两年生茶树(Camellia sinensis L.)栽培品种
‘信阳大叶 ’营养钵扦插苗为实验材料。处理有(1)
预培养: 处理前茶树幼苗先在温度为23~25 ℃、光
照强度为 160 μmol·m-2·s-1和光照时间为 12 h·d-1条
件下生长 7 d。(2)低温处理: 预培养的幼苗在光照
培养箱中, 温度降至4~5 ℃, 持续光照, 光照强度保
持不变。分别于低温4~5 ℃处理2、7、15、24、48
和 72 h后取充分展开的第 4片叶用于实验分析。
以不进行低温处理的相同叶位叶片做对照。( 3 )
ABA处理: 100 mmol·L-1 ABA溶液喷施茶树幼苗, 温
度和光照同上, 分别于处理后 2、7、15、24、48
和72 h取充分展开的第4片叶用于实验分析, 以喷
洒蒸馏水 7 h后的茶树幼苗叶片作对照。(4)UV-B
处理: 茶树幼苗用强度为 0.2 W·m-2的UV-B处理,
同时用强度为 80 µmol·m-2·s-1白光做背景, 于处理
后 3、7、15和 24 h取充分展开的叶片用于实验
分析。以白光处理 7 h的叶片作对照。
用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)从冷处理24
h的茶树叶中提取总 RNA。取 2 µL总 RNA, 按照
Clontech公司SMARTTMRACE cDNA Amplification
Kit的操作程序构建5-ready RACE cDNA文库和3-
ready RACE cDNA文库。
根据Cs-COR113的核苷酸序列设计一对特异
性引物GPS1 (5-ACAACCTGCAATCACCACAA-3)
和GPS2 (5-CCCAACTCTCTGCAAATTCC-3)。
以 5-ready RACE cDNA文库为模板, 利用 5通用
引物和GPS2扩增该基因 cDNA的 5末端。PCR
条件: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 75 ℃ 1 min,
3 0 个循环。
以 3-ready RACE cDNA文库为模板, 采用 3
通用引物和 GPS1扩增该基因 cDNA的 3末端。
PCR条件: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 75 ℃
2 min, 30个循环。
根据拼接出的序列, 在起始密码子附近和3非
翻译区设计一对特异性引物 GPS3 (5-CAATG-
GAGTTGGAGAGGGTG-3)和 GPS4 (5-CGAG-
TGAGTGAAGAAGGCTC-3), 以SMARTTMRACE
cDNA为模板扩增 CsFLS基因的ORF。PCR条件
为: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 75 ℃ 2 min,
3 0 个循环。
提取与反转录总 RNA时, 用 TRIzol Regent
(Invitrogen)从冷处理不同时间的叶片中提取总
RNA。进行反转录时, 取总 RNA 2 µL, Oligo (dT)18
引物 1 µL, 加水至 6 µL, 于 70 ℃中保温 10 min, 冰
浴中 2 min, 然后在该溶液中依次加入 4 µL 5×M-
MLV缓冲液, 0.5 µL dNTP (各 10 mmol·L-1), 0.5 µL
M-MLV (RNase H), 加水至20 µL, 于42 ℃下保温1
h。70 ℃中保温 15 min, 冰上冷却。
计算 PCR扩增效率时, 分别取 3 µL来自于不
同样品的 cDNA, 进行 4次 5倍梯度稀释(1、1:5、
1:25、1:125和 1:625), 每个浓度各取 1 µL cDNA
作实时荧光定量 PCR分别扩增 α-tubulin和CsFLS
基因, 每个浓度做3管。在扩增过程中, ABI PRISM
7300 Real-Time PCR仪(Applied Biosystems)自动读
出Ct值, 并以模板浓度的对数为横坐标, Ct值为纵
坐标, 绘制出标准曲线, PCR仪自动计算出曲线的
斜率, 然后根据公式 E=10[-1/slope]计算出扩增效率。
通过优化实验, 使每一cDNA样品内参基因和目标
基因的扩增效率趋于一致。
根据优化实验的结果, 取 1 µL cDNA, 10 µL
SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (TOYOBO),
每种引物大约 5 pmol, 加水至 20 µL。每一反应设
3个重复。反应条件: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s, 58
℃ 15 s, 75 ℃ 30 min, 共 40个循环。设定程序,
使扩增结束后PCR仪自动运行绘制融解曲线(95 ℃
15 s, 60 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s)以决定是否发生了特异
性扩增。实验组目的基因的表达相对于对照组的
变化倍数按 2-ΔΔCT方法计算(Livak和 Schmittgen
2001)。
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结果与讨论
1 CsFLS基因的克隆与序列分析
根据所得到的 FLS cDNA片段的序列设计上
游引物和下游引物。用下游引物和SMART cDNA
的5通用引物扩增 cDNA的5末端; 用上游引物和
3通用引物扩增 cDNA的 3末端。5-RACE和 3-
RACE分别得到 380 bp和 1 200 bp的扩增产物的
测序表明, 它们分别是所克隆基因的 5端和 3端。
BLAST分析结果显示所克隆的 2个 cDNA片段为
FLS的 2个末端序列。
将上述序列拼接得到 1 303 bp的 FLS全长
cDNA序列。进行ORF搜索的结果显示该序列包
含一个完整的ORF, 编码一条由336个氨基酸残基
