全 文 ：促葡萄糖摄取细胞模型的构建及应用∗
胡海军１ꎬ３ꎬ 田维锋１ꎬ３ꎬ 逯艳婷１ꎬ３ꎬ 刘海洋１ꎬ 胡　 敬１ꎬ 贡潘偏抽１ꎬ３ꎬ
王　 芳１ꎬ３ꎬ 张玉梅２∗∗ꎬ 熊文勇１∗∗ꎬ 孔清华１∗∗
(１ 中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室ꎬ 昆明　 ６５０２０１ꎻ
２ 中国科学院西双版纳热带植物园ꎬ 昆明　 ６５０２２３ꎻ ３ 中国科学院大学ꎬ 北京　 １０００４９)
摘要: 植物是发现先导药物的天然宝库ꎬ 目前抗糖尿病药物的一个重要来源是植物ꎮ 从植物中发现抗糖尿
病药物的关键在于抗糖尿病药物筛选模型的建立ꎮ 为获得一个更稳定、 筛选结果更可靠的抗糖尿病药物筛
选模型ꎬ 本文对基于脂肪细胞摄取葡萄糖的药物筛选模型进行优化ꎮ 文献报道的该类模型ꎬ 只将胰岛素作
为阳性对照ꎬ 而本文同时将胰岛素和罗格列酮作为阳性对照ꎬ 使模型更加稳定、 筛选结果更加可靠ꎮ 此
外ꎬ 本文还以胰岛素信号通路抑制剂 Ａｋｔ１ / ２抑制剂作为另一阳性对照ꎬ 使之还可应用于胰岛素信号通路
抑制剂的筛选ꎬ 扩展了该模型的用途ꎮ 最后ꎬ 对 １６个植物来源的天然产物在该模型进行筛选ꎬ 其结果稳
定ꎬ 并发现 ３个活性化合物ꎮ 进一步对活性化合物 Ｘ１５、 Ｘ１６进行浓度梯度实验ꎬ 结果表明ꎬ 两者的活性
都具有明显的浓度依赖性ꎮ Ｘ１５和 Ｘ１６的细胞增敏活性的研究为后续进一步研究其分子作用机理奠定基
础ꎬ 并为后期可能的药物开发提供分子候选ꎮ
关键词: ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞ꎻ 抗糖尿病药物筛选ꎻ 细胞模型ꎻ 葡萄糖摄取ꎻ 天然产物
中图分类号: Ｑ ９４６　 　 　 　 　 　 文献标志码: Ａ　 　 　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１５)０６－８２１－０７
Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ
Ｕｐｔａｋｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ
ＨＵ Ｈａｉ￣ｊｕｎ１ꎬ３ꎬ ＴＩＡＮ Ｗｅｉ￣ｆｅｎｇ１ꎬ３ꎬ ＬＵ Ｙａｎ￣ｔｉｎｇ１ꎬ３ꎬ ＬＩＵ Ｈａｉ￣ｙａｎｇ１ꎬ ＨＵ Ｊｉｎｇ１ꎬ
ＧＯＮＧＰＡＮ Ｐｉａｎ￣ｃｈｏｕ１ꎬ３ꎬ ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ１ꎬ３ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙｕ￣ｍｅｉ２∗∗ꎬ
ＸＩＯＮＧ Ｗｅｎ￣ｙｏｎｇ１∗∗ꎬ ＫＯＮＧ Ｑｉｎｇ￣ｈｕａ１∗∗
(１ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｘｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｇｒｅａｔ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｄｉｇｇｉｎｇ ｌｅａｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓꎬ ａｎｄ ｍａｎｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｔｉ￣ｄｉａｂｅｔｉｃ ｄｒｕｇｓ ａｒｅ
ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ. Ｔｈｅ ｋｅｙ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ￣ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ａｎｔｉ￣ｄｉａｂｅｔｉｃ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌｓ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｏｒｅ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｔｉ￣ｄｉａｂｅｔｉｃ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｍｏｄｅｌꎬ ｗｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ. Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｍｏｄｅｌｓꎬ ｉｎｓｕｌｉｎ
ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｏｎｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｗｈｉｌｅ ｉｎ ｏｕｒ ｍｏｄｅｌ ｂｏｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｍａｄｅ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｍｏｒｅ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｗｅ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｔｏ
ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓꎬ ａｎｄ Ａｋｔ１ / ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｐａｔｈｗａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄꎬ ｗｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ １６ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ
ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｅｅ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ. Ｗｅ ａｌｓｏ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅ ｄｏｓｅ￣ｒｅ￣
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１５ꎬ ３７ (６): ８２１~８２７
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１５１５０４６
∗
∗∗
