全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (2): 141~146 141
收稿 2011-12-08 修定 2012-01-12
资助 河南科技大学大学生研究训练计划项目(SRTP2009113)。
* 通讯作者(E-mail: gnaiqeuxil@l63.com; Tel: 0379-
64282669)。
6-BA、NAA和2,4-D不同配比对荠菜愈伤组织诱导、生长及植株再生的
影响
李文静1, 李学强1,*, 贾毛毛2, 唐洪梅1, 宋乾江1, 连少英1
1河南科技大学林学院, 河南洛阳471003; 2华中农业大学园艺林学学院, 武汉430070
摘要: 以野生荠菜[Capsella bursa-pastoris (L.) Medic]无菌苗为试材, 选取下胚轴、子叶、真叶和叶柄作为外植体, 研究了
不同外植体的出愈情况, 不同植物生长调节剂及配比对愈伤组织诱导、继代及植株再生的影响。结果表明: (1)下胚轴作为
外植体出愈情况最好, 继代后生长快; (2)下胚轴愈伤组织的最适植株再生培养基为MS+2~3 mg·L-1 6-BA+0.2~0.6 mg·L-1
NAA; (3)愈伤组织培养阶段的2,4-D浓度对其植株再生能力有影响。
关键词: 荠菜; 愈伤组织; 植株再生; 2,4-D
Effects of 6-BA, NAA and 2,4-D on Callus Induction, Growth and Plantlet Re-
generation of Shepherd’s Purse [Capsella bursa-pastoris (L.) Medic]
LI Wen-Jing1, LI Xue-Qiang1,*, JIA Mao-Mao2, TANG Hong-Mei1, SONG Qian-Jiang1, LIAN Shao-Ying1
1Forestry College of Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China; 2College of Horticulture and
Forestry Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract: The test material is the germ-free plants of shepherd’s purse [Capsella bursa-pastoris (L.) Medic].
Using the hypocotyls, the cotyledons, the leaves and the petioles as explants, the appearance of different ex-
plants on callus induction and the effects of the different medium on callus induction, callus subculture and
plant regeneration were investigated. The results showed that: (1) the hypocotyl was the best explant for callus
induction and subculture; (2) the favorable medium of plant regeneration for the hypocotyls was MS+2-3 mg·L-1
6-BA+0.2-0.6 mg·L-1 NAA; (3) the concentration of 2,4-D that was used in callus growing had obvious effect
on the callus redifferentiation.
Key words: shepherd’s purse [Capsella bursa-pastoris (L.) Medic]; callus; plantlet regeneration; 2,4-D
荠菜[Capsella bursa-pastoris (L.) Medic]为
十字花科(Cruciferae)一年生草本植物, 别名野
荠、护生草、鸡心菜等。其叶绿鲜嫩、气味清
香、味道鲜美、营养丰富, 又有一定药用功效, 富
含Vc及Ca、P、Fe等人体必需的矿物质元素。全
株可入药 , 具清热利尿、止血、凉血、明目降