组成的多肽链。ORF起始密码子上游第 3位核苷
酸为A, 第 4位为G, 是一个典型的KozaK结构。
拼接cDNA的5-UTR和3-UTR的长度分别为91 bp
和 175 bp, 并且在 polyA多聚核苷酸结构上游有一
段多聚腺苷酸加尾信号序列(TAAAA)。根据已经
获得的完整 cDNA序列, 在起始密码子附近和3非
翻译区分别设计引物(GSP3 和 GSP4) , 以上述
SMART cDNA为模板扩增得到1 046 bp长的cDNA
片段(图 1), 含有一个与拼接序列相同的ORF。
2 CsFLS基因编码产物的同源性比较与聚类分析
经同源性比对表明, CsFLS编码产物与烟草、
矮牵牛、欧芹、拟南芥的 FLS 的同源性分别为
74%、75%、75%和 63%, 与茶树已克隆的 FLS
基因的编码产物的同源性为 51%, 因此推定茶树
FLS基因家族一个新成员的全长 cDNA已经得到。
类黄酮合成途径中的 FLS、F3H和ANS都是 2-酮
戊二酸依赖性双加氧酶家族的成员, 均含有H-X-D
和R-X-S两个保守的基序, 它们分别是Fe2+和2-酮
戊二酸的结合位点。另外, 柑橘的 FLS突变分析
结果证实2个保守的甘氨酸残基是FLS多肽链正确
折叠所必需的。CsFLS也含有H-X-D和 R-X-S基
序以及 2个保守的甘氨酸残基(图 2)。
图 1 CsFLS cDNA的扩增
Fig.1 Amplification of CsFLS cDNA sequence
M: DL2000 DNA marker; 1: CsFLS基因的 5’ RACE产物; 2:
CsFLS基因的 3’ RACE产物; 3: GSP3和GSP4扩增结果。
图 2 CsFLS与其他物种 FLS编码产物的同源性比对
Fig.2 Alignment of the predicted amino acid sequences of CsFLS and other FLSs
黑色表示在所有的序列中都相同的氨基酸残基; 灰色表示在多数序列中相同的氨基酸残基; 星号表示 6 个严格保守的氨基酸残
基。1: 茶树(Camellia sinensis) (FJ577509); 2: 欧芹(Petroselinum crispum) (AAP57395); 3: 矮牵牛(Petunia hybrida) (Q07512); 4: 烟
草(Nicotiana tabacum) (ABE28017)。
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根据 FLS、F3H和ANS的氨基酸序列, 采用
DNAMAN软件和邻位法(NJ)构建进化树。图 3表
明, 来自不同物种的 FLS、F3H和ANS首先分别
聚类合并, 接着FLS和ANS聚合, 从进化关系上来
说这两类 2-酮戊二酸依赖性双加氧酶最近。FLS
和ANS最后与 F3H聚合。系统进化分析显示, 从
茶树中分离的FLS基因分为2组, 其中2个茶树FLS
与蜜橘的FLS聚合为一组, 本文分离出的茶树FLS
是与烟草、矮牵牛、欧芹、拟南芥的 FLS 聚类
在一起。
图 3 对黄酮类化合物特异性的 2-酮戊二酸依赖的双加氧酶(包括 FLS、F3H和ANS)的系统进化树分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of 18 flavonoid-specific 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases, including FLS, F3H and ANS
节点显示的值为 Bootstrap值(%), 括号内为 GenBank 登录号。
3 CsFLS基因的表达分析
实时荧光定量RT-PCR分析表明, CsFLS为一
冷应答基因。低温处理 15 h左右 CsFLS转录本水
平显著增加, 其在低温处理 24 h前后的值最大, 此
后 CsFLS的转录本基本上保持稳定并持续到 72 h
(图 4)。在玉米和拟南芥中, 冷诱导的花色素苷的
合成与 PAL和 CHS mRNA的积累存在相关性
(Leyva等 1995)。在本文中, FLS基因的转录受低
温诱导。这说明低温能够诱导类黄酮途径中多个
基因的表达, 而不是只诱导与花青素合成有关的基
因。
此外, 低温、干旱和高盐等非生物胁迫常导
致细胞缺水, 许多冷应答基因也受干旱和高盐的诱
导。ABA调节植物体对这些胁迫的应答反应, 许
多胁迫诱导的基因也是ABA应答基因。为了检验
这一认识, 我们进一步采用荧光定量RT-PCR进行
分析, 结果(图 4)显示, CsFLS并不受ABA诱导, 说
明该基因可能受不同信号转导途径的调控。在茶
树中, FLS由多基因家族编码。不同家族成员表达
的时空模式、对环境的应答反应以及表达产物的
底物专一性有待进一步研究。
如图 5所示, CsFLS基因的表达受UV-B辐射
的影响。黄酮醇具有保护植物体免受UV-B辐射损
伤的功能。大豆UV-B抗性品种的黄酮醇水平比敏
感品种高, 并且UV-B诱导的黄酮醇的积累与黄酮
醇合酶基因的诱导表达具有相关性(Kim等 2008)。
在我们的实验中, UV-B处理的早期, CsFLS受诱导
表达, 而后受到抑制。CsFLS对UV-B的应答模式
与大豆黄酮醇合成途径中的 2个关键基因GmF3H
和GmFLS (Kim等 2008)类似。
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图 4 低温和ABA对茶树幼叶CsFLS基因表达的影响
Fig.4 Effects of low temperature and ABA on CsFLS
expression of young tea leaves
图 5 UV-B对茶树幼叶CsFLS基因表达的影响
Fig.5 Effect of UV-B on CsFLS expression of
young tea leaves
参考文献
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