基金项目: 中国科学院 (２９２０１３３１２Ｄ１１００４)ꎻ 云南省科技厅 (３９Ｙ３３Ｈ５２１２６１ꎬ ２０１４ＦＡ０４３) 基金资助
通讯作者: Ａｕｔｈｏｒｓ ｏｆ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｘｉｏｎｇ􀆰ｗｅｎｙｏｎｇ＠ｍａｉｌ􀆰 ｋｉｂ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎꎻ ｋｏｎｇｑｉｎｇｈｕａ＠ｍａｉｌ􀆰 ｋｉｂ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎꎻ ｚｙｍｅｉ＠ｘｔｂｇ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎ
收稿日期: ２０１５－０３－１６ꎬ ２０１５－０６－２３接受发表
作者简介: 胡海军 (１９８６－) 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事抗 ＩＩ型糖尿病药物筛选及机制研究ꎮ
ｓｐｏｎｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｘ１５ ａｎｄ Ｘ１６. Ｂｏｔｈ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｏｓｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ. Ｔｈｅｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｆｉｒｓｔ
ｒｅｐｏｒｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌꎬ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓꎻ Ａｎｔｉ￣ｄｉａｂｅｔｉｃ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇꎻ Ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌꎻ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅꎻ Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
　 糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢
性疾病ꎮ 糖尿病的持续高血糖与长期代谢紊乱等
可导致全身组织器官ꎬ 特别是眼、 肾、 心血管及
神经系统的损害及其功能障碍和衰竭ꎬ 严重危害
健康 (Ｖｉｎｉｋ 和 Ｖｉｎｉｋꎬ ２００３)ꎮ 随着生活水平提
高、 人口老龄化以及肥胖发生率的增加ꎬ 糖尿病
发病率迅速升高并有年轻化趋势 (Ｗｅｉｌｌ 等ꎬ
２００４)ꎮ 国际糖尿病协会数据显示ꎬ ２０１１ 年全球
糖尿病患者总数高达 ３􀆰 ６６ 亿ꎬ 预计这一数字到
２０３０年将达到 ５􀆰 ５２ 亿 (Ｗｈｉｔｉｎｇ 等ꎬ ２０１１)ꎮ 糖
尿病患者中约有 ９０％~９５％属于Ⅱ型糖尿病 (Ａｌ￣
ｂｅｒｔｉ和 Ｚｉｍｍｅｔꎬ １９９８)ꎬ 它是由胰岛素分泌不足
或胰岛素抵抗 (胰岛素相对缺乏) 所致 (Ｌｅｎｅｙ
和 Ｔａｖａｒéꎬ ２００９)ꎮ 因此Ⅱ型糖尿病是糖尿病研
究的重点ꎮ 目前临床应用最广泛的抗Ⅱ型糖尿病
药物主要有磺脲类、 双胍类、 噻唑烷二酮类和
α￣葡萄糖苷酶抑制剂等ꎮ 这些药物取得了较好的
疗效ꎬ 都能使血液中葡萄糖浓度明显下降ꎬ 但长
期使用后都不能很好控制血糖浓度ꎮ 此外ꎬ 这些
药物也有一定的副作用ꎬ 如肝肾毒性、 浮肿、 腹
泻等ꎬ 因此在肝功能不全的患者中其应用受到一
定限制ꎬ 而且部分患者不能长期耐受其治疗
(Ｃｈｅｎｇ和 Ｆａｎｔｕｓꎬ ２００５)ꎮ 因此ꎬ 新型降血糖药的
开发一直是抗Ⅱ型糖尿病药物研究的重点ꎮ
抗Ⅱ型糖尿病药物有两种来源ꎬ 一种是通过
化学合成获得ꎬ 另外一种是从天然产物中获得ꎮ
通过化学合成来开发新型抗Ⅱ型糖尿病药物的成
本很高、 难度较大ꎬ 而且所得到的药物毒性往往
很大ꎮ 而从天然产物中获得抗糖尿病药物具有成
本低、 难度小、 药物毒性和副作用弱的优点ꎮ 因
此ꎬ 从天然产物中筛选出更好的、 高效低毒且作
用机理清楚的抗糖尿病药一直是当前Ⅱ型糖尿病
研究的热点ꎮ 而抗糖尿病药物开发的关键在于建
立高效、 可靠、 稳定的抗糖尿病药物筛选模型ꎮ
通过测定细胞的葡萄糖摄取来判断化合物的降糖
活性是一种比较经典的抗糖尿病药物筛选方法ꎬ
已被广泛应用ꎮ 但已有的该类模型存在筛选结果
稳定性差、 可靠性不足的缺点ꎬ 因此本文对之前
报道的基于葡萄糖摄取的抗糖尿病药物筛选模型
(Ｘｉｅꎬ ２００５) 进行了优化ꎮ 在文献报道的模型中ꎬ
只将胰岛素作为阳性对照ꎬ 而本文同时将胰岛素
和罗格列酮作为阳性对照ꎬ 增加了模型的稳定性
和筛选结果的可靠性ꎮ 同时ꎬ 本文还以胰岛素信
号通路抑制剂 Ａｋｔ１ / ２ 作为阳性对照ꎬ 使该模型
还可应用于胰岛素信号通路抑制剂的筛选ꎬ 从而
扩展了该模型的用途ꎮ 植物天然产物是新药发现
的一个重要来源ꎬ 当前使用的处方药中ꎬ 有超过
２５％来源于植物 (Ｓｍｉｔｈ 和 Ｃｌｉｎａｒｄꎬ ２０１４)ꎮ 云南
地区具有丰富的植物多样性ꎬ 是发现先导药物的
资源宝库ꎮ 我们利用该构建好的模型对一批植物
来源的天然产物进行降糖活性筛选ꎬ 成功地发现
了 ３个活性化合物ꎬ 我们还对其中两个化合物的
活性进行了初步研究ꎬ 为后续开展分子作用机
制、 结构修饰和可能深入开发奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
化合物主要由中国科学院昆明植物研究所植物化学
与西部植物资源持续利用国家重点实验室提供ꎬ 小部分
由中国科学院西双版纳热带植物园张玉梅老师提供ꎮ 所
用到的材料包括: ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞 (ＡＴＣＣ)、 ＤＭＥＭ 高
糖和低糖培养基 (Ｈｙｃｌｏｎｅ)、 小牛血清 (ＧＩＢＣＯ)、 胎牛
血清 (ＧＩＢＣＯ)、 青霉素 /链霉素 (ＢＩ)、 胰蛋白酶 (ＢＩ)、
罗格列酮 (ＳＩＧＭＡ)、 Ａｋｔ１ / ２ 抑制剂 (ＳＩＧＭＡ)、 甲醛溶
液 (ＳＩＧＭＡ)、 异丙基甲基黄嘌呤 (３￣ｉｓｏｂｕｔｙｌ￣１￣ｍｅｔｈｙｌｘ￣
ａｎｔｈｉｎｅꎬ ＩＢＭＸ) (ＳＩＧＭＡ)、 胰岛素 (Ｒｏｃｈｅ)、 地塞米松
(Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅꎬ ＤＥＸ) (Ａｄａｍａｓ)、 牛血清白蛋白 (上海
生工生物有限公司)、 葡萄糖检测试剂盒 (上海荣盛生
物有限公司)ꎮ
１􀆰 ２　 细胞培养及分化
将 ３Ｔ３￣Ｌ１前脂肪细胞接种于 １０ ｃｍ或 ６ ｃｍ细胞培养
皿中ꎬ 用含 １０％新生牛血清和 １％青霉素 /链霉素的高糖
ＤＭＥＭ培养基在 ３７ ℃、 １０％ ＣＯ２条件下培养ꎬ 待细胞长