压、消炎解毒等功效而颇受城乡人民所喜爱。目
前, 荠菜的繁殖主要是依靠种子, 但种子繁殖有很
大的局限性: 首先, 种子繁殖会使一些品种的某
些优良性状难以保持; 其次, 种子发芽率低, 即使
在最适宜的条件下, 其萌发率也只有23.33% (亚
吉东等2009); 第三, 利用种子繁殖长成成株的时
间长 , 而利用组培苗进行生产则可克服上述缺
点。关于荠菜组培的研究, 目前国内只见到王丽
艳等(2007)和贾毛毛等(2010)的研究报道, 他们均
以种子培养的无菌苗为外植体 , 经过丛生芽诱
导、继代以及生根, 培育出完整植株并成功移栽,
初步建立了荠菜的无菌快繁体系; 国外有Bonfils
等(1992)及Sigareva和Earle (1999)对荠菜的胚培
养进行了一些研究; 有关荠菜愈伤组织诱导、再
生植株的研究却少有人涉及, 迄今国内外仅见到
Zilkah和Gressel (1977)的报道。本试验是以野生
荠菜无菌苗为试材, 选取下胚轴、子叶、真叶和
叶柄作为外植体, 研究了不同植物生长调节剂及
其配比对其愈伤组织诱导、继代及植株再生的影
响, 为荠菜植株再生体系及遗传转化体系的建立
提供理论依据。
植物生理学报142
材料与方法
1 材料
荠菜[Capsella bursa-pastoris (L.) Medic]无菌
苗。
2 方法
2.1 外植体的处理
无菌条件下, 从苗龄为10 d的无菌苗上, 取下
胚轴和子叶, 下胚轴剪到约0.8 cm长, 单个子叶作
为一个外植体。从苗龄为25 d的无菌苗上, 取叶柄
和真叶, 单个叶柄作为一个外植体, 叶片修剪成约
0.5 cm2。将外植体分别接种在诱导培养基上, 每
种外植体接种3瓶, 每瓶接4个, 重复2次。要求子
叶和叶片的背面接触培养基表面。
接种完毕, 将三角瓶置于以下环境条件中: 温
度(光照) 25 ℃、(黑暗) 18 ℃, 光照时间14 h·d-1, 光
照强度20~30 µmol·m-2·s-1, 相对湿度80%。之后观
察试验结果。
2.2 6-BA与2,4-D组合处理方法
在MS培养基中添加2、4、6 mg·L-1 6-BA和
0.5、1.0、2.0 mg·L-1 2,4-D组合成9种配方, 即BD系
列I, 分别用B2D0.5、B2D1.0、B2D2.0、B4D0.5、
B4D1.0、B4D2.0、B6D0.5、B6D1.0、B6D2.0共9
个代号表示; 添加0.5、1.0、2.0 mg·L-1 6-BA和1、
2、3 mg·L-1 2,4-D组合成9种配方, 即BD系列II, 分
别用B0.5D1、B0.5D2、B0.5D3、B1.0D1、
B1.0D2、B1.0D3、B2.0D1、B2.0D2、B2.0D3共9
个代号表示, 代号中字母B表示6-BA, D表示2,4-D,
字母后数字表示该植物生长调节剂的浓度。将下
胚轴和子叶分别接种在BD系列I的培养基上, 叶柄
和真叶分别接种在BD系列II的培养基上。接种25
d后进行外植体出愈率, 愈伤组织颜色和质地的统
计, 40 d后记录生长势并用相同的培养基进行继代,
观察继代愈伤组织的生长势。
2.3 6-BA与NAA组合处理方法
在MS培养基中分别添加2、3、4 mg·L-1 6-BA
和0.2、0.4、0.6 mg·L-1 NAA组合成9种配方, 即BN
系列 , 分别用B 2 N 0 . 2、B 2 N 0 . 4、B 2 N 0 . 6、
B3N0.2、B3N0.4、B3N0.6、B4N0.2、B4N0.4、
B4N0.6共9个代号表示, 代号中字母B表示6-BA, N
表示NAA, 字母后数字表示该植物生长调节剂的
浓度。选用在B2D0.5上诱导并经2次继代的下胚
轴愈伤组织作为材料, 接种在上述9种培养基中, 30
d后统计分化率。每个处理接3瓶, 每瓶3块愈伤组
织, 重复2次。
2.4 愈伤组织培养阶段2,4-D浓度及植株再生处理
方法
选用在B4D0.5、B4D1.0、B4D2.0上诱导并
经2次继代的下胚轴愈伤组织, 分别接种在BN系列
的培养基上。30 d后统计再分化率。每种材料接
27瓶, 每个处理3瓶, 共81瓶, 每瓶3块愈伤组织。
实验结果
1 6-BA与2,4-D的不同组合对愈伤组织诱导及生
长的影响
下胚轴和子叶在BD系列I的9种培养基上均能
诱导出愈伤组织, 愈伤组织的颜色稍有差别, 质地
无明显差异(表1)。接种后第5天在B2D0.5、B2D1.0、
B2D2.0中下胚轴两端先出现可见愈伤组织, 接种后
第7天在B2D0.5中子叶基部切口处出现可见愈伤