满融合后饥饿 ２ ｄꎬ 再加入含 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＩＢＭＸ、 １
μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＤＥＸ、 １７０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素、 １ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１罗格列
酮、 １０％胎牛血清和 １％青霉素 /链霉素的高糖 ＤＭＥＭ 培
２２８　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
养基诱导分化 ７２ ｈꎬ 然后再换成含 １７０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素
和 １０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养基继续培养 ２４ ｈꎬ 诱导分
化 ６~７ ｄ后ꎬ ９０％以上呈脂肪细胞表型ꎬ 可用于后续实
验 (Ｆｒｏｓｔ和 Ｌａｎｅꎬ １９８５ꎻ Ｇｏｖｅｒｓ等ꎬ ２００４)ꎮ
１􀆰 ３　 油红 Ｏ染色
用磷酸盐缓冲液 (Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅꎬ ＰＢＳ) 清
洗细胞 １次ꎬ 先加入 １０％甲醛溶液在室温下固定 １０ ｍｉｎꎬ
再换新鲜的 １０％甲醛溶液在室温下继续固定 １ ｈꎮ 之后
用蒸馏水清洗 １次ꎬ 再用 ６０％的异丙醇漂洗 １ 次ꎬ 并充
分晾干ꎮ 最后加入油红 Ｏ溶液染色 １０ ｍｉｎꎬ 蒸馏水清洗
２次ꎬ 观察并拍照ꎮ
１􀆰 ４　 胰岛素的葡萄糖消耗曲线
将分化好的 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂肪细胞接种到 ９６ 孔板ꎬ 过夜
培养ꎬ 分别用终浓度为 ０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 ０􀆰 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 ０􀆰 ５
ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 ２００
ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１的胰岛素处理 ２４ ｈꎬ 每个浓度设 ３个重复孔ꎬ 然
后取培养基 １０ μＬꎬ 用葡萄糖试剂盒检测培养液中的葡萄
糖浓度ꎬ 以未接种细胞的空白复孔的葡萄糖含量均值为
初始值ꎬ 算出各孔细胞的葡萄糖消耗量 (Ｚｈｏｕ等ꎬ ２００７)ꎮ
计算公式为:
　 　 葡萄糖消耗量 ｎ＝(Ｃ空白孔－Ｃ给药孔)∗Ｖ (１)
１􀆰 ５　 罗格列酮的葡萄糖消耗曲线
将分化好的 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂肪细胞接种到 ９６ 孔板ꎬ 过夜
培养ꎬ 分别用含有 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素和 ０􀆰 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １
ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １ ０００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、
５ ０００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １０ ０００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１罗格列酮的培养基处理
脂肪细胞 ２４ ｈꎬ 每个浓度设 ３ 个重复孔ꎬ 然后取培养基
１０ μＬꎬ 用葡萄糖试剂盒检测培养液中的葡萄糖浓度ꎬ 以
未接种细胞的空白复孔的葡萄糖含量均值为初始浓度ꎬ
算出各孔细胞的葡萄糖消耗量ꎮ
　 　 葡萄糖消耗量计算公式同 (１)
１􀆰 ６　 Ａｋｔ１ / ２抑制剂的葡萄糖消耗曲线
将分化好的 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂肪细胞接种到 ９６ 孔板ꎬ 过夜
培养ꎬ 分别用含有 ２００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素和 ０􀆰 ００１ μｍｏｌ􀅰
Ｌ－１、 ０􀆰 ０１ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 ０􀆰 １ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 ０􀆰 ５ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １
μｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 ５ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１、 １０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ Ａｋｔ１ / ２抑制剂的培
养基处理分化好的 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞 ２４ ｈꎬ 每个浓度设 ３
个重复孔ꎬ 取培养基 １０ μＬꎬ 用葡萄糖试剂盒检测培养
基中的葡萄糖浓度ꎬ 以未接种细胞的空白复孔的葡萄糖
含量均值为初始浓度ꎬ 算出各孔细胞的葡萄糖消耗量ꎮ
　 　 葡萄糖消耗量计算公式同 (１)
１􀆰 ７　 利用促葡萄糖摄取细胞模型筛选具有降糖活性的
天然产物
将分化好的 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂肪细胞接种到 ９６ 孔板ꎬ 过夜
培养ꎬ 分别用含有 ０􀆰 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素和终浓度为 １０
μｍｏｌ􀅰Ｌ－１或 １０ μｇ􀅰ｍＬ－１的化合物的培养基处理分化好的
３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞 ２４ ｈꎬ 每个样设 ３ 个重复孔ꎬ 取培养基
１０ μＬꎬ 用葡萄糖试剂盒检测培养液中的葡萄糖浓度ꎬ 以
未接种细胞的空白复孔的葡萄糖含量均值为初始浓度
值ꎬ 算出各孔细胞的葡萄糖消耗量ꎮ
　 　 葡萄糖消耗量计算公式同 (１)
活性化合物的葡萄糖消耗增加率 ＝ ( ｎ活性化合物 － ｎ
０􀆰 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素) / ｎ０􀆰 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素×１００％
１􀆰 ８　 统计学处理
数据之间的比较用成对 ｔ 检验ꎬ∗Ｐ < ０􀆰 ０５ 为统计学
上有显著性差异ꎮ
２　 结果
２􀆰 １　 促葡萄糖摄取细胞模型的构建
２􀆰 １􀆰 １　 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞的诱导分化　 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂
肪细胞在诱导分化前是非脂肪细胞ꎬ 细胞内无脂
滴积累 (图 １: Ｃ)ꎮ 细胞经诱导分化 ６ 天后ꎬ 细
胞内出现脂滴ꎬ 呈现脂肪细胞形态 (图 １: Ｂꎬ
Ｄ)ꎮ 经油红 Ｏ 染色后在显微镜下可见细胞内聚
集大量脂滴ꎬ 呈桔红色ꎮ 染色结果显示ꎬ 约 ９０％
以上的 ３Ｔ３￣Ｌ１ 细胞被诱导分化成脂肪细胞ꎬ 可
用于后续葡萄糖摄取实验 (图 １: Ｄ)ꎮ
２􀆰 １􀆰 ２　 胰岛素ꎬ 罗格列酮和 Ａｋｔ１ / ２ 抑制剂在促
葡萄糖摄取细胞模型的建立、 优化及功能扩展中
的应用　 用不同浓度的胰岛素处理诱导分化后的
３Ｔ３￣Ｌｌ脂肪细胞ꎬ 结果显示随着胰岛素浓度的升
高ꎬ 葡萄糖消耗量也相应增加ꎬ 呈现剂量依赖关
系ꎬ 胰岛素在 １０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１浓度时ꎬ 脂肪细胞的
葡萄糖消耗量已经接近最大值 (图 ２: Ａ)ꎮ 上述
结果说明在我们的模型中ꎬ 细胞摄取葡萄糖的水
平可以很好地对药物刺激做出响应ꎬ 这与前述报
道一致 (Ｌｉ等ꎬ ２００９)ꎮ
罗格列酮是当前临床应用最为广泛的一种噻
唑烷二酮类抗糖尿病药 (Ｍａｙｅｒｓｏｎ 等ꎬ ２００２)ꎬ
它是过氧化物酶体增殖物激活受体 γ (Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ γꎬ ＰＰＡＲγ) 的激动
剂ꎬ 可以改善肌肉和脂肪组织的胰岛素抵抗ꎮ 用
不同浓度的罗格列酮处理诱导分化后的 ３Ｔ３￣Ｌｌ
脂肪细胞ꎬ 结果显示ꎬ 罗格列酮可以促进细胞对
葡萄糖的摄取ꎬ 在 １００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１浓度时ꎬ 它的活
性最强 (图 ２: Ｂꎬ Ｃ)ꎮ 将其用作药物筛选时的
阳性对照ꎬ 可增加该模型的稳定性和可靠性ꎮ
３２８６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 胡海军等: 促葡萄糖摄取细胞模型的构建及应用　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
图 １　 药物筛选及 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞诱导分化流程ꎮ Ａꎬ 抗糖尿病药物筛选流程图ꎻ Ｂꎬ ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞的分化过程ꎻ Ｃꎬ ３Ｔ３￣Ｌ１ 前脂
肪细胞在诱导分化前没有脂滴积累 (２０×)ꎻ Ｄꎬ 诱导分化 ６天后ꎬ 在细胞内有大量脂滴积累ꎬ 可被油红 Ｏ染成红色 (２０×)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ. Ａꎬ Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄ￣
ｕｃｔｓ. Ｂꎬ Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ. Ｃꎬ Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｎｏ ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｉｎ ３Ｔ３￣Ｌ１ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｂｅｆｏｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ (２０×). Ｄꎬ Ａｆ￣
ｔｅｒ ６ ｄａｙｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ (ｓｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ)ꎬ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｉｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｎｄ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ (２０×)
图 ２　 胰岛素、 罗格列酮和 Ａｋｔ１ / ２抑制剂在促葡萄糖摄取细胞模型的建立、 优化及功能扩展中的应用ꎮ Ａꎬ 胰岛素对 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂肪细
胞摄取葡萄糖的剂量效应关系ꎻ Ｂꎬ 罗格列酮的浓度为 ０􀆰 １~１００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１范围时对 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞摄取葡萄糖的影响ꎻ Ｃꎬ 罗格列酮
的浓度为 １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ~１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１范围时对 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞摄取葡萄糖的影响ꎻ Ｄꎬ Ａｋｔ１ / ２抑制剂对 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞摄取葡萄糖的
剂量效应关系 (ｎ＝ ３)
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎꎬ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ａｎｄ Ａｋｔ１ / ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎꎬ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓａｇｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｔｉｍｕｌａ￣
ｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ. Ａꎬ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌｌ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ. Ｂꎬ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏ￣
ｃｙｔｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ０􀆰 １－１００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ. Ｃꎬ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ １ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１－１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｒｏｓｉｇｌｉｔａ￣
ｚｏｎｅ. Ｄꎬ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｋｔ１ / ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ (ｎ＝ ３)
４２８　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
　 丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 Ｂ (Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ
Ｂꎬ ＰＫＢ / Ａｋｔ) 是胰岛素信号通路中的关键蛋白ꎬ
在胰岛素刺激下ꎬ 它可以被磷酸化ꎬ 进而促进葡
萄糖转运载体 ４ (Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ４ꎬ ＧＬＵＴ４)
的上膜转运ꎬ 增加细胞的葡萄糖摄取 ( Ｌｅｔｏ 和
Ｓａｌｔｉｅｌꎬ ２０１２)ꎮ 因此 Ａｋｔ１ / ２ 抑制剂可以通过抑
制胰岛素信号通路的信息传递ꎬ 从而抑制细胞对
葡萄糖的摄取ꎮ 如图 ２Ｄ 所示ꎬ ２００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１的
胰岛素可以显著促进细胞对葡萄糖的摄取ꎬ 但当
Ａｋｔ１ / ２抑制剂与 ２００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素同时处理脂
肪细胞时ꎬ 胰岛素的这种促葡糖糖摄取作用可以
被抑制ꎮ 随着 Ａｋｔ１ / ２ 抑制剂浓度的增加ꎬ 葡萄
糖消耗量相应下降ꎬ 呈现很好的剂量依赖关系ꎮ
当 Ａｋｔ１ / ２抑制剂的浓度达到 １０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１时ꎬ 可
将 ２００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素的促葡萄糖吸收活性完全
抑制ꎬ 细胞的葡萄糖消耗量恢复到基线水平 (图
２: Ｄ)ꎮ 这说明该细胞模型的分子基础与先前报
道的理论背景相一致ꎬ 可扩展该模型用于筛选胰
岛素信号通路抑制剂ꎬ Ａｋｔ１ / ２ 抑制剂可作为阳
性对照ꎮ
２􀆰 ２　 应用促葡萄糖摄取细胞模型筛选具有降糖
活性的天然产物
应用上述构建好的促葡萄糖摄取细胞模型有
针对性地对 １６ 个从植物中提取的天然产物进行
降糖活性筛选ꎮ 结果显示ꎬ Ｘ１１、 Ｘ１５、 Ｘ１６ 三
个化合物在 １０ μｇ􀅰ｍＬ－１初筛浓度下显示出不同
程度地促葡萄糖吸收活性ꎬ 葡萄糖摄取量分别
提高了 ２７􀆰 ４％、 ４９􀆰 ７％和 １３􀆰 ９％ (图 ３: Ａꎬ Ｂ)ꎮ
活性化合物 Ｘ１１是 Ａｌｉｓｏｌ Ａ ２４￣ａｃｅｔａｔｅꎬ 它提取自
东方泽泻 (Ａｌｉｓｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ) (图 ３: Ｃ) ( Ｊｉｎ 等ꎬ
２０１２)ꎮ 活性化合物 Ｘ１５ 是从采自西双版纳的茜
草科单种属植物黄棉木 (Ｍｅｔａｄｉｎａ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍａ) 提
取的一种齐敦果酸型皂苷ꎬ 其化学名为 ｐｙｒｏｃｉｎ￣
ｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ￣３β￣Ｏ￣β￣Ｄ￣ｑｕｉｎｏｖｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ￣２８￣Ｏ￣β￣Ｄ￣ｇｌｕ￣
ｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ (图 ４: Ａ)ꎮ 而活性化合物 Ｘ１６则是
从叶子花 (Ｂｏｕｇａｉｎｖｉｌｌｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ) 中提取的另
一种齐敦果酸型皂苷ꎬ 其化学名为 ３￣Ｏ￣[β￣Ｄ￣ｘｙ￣
ｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ( １→３) β￣Ｄ￣ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｘｙ￣
ｌａｔｅ] ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ (图 ４: Ｂ)ꎮ
２􀆰 ３　 对筛选到的活性化合物进行浓度梯度实验
我们还进一步对活性化合物进行浓度梯度实
验ꎬ 以验证其活性是靶点专一性而非假阳性ꎮ 由
于活性化合物 Ｘ１１ 样品量少ꎬ 不足以开展浓度
梯度实验ꎬ 并且其抗糖尿病活性已有文献报道
(Ｌｉ和 Ｑｕꎬ ２０１２)ꎬ 因此本文并未开展 Ｘ１１ 的浓
度梯度实验ꎬ 而只对活性化合物 Ｘ１５ 和 Ｘ１６ 进
行了浓度梯度实验ꎮ 结果表明ꎬ Ｘ１５ 在 ０􀆰 １ μｇ􀅰
ｍＬ－１ ~１０ μｇ􀅰ｍＬ－１浓度范围内具有很好的剂量依
赖性ꎬ 其最大活性浓度为 １０ μｇ / ｍＬꎬ 葡萄糖摄
取水平可提高 ４０􀆰 １％ (图 ３: Ｃ)ꎮ 而活性化合
物 Ｘ１６在 ０􀆰 ００１ μｇ􀅰ｍＬ－１ ~ １ μｇ􀅰ｍＬ－１浓度范围
内也存在很好的剂量依赖性ꎬ 最大活性浓度为 １
μｇ􀅰ｍＬ－１ꎬ 葡萄糖摄取水平可提高 ４１􀆰 ８％ (图
３: Ｄ)ꎮ 但随着 Ｘ１６ 浓度的进一步增加 (１０ 或
２０ μｇ􀅰ｍＬ－１)ꎬ 其活性反而下降ꎬ 提示在高浓度
下 Ｘ１６可能对细胞产生了其它影响ꎬ 造成促葡
萄糖吸收活性的下降ꎮ 结果表明ꎬ 该模型可以很
好地筛选出具有降糖活性的植物天然产物ꎬ 为进
一步开发新型抗糖尿病药物提供基础ꎮ
图 ３　 植物天然产物的筛选及活性化合物的早期发现ꎮ Ａ 和 Ｂꎬ