组织, 到第9天几乎每种培养基中的外植体均出现
可见愈伤组织。总之, B2D0.5、B2D1.0、B2D2.0
中的外植体出愈率高, 愈伤组织米黄色、质地疏
松粗糙、质量好, 这说明下胚轴和子叶愈伤组织
诱导时对6-BA比较敏感, 其最适浓度为2 mg·L-1。
叶柄和真叶在BD系列II的9种培养基上均能
诱导出愈伤组织, 愈伤组织的颜色稍有差别, 质地
却有明显差异(表2)。接种后第9天, 在叶柄两端和
真叶切口处有可见愈伤组织出现。颜色上, 叶柄
的愈伤组织较真叶的有光泽, 多为浅黄色或黄绿
色; 质地上, 愈伤组织小颗粒在B0.5D1、B1.0D1、
B2.0D1中均疏松粗糙, 而在B0.5D3、B1.0D3、
B2.0D3中均较离散。B0.5D1、B1.0D1、B2.0D1
上的愈伤组织浅黄绿色或浅黄色、质地疏松粗
糙、质量好, 这说明真叶和叶柄愈伤组织诱导时
对2,4-D比较敏感, 其最适浓度为1 mg·L-1。
下胚轴和子叶愈伤组织诱导时, 下胚轴比子
叶出愈早, 且愈伤组织生长快, 长势好。真叶和叶
柄愈伤组织诱导时, 二者可见愈伤组织出现的时
期相同, 但均晚于子叶, 而且生长较慢。综合比较
4种外植体的愈伤组织在所设培养基上生长状况
(图1), 可以认为下胚轴为愈伤组织诱导的最适外
植体。
李文静等: 6-BA、NAA和2,4-D不同配比对荠菜愈伤组织诱导、生长及植株再生的影响 143
2 6-BA与NAA的不同组合对下胚轴愈伤组织植株
再生的影响
在B2D0.5上诱导并经2次继代的下胚轴愈伤
组织在BN系列的9种培养基上均能诱导出再生芽,
在一些培养基中还出现了根(图2)。B2N0.2、
B2N0.6、B3N0.2、B3N0.6中再分化愈伤组织块数
较多, 出芽数也比较多(表3)。接种后2周, B2N0.2
中出现一个带有2片小叶的芽, B3N0.2、B3N0.6上
已分化大量小芽点; B3N0.4中最先有根的分化。
接种后5周时, B2N0.2、B3N0.2、B3N0.6上芽较
大 , 在B3N0.2中一株已抽出花薹 , B4N0.2、
B4N0.4、B4N0.6培养基上再生芽很多, 但长势很
弱, 畸形较严重; B2N0.4培养基上芽较少, 而是有
大量的根; 培养基B2N0.6上芽较正常。由以上结
果可知, 6-BA浓度在2~3 mg·L-1时对植株再生的效
果最好, 而NAA浓度在2~6 mg·L-1时对植株再生的
影响差异不大。
3 愈伤组织培养阶段2,4-D浓度对植株再生的影响
随着愈伤组织培养阶段2,4-D浓度的增加, 愈
伤组织的再分化率降低(图3和表4)。接种2周后,
B4D0.5的愈伤组织在B2N0.2、B2N0.6上已有少量
再生芽, B2N0.4、B4N0.2、B4N0.4、B4N0.6上有
较多小芽点分布; B4D1.0的愈伤组织在B2N0.2、
B2N0.4、B2N0.6上有少量幼根分化, 其余几种培
养基上的愈伤组织蓬松, 仅边缘发绿; B4D2.0的愈
伤组织仍为淡黄色, 只是有大量生长。接种5周后,
表2 真叶、叶柄愈伤组织生长情况
Table 2 Growth state of callus from leave and petiole
真叶 叶柄
调节剂组合
出愈率/%
愈伤组 愈伤组 愈伤组织长势
出愈率/%
愈伤组 愈伤组 愈伤组织长势
织颜色 织质地 诱导 继代 织颜色 织质地 诱导 继代
B0.5D1 100 淡黄 疏松粗糙 + + 100 淡黄 疏松粗糙 ++ ++
B0.5D2 100 浅黄 较疏松 + + 100 浅黄褐 较疏松 + +
B0.5D3 100 淡黄 离散松软 + + 100 淡黄 离散松软 + +
B1.0D1 100 浅黄绿 疏松粗糙 ++ ++ 100 浅黄绿 疏松粗糙 ++ +
B1.0D2 92 浅黄 较疏松 + - 100 浅黄绿 较疏松 - -
B1.0D3 100 浅黄绿 离散松软 + + 75 浅黄绿 离散松软 - ++
B2.0D1 75 浅黄 疏松粗糙 - +++ 92 浅黄绿 疏松粗糙 ++ ++
B2.0D2 75 浅黄绿 较疏松 ++ ++ 100 浅黄绿 较疏松 + ++
B2.0D3 75 浅黄 离散松软 + + 83 浅黄绿 离散松软 - -
表中为接种25 d的统计数据; +++表示长势非常好, ++表示长势很好, +表示长势一般, -表示长势差。
表1 下胚轴、子叶愈伤组织生长情况
Table 1 Growth state of callus from hypocotyl and cotyledon
下胚轴 子叶