对 １６个植物来源的天然产物 (浓度为 １０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１或 １０ μｇ􀅰
ｍＬ－１) 在该细胞模型中进行活性筛选 (∗表示活性化合物ꎬ ｎ ＝
３)ꎻ Ｃꎬ 化合物 Ｘ１１的化学结构
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｉｄｅｎ￣
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ. Ａ ａｎｄ Ｂꎬ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ １６ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍ￣
ｐｏｕｎｄｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ. (Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎ￣
ｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｒｅ １０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｏｒ １０ μｇ􀅰ｍＬ－１ꎬ ∗ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ
ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓꎬ ｎ＝３). Ｃꎬ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｘ１１
５２８６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 胡海军等: 促葡萄糖摄取细胞模型的构建及应用　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
图 ４　 活性化合物的化学结构和浓度梯度实验ꎮ Ａꎬ 活性化合物 Ｘ１５的化学结构ꎻ Ｂꎬ 活性化合物 Ｘ１６的化学结构ꎻ
Ｃꎬ 活性化合物 Ｘ１５浓度梯度实验 (ｎ＝ ３)ꎻ Ｄꎬ 活性化合物 Ｘ１６浓度梯度实验 (ｎ＝ ３)
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｏｓｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ. Ａꎬ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｘ１５. Ｂꎬ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｘ１６. Ｃꎬ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｘ１５ (ｎ＝ ３).
Ｄꎬ Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ３Ｔ３￣Ｌ１ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｘ１６ (ｎ＝ ３)
３　 讨论
随着糖尿病患者数量的逐年增加和用于治疗
的巨额开支ꎬ 糖尿病已成为备受人们关注的社
会、 经济和健康问题ꎮ 目前ꎬ 常用的抗糖尿病药
主要有二甲双胍类、 噻唑烷二酮类、 硫脲类和非
硫脲类等 (Ｎａｔｈａｎ 等ꎬ ２００９)ꎮ 由于目前临床上
使用的抗糖尿病药都存在一定的局限性ꎬ 因此ꎬ
开发出新型的、 更高效安全的抗糖尿病药将具有
重要意义ꎮ 通常ꎬ 新型抗糖尿病药物的开发过程
是从植物资源中分离出各种化合物ꎬ 建立化合物
库ꎬ 然后利用各种抗糖尿病药物筛选模型从中筛
选出活性化合物ꎬ 再以这些活性化合物作为候选
化合物ꎬ 经过一系列修饰改造、 药效评价和安全
评价之后最终开发成新型抗糖尿病药 (图 １:
Ａ)ꎮ 因此ꎬ 新型抗糖尿病药物的研发依赖于各
种抗糖尿病药物筛选模型的应用ꎮ
在本研究中ꎬ 我们首先进行了促葡萄糖摄取
细胞模型的构建ꎮ 该模型的原理是基于化合物能
否促进成熟 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞的葡萄糖摄取ꎬ 从而
判断该化合物的降糖活性情况ꎮ ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞
的培养是本研究的基础ꎬ 本研究所用 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪
细胞的分化率均在 ９５％以上 (图 １: Ｂ)ꎬ 完全能
满足实验要求ꎮ 为了检验细胞摄取葡萄糖的水平
是否可以对药物刺激做出灵敏响应ꎬ 我们用不同
浓度的胰岛素处理 ３Ｔ３￣Ｌ１脂肪细胞ꎬ 然后检测其
葡萄糖摄取量的差异ꎮ 胰岛素是一种非常强的降
血糖药物ꎬ 它能通过促进 ＧＬＴＵ４上膜来增加细胞
对葡萄糖的摄取 (Ｓａｌｔｉｅｌ 和 Ｋａｈｎꎬ ２００１)ꎮ 实验结
果表明ꎬ 在我们的体系中胰岛素可以显著地促进
脂肪细胞的葡萄糖摄取ꎬ 并且呈现很好的剂量依
赖关系ꎮ 在 １０ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１浓度下ꎬ ３Ｔ３￣Ｌｌ 脂肪细胞
的葡萄糖消耗量已经接近最大值ꎬ 约为对照的 ３
倍ꎮ 因此ꎬ 胰岛素可以作为筛选抗糖尿病药时的
阳性对照ꎬ 来判断待测化合物的活性情况ꎮ
罗格列酮是临床上广泛使用的一种非胰岛素
抗糖尿病药ꎬ 本模型用其作为另一阳性对照ꎮ 罗
格列酮主要是通过与转录因子 ＰＰＡＲγ 结合ꎬ 激
活 ＰＰＡＲγꎬ 进而调控一些糖代谢和脂代谢相关
基因的表达 (Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎꎬ １９９８)ꎮ 本研究发现罗
格列酮能显著地促进 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂肪细胞摄取葡萄
糖ꎬ 并且在 １００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１浓度下ꎬ 其活性达到最
大ꎮ 因此本模型选择罗格列酮作为筛选抗糖尿病
药物时的另一阳性对照ꎮ 当罗格列酮正常工作
时ꎬ 说明模型工作正常ꎬ 实验结果可靠ꎮ
我们的模型还可用于筛选胰岛素信号通路的
抑制剂ꎮ ２００ ｎｍｏｌ􀅰Ｌ－１胰岛素可以显著促进细胞
摄取葡萄糖ꎬ 通过检测化合物是否可以降低胰岛
素的这种促进效果ꎬ 可以筛选出胰岛素信号通路
６２８　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
抑制剂ꎮ 我们用已知的 Ａｋｔ１ / ２ 抑制剂来抑制胰
岛素信号通路ꎬ 发现它能显著地降低 ３Ｔ３￣Ｌ１ 脂
肪细胞的葡萄糖摄取ꎬ 并且呈现很好的剂量依赖