调节剂组合
出愈率/%
愈伤组 愈伤组 愈伤组织长势
出愈率/%
愈伤组 愈伤组 愈伤组织长势
织颜色 织质地 诱导 继代 织颜色 织质地 诱导 继代
B2D0.5 100.00 米黄 疏松粗糙 ++ ++ 100.00 米黄 疏松粗糙 + +
B2D1.0 100.00 米黄 疏松粗糙 +++ ++ 100.00 米黄 疏松粗糙 ++ ++
B2D2.0 92.00 米黄 疏松粗糙 ++ + 100.00 米黄 疏松粗糙 ++ +++
B4D0.5 62.50 嫩黄 疏松粗糙 + +++ 62.50 淡黄 疏松粗糙 ++ +
B4D1.0 58.33 淡黄 疏松粗糙 + +++ 75.00 淡黄 疏松粗糙 + +
B4D2.0 37.50 淡黄 疏松粗糙 + ++ 75.00 淡黄 疏松粗糙 + +
B6D0.5 33.33 淡黄 疏松粗糙 - + 16.67 浅黄 疏松粗糙 + -
B6D1.0 33.33 淡黄 疏松粗糙 - + 25.00 浅黄 疏松粗糙 - -
B6D2.0 58.33 淡黄 疏松粗糙 + + 58.33 浅黄 疏松粗糙 + +
表中为接种25 d的统计数据; +++表示长势非常好, ++表示长势很好, +表示长势一般, -表示长势差。
植物生理学报144
表3 不同培养基对植株再生的影响
Table 3 Effect of different mediums on plantlet regeneration
调节剂组合 接种组织数/块 再分化数/块 出芽数/个 单块出芽数/个
B2N0.2 9 7 24 2.67
B2N0.4 9 2 1 0.11
B2N0.6 9 7 16 1.78
B3N0.2 9 8 30 3.33
B3N0.4 9 5 20 2.22
B3N0.6 9 7 18 2.00
B4N0.2 9 6 15 1.67
B4N0.4 9 2 3 0.33
B4N0.6 9 5 16 1.78
表中为接种30 d的统计数据。
B4D0.5的愈伤组织几乎在所有培养基上都有再生
芽, 在B2N0.4、B2N0.6、B3N0.2、B3N0.4、
B4N0.4内还有根的生成; B4D1.0的愈伤组织几乎
在所有培养基上都有根的生成, 仅在B2N0.6上有
再生芽; B4D2.0的愈伤组织仅在B3N0.6、B4N0.4
上有器官分化, 其中B3N0.6上有2个芽、B4N0.4上
有几条短根。总之, B4D0.5的愈伤组织再生芽很
多, B4D1.0的愈伤组织分化的根很多、再生芽很
少, B4D2.0的愈伤组织再生的根和芽都很少。说
明在愈伤组织生长阶段培养基中添加较高浓度的
2,4-D不利于愈伤组织的植株再生。
图1 四种外植体的愈伤组织诱导
Fig.1 Callus induction from four kinds of explants
A、B分别为接种15 d后的下胚轴和子叶愈伤组织; C、D分别为接种10 d后的叶柄和真叶愈伤组织; E、F、G、H分别是接种5周的下
胚轴、子叶、叶柄、真叶愈伤组织。
图2 下胚轴愈伤组织的植株再生
Fig.2 Plantlet regeneration of callus form hypocotyls
A是接种2周后的再生芽; B、C: 接种5周后的再生芽, 其中B为玻璃化的芽, C为正常芽; D、E分别是分化的芽和幼根; F、G、H分别
是解剖镜下看到的再生根、芽、完整植株。
李文静等: 6-BA、NAA和2,4-D不同配比对荠菜愈伤组织诱导、生长及植株再生的影响 145
表4 培养基中添加不同浓度2,4-D长成
的愈伤组织的再分化率
Table 4 The rate of regeneration of callus develop from
medium with different concentration of 2,4-D
调节剂组合
愈伤组织再分化率/%
B4D0.5 B4D1.0 B4D2.0
B2N0.2 77.78 22.22 0
B2N0.4 66.67 33.33 0
B2N0.6 22.22 55.56 0
B3N0.2 44.44 0 0
B3N0.4 0 0 0
B3N0.6 66.67 66.67 0
B4N0.2 55.56 22.22 22.22
B4N0.4 33.33 0 0
B4N0.6 55.56 11.11 0
表中为接种30 d的统计数据。再分化率为分化出芽或根的愈
伤组织块比率。
讨 论
从本试验结果可以看出, 不同的外植体在不
同培养基上的愈伤组织诱导表现有很大差异, 下
胚轴接种后第5天就出现可见愈伤组织, 而真叶和
叶柄接种后第9天愈伤组织才出现, 而且愈伤组织
的质地、生长速度也有差异。产生这种差异的原
图3 不同2,4-D浓度下生长的愈伤组织的再分化情况
Fig.3 The condition of regeneration of develop form medium with different concentration of 2,4-D
A、B、C是B4D0.5的愈伤组织; D、E、F是B4D1.0的愈伤组织; G、H、I是B4D2.0的愈伤组织。均为接种后2周情况。
因可能与外植体、培养基都有关系。王媛媛等
(2010)以南方紫花苜蓿为试材, 得到下胚轴作为外
植体诱导愈伤组织的效果较好; 张徐俞等(2011)在
研究天台铁线莲愈伤组织诱导时得出嫩茎为最佳
外植体, 这些研究表明不同的植物材料其诱导愈
伤组织的最适外植体的不同, 本试验虽然未将4种
外植体接种在完全一致的培养基上进行比较, 但
从4种外植体在不同培养基上的综合表现仍可看
出下胚轴表现最好, 可以认为下胚轴是诱导外植
体最好的愈伤组织。当然, 培养基的不同所导致
的差异也是不可忽视的, 关于荠菜不同外植体愈
伤组织诱导的最适培养基还需进一步研究。
本试验中, 对生长在含有不同2,4-D浓度培养
基中的下胚轴愈伤组织进行植株再生时发现, 在
2,4-D浓度较高培养基上生长的愈伤组织, 植株再
生能力有所降低。刘福平和陈移亮(2008)在研究
细胞分裂素对蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的影响时
发现, 外植体在只含2,4-D培养基上诱导的愈伤组
织没有胚性, 王媛媛等(2010)以南方紫花苜蓿为试
材研究时, 发现2,4-D浓度过高时, 愈伤组织呈水浸
状, 乳白或灰色, 无再分化能力。以上研究都说明
在愈伤组织培养阶段2,4-D浓度对愈伤组织的植株
植物生理学报146
再生能力有着较大的影响, 此阶段较高的2,4-D浓
度会抑制其植株再生能力。
参考文献
贾毛毛, 李学强, 李文静(2010). 荠菜快繁体系初步研究. 北方园艺,
(24): 157~159
刘福平, 陈移亮(2008). 细胞分裂素对蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的
影响. 热带作物学报, 29 (1): 42~46
王丽艳, 荆瑞勇, 郭培磊(2007). 荠菜无菌快速繁殖技术的研究. 黑
龙江八一农垦大学学报, 19 (3): 13~16
王媛媛, 柳小妮, 柏东山(2010). 三个南方紫花苜蓿品种的耐盐性及
其再生体系的建立. 甘肃农业大学学报, 45 (2): 127~133
亚吉东, 李树珍, 申仕康, 申意, 王跃华, 蒋连计(2009). 荠菜(Cap-
sella bursa-pastoris (L.) Medic)种子萌发特性. 种子, 28 (1):
37~39
张徐俞, 蒋明, 陈彤, 李温平, 倪雪莉(2011). 天台铁线莲愈伤组织诱
导研究. 江苏农业科学, 39 (3): 65~66
Bonfils AC, Gleddie SC, Webb JA, Keller WA (1992). Somatic em-
bryogenesis from cell suspension and protoplast cultures of
Capsella bursa-pastoris (L.) Medic. In Vitro Cell Dev Biol, 28:
137~142
Sigareva MA, Earle ED (1999). Regeneration of plants from pro-
toplasts of Capsella bursa-pastoris and somatic hybridization
with rapid cycling Brassica oleracea. Plant Cell Rep, 18:
412~417
Zilkah S, Gressel J (1977). Cell cultures vs. whole plants for measur-
ing phytotoxicity. I. The establishment and growth of callus and
suspension cultures; definition of factors affecting toxicity on
celli. Plant Cell Physiol, 18: 641~655