关系ꎬ 在 １０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１浓度下可将葡萄糖摄取量
恢复到基线水平ꎮ
植物天然产物是新药发现的一个重要来源ꎬ
其化学骨架具有多样性ꎬ 并且在植物中行使不同
的生物学功能ꎮ 我们应用构建好的抗糖尿病药物
筛选模型对 １６ 个植物来源的天然产物进行活性
筛选ꎮ 结果显示有 ３ 个化合物具有促进 ３Ｔ３￣Ｌ１
脂肪细胞摄取葡萄糖的活性ꎬ 它们分别是 Ｘ１１、
Ｘ１５和 Ｘ１６ꎮ 这三个化合物中ꎬ Ｘ１１ 已在 ３Ｔ３￣Ｌ１
脂肪细胞中发现具有抗糖尿病活性 (Ｌｉ 和 Ｑｕꎬ
２０１２)ꎬ 化合物 Ｘ１５的抗糖尿病活性是首次被发
现ꎬ 而 Ｘ１６之前只在体内报道过具有抗糖尿病
活性ꎬ 在细胞水平上属首次发现 (Ｍａｔｓｕｄａ 等ꎬ
１９９８)ꎮ 综上所述ꎬ 我们的模型可以非常有效地
筛选出植物中具有降糖活性的化合物ꎮ 今后ꎬ 我
们一方面将增加化合物数量、 扩大筛选范围ꎬ 以
筛选出更多的活性化合物类型ꎻ 另一方面将对活
性非常好的化合物的作用机制进行深入研究并进
行体内药效评价ꎬ 从而为开发出更加安全、 有效
的抗糖尿病药提供基础ꎮ
致谢　 感谢中国科学院西双版纳热带植物园张玉梅副研
究员以及中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物
资源持续利用国家重点实验室刘海洋研究员提供的样品ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
Ａｌｂｅｒｔｉ ＫＧꎬ Ｚｉｍｍｅｔ ＰＺꎬ １９９８. Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎꎬ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ. ｐａｒｔ １: ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ＷＨＯ
ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ [Ｊ] . Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ １５: ５３９—５５３
Ｃｈｅｎｇ ＡＹꎬ Ｆａｎｔｕｓ ＩＧꎬ ２００５. Ｏｒａｌ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｙｐｅ
２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ [Ｊ] . Ｃａｎａｄｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ
１７２: ２１３—２２６
Ｆｒｏｓｔ ＳＣꎬ Ｌａｎｅ ＭＤꎬ １９８５. Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｃｉｎａｌ
ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ３Ｔ３￣Ｌ１
ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ２６０: ２６４６—
２６５２
Ｇｏｖｅｒｓ Ｒꎬ Ｃｏｓｔｅｒ ＡＣＦꎬ Ｊａｍｅｓ ＤＥꎬ ２００４. Ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌ ｓｕｒ￣
ｆａｃｅ ＧＬＵＴ４ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｄｉｓｃｈａｒｇｉｎｇ ＧＬＵＴ４ ｉｎｔｏ ａ
ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ￣
ｏｇｙꎬ ２４: ６４５６—６４６６
Ｊｉｎ ＨＧꎬ Ｊｉｎ Ｑꎬ Ｋｉｍ ＡＲ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２. Ａ ｎｅｗ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｆｒｏｍ ａｌｉｓｍａ
ｏｒｉｅｎｔａｌｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ [Ｊ] . Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ３５: １９１９—１９２６
Ｌｅｎｅｙ ＳＥꎬ Ｔａｖａｒé ＪＭꎬ ２００９. Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ￣ｓｔｉｍｕｌａ￣
ｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ: ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇꎬ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｒｕｇ ｔａｒ￣
ｇｅｔｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬ ２０３: １—１８
Ｌｅｔｏ Ｄꎬ Ｓａｌｔｉｅｌ ＡＲꎬ ２０１２. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｉｎｓｕｌｉｎ:
ｔｒａｆｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＧＬＵＴ４ [Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉ￣
ｏｌｏｇｙꎬ １３: ３８３—３９６
Ｌｉ ＪＮ (李晋南)ꎬ Ｌｉｕ ＭＹ (刘铭瑶)ꎬ Ｈｏｕ ＹＴ (侯玉婷) ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９.
Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２１ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ３Ｔ３￣Ｌ１
ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ [Ｊ]. Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ￣
ｏｇｙ (中国生物化学与分子生物学学报)ꎬ ２５: ５５６—５６２
Ｌｉ Ｑꎬ Ｑｕ Ｈꎬ ２０１２. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏ￣
ｌｉｓｍ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ａｌｉｓｍａｔｉｓ ｒｈｉｚｏｍａ [Ｊ] . Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａꎬ ８３:
１０４６—１０５３
Ｍａｔｓｕｄａ Ｈꎬ Ｌｉ Ｙꎬ Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９８. Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ. ＩＩＩ. ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
ａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｏｎ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ
[Ｊ] . Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎꎬ ４６: １３９９—１４０３
Ｍａｙｅｒｓｏｎ ＡＢꎬ Ｈｕｎｄａｌ ＲＳꎬ Ｄｕｆｏｕｒ Ｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２. Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｓ￣
ｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｏｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎬ ｌｉｐｏｌｙｓｉｓꎬ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｄ ｓｋｅｌｅ￣
ｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ
[Ｊ] . Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ ５１: ７９７—８０２
Ｎａｔｈａｎ ＤＭꎬ Ｂｕｓｅ ＪＢꎬ Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＭＢ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９. Ｍｅｄｉｃａｌ ｍａｎａｇｅ￣
ｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ｉｎ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ: ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｙ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｔｈｅ ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ [Ｊ] . Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅꎬ ３２: １９３—２０３
Ｓａｌｔｉｅｌ ＡＲꎬ Ｋａｈｎ ＣＲꎬ ２００１. Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ [Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅꎬ ４１４: ７９９—８０６
Ｓｍｉｔｈ ＪＤꎬ Ｃｌｉｎａｒｄ ＶＢꎬ ２０１４. Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ａｎｄ ｃｏｍｏｒｂｉｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎꎬ ５４: ｅ３０４—ｅ３２１
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ Ｂꎬ １９９８. ＰＰＡＲ￣ｇａｍｍａ: ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｉａｚｏ￣
ｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ [Ｊ] . Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ ４７: ５０７—５１４
Ｖｉｎｉｋ ＡＩꎬ Ｖｉｎｉｋ Ｅꎬ ２００３. Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ
[Ｊ] . Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｎａｇｅｄ Ｃａｒｅꎬ ９: Ｓ６３—Ｓ８０
Ｗｅｉｌｌ Ｊꎬ Ｖａｎｄｅｒｂｅｃｋｅｎ Ｓꎬ Ｆｒｏｇｕｅｌ Ｐꎬ ２００４. Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｓｉｎｇ
ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ [Ｊ] . Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｄｉｓ￣
ｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄꎬ ８９: ５０２—５０４
Ｗｈｉｔｉｎｇ ＤＲꎬ Ｇｕａｒｉｇｕａｔａ Ｌꎬ Ｗｅｉｌ Ｃ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１. ＩＤＦ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｔｌａｓ:
ｇｌｏｂａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｆｏｒ ２０１１ ａｎｄ ２０３０
[Ｊ] . Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅꎬ ９４: ３１１—３２１
Ｘｉｅ ＪＱ (谢洁琼)ꎬ ２００５. Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎｔｉ￣ｄｉａｂｅｔｉｃ ｄｒｕｇｓ [Ｄ]. Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ (中国人民解放军军事医学科学院)
Ｚｈｏｕ Ｌꎬ Ｙａｎｇ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７. Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｉｎｓｕｌｉｎ [Ｊ] . Ｍｅｔａｂ￣
ｏｌｉｓｍꎬ ５６: ４０５—４１２
７２８６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 胡海军等: 促葡萄糖摄取细胞模型的构建及应用