全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 668~678　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0141668
收稿 2015-03-06　　修定 2015-03-30
资助 国家自然科学基金(30971806、31201266和31401430)、国
家“948”项目(2014-Z39)和山西省煤基重点科技攻关项目
(FT-2014-01)。
* 通讯作者(E-mail: rli2001@hotmail.com; Tel: 0354-6288374)。
种子特异表达二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1)提高亚麻荠种子油脂
积累
苑丽霞1,2, 毛雪1, 高昌勇1, 张莉1, 薛金爱1, 杨致荣1, 李润植1,*
1山西农业大学分子农业与生物能源研究所, 山西太谷030801; 2晋中学院生物科学与技术学院, 山西晋中030600
摘要: 亚麻荠(Camelina sativa)是一种“低耗、高效、环保”的非粮型工业油料作物。为提高亚麻荠种子含油量, 将来源于一
种菊科野生油料植物(Vernonia galamensis)高酶活性的二酰甘油酰基转移酶1 cDNA克隆(VgDGAT1)在发育种子中特异表
达。VgDGAT1超表达导致转基因亚麻荠种子中DGAT酶活性提高了30多倍。VgDGAT1高表达的亚麻荠种子含油量从野生
型的37%提高到46%~51%, 而且蛋白质积累未减少, 表明对DGAT酶基因进行遗传修饰可打破种子油和蛋白含量的负相关
连锁。此外, VgDGAT1高表达也没有对种子重量和种子萌发等农艺性状造成不良影响。这种高油亚麻荠基因工程新种质
可进一步用于商业化优良新品种的培育。
关键词: 亚麻荠; 二酰甘油酰基转移酶(DGAT); 种子特异表达; 种子油脂合成积累
Seed-Specific Over-Expression of a Diacylglycerol Acyltransferase 1 Gene (VgDGAT1)
Increase Seed Oil Accumulation in Camelina sativa
YUAN Li-Xia1, 2, MAO Xue1, GAO Chang-Yong1, ZHANG Li1, XUE Jin-Ai1, YANG Zhi-Rong1, LI Run-Zhi1,*
1Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China; 2College of Bio-
logical Science and Technology, Jinzhong University, Jinzhong, Shanxi 030600, China
Abstract: Camelina sativa is an important non-food industrial oilseed with “low-input, high efficiency and en-
vironment-friendly”. To enhance seed oil content for meeting an increasing market demand, a cDNA clone (Vg-
DGAT1) encoding type 1 diacylglycerol acyltransferase from Vernonia galamensis with the higher DGAT enzy-
matic activity was introduced into camelina by Agrobacterium-mediated floral dip infiltration. Seed-specific
over-expression of VgDGAT1 significantly enhanced the DGAT activity in the transgenic seeds by 30 folds
more compared to the wild-type control, resulting in seed oil content increase from 37% (dry weight) in the
wild-type seeds up to 46%–51% in the transgenics. However, seed protein level was not significant difference
between the transgenic and the wild type, indicating that genetic modification on DGAT can break up the nega-
tive genetic linkage of oil and protein contents in seeds. Moreover, the seed-specific high expression of Vg-
DGAT1 did not adversely affect seed weight, seed germination and other agronomic traits. Such novel engi-
neered camelina lines with higher seed oil content and no reduction of protein accumulation could be used for
breeding new camelina varieties with multiple excellent agronomic traits for commercialization.
Key words: Camelina sativa; diacylglycerol acyltransferase (DGAT); seed-specific expression; seed oil synthe-
sis and accumulation
亚麻荠(Camelina sativa)是一种十字花科的油
料作物, 其种植历史可追溯到青铜器时代(公元前
1500年~公元前400年)。在高产的油料作物油菜
(Brassica napus)大面积引进种植前, 亚麻荠在欧洲
东南部和亚洲西南部地区广为栽培许多世纪, 一
直到20世纪中叶, 亚麻荠仍是欧洲一些国家和俄
罗斯等地的重要油料作物(Eynck和Falk 2013)。近
十几年来, 随着全球应对化石能源危机和研发绿
色可持续生物能源的蓬勃发展, 亚麻荠以其独特
的栽培特性(生育期短, 水肥需求低, 适应多种逆境
和高抗多种病虫草害 )、种子含油量高 (34%~
45%)、以及种子油脂超过90%为不饱和脂肪酸和
适于炼制航空燃油、生物柴油和其他高值油脂工
苑丽霞等: 种子特异表达二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1)提高亚麻荠种子油脂积累 669
业产品等, 被重新发掘出来作为一种“低投入、高
效率、环保型”的替代性非粮工业油料作物(Geh-
ringer等2006; Moser 2012; Séguin-Swartz等2009)。
现今, 全世界许多国家已开始了亚麻荠新一轮的
种植及研究热潮(Kagale等2014; Singh等2015; Vol-
lmann和Eynck 2015)。亚麻荠已在美洲、欧洲和
大洋洲开始大面积种植和用于生物燃油生产, 我
国一些地区也不同规模地试种亚麻荠和开展亚麻
荠油脂产品的研发 (邓乾春等2009; 谢光辉等
2012)。
随着全球食用和工业用、特别是生物燃油对
植物油脂需求量日益剧增, 提高油料作物种子产量
和种子含油量就成为油料作物遗传改良的主要目
标。已有遗传研究显示, 与油菜和大豆等普通油料
作物一样, 亚麻荠种子含油量和蛋白含量为负相关
(Vollmann等2007), 提高种子含油量势必导致蛋白
质含量降低。因此, 由于蛋白含量相应减少, 提高
种子含油量所带来的附加值就会因榨油后种子副
产品利用价值减低而部分抵消。显然, 通过常规育
种方法培育高油和高蛋白的亚麻荠品种存在诸多
困难。近年来兴起的代谢工程技术为打破这种负
连锁和培育种子油脂和蛋白双高的油料作物新种
质提供了新途径(吴永美等2011; 岳爱琴和李润植
2009; Nguyen等2013; Vollmann和Eynck 2015)。
亚麻荠等油料作物种子所积累的油脂主要以
三酰甘油(triacylglycerol, TAG)形式储存于细胞油
体中。TAG的生物合成和积累过程涉及到一系列
酶基因和调节基因, 以及质体和内质网等亚细胞
结构。脂肪酸在质体内从头合成后转入细胞质,
并与CoA分子结合, 在内质网上进一步发生脱氢等
修饰反应, 再在一系列酰基转移酶(acyltransferase)
依次作用下, 结合于CoA分子的酰基(脂肪酸链)被
分别转移到甘油(glycerol)分子的sn-1、sn-2和sn-3
位置从而生成TAG (Ohlrogge和Browse 1995)。最
后一步酰基化反应, 即在二酰甘油(diacylglycerol,
DAG)中再导入一个酰基链生成TAG是TAG生物合
成途径的限速步骤(Wu等2012; Jako等2001; Zheng
等2008)。诸多试验证明, 二酰甘油酰基转移酶(di-
acylglycerol acyltransferase, DGAT) (EC 2.3.1.20)和
磷脂胆碱二酰甘油酰基转移酶(phospholipid: dia-
cylglycerol acyltransferase, PDAT) (EC2.3.1.43)参
与生成TAG的最后一步酰基化反应(Li等2010a;
Zhang等2009)。在动植物中 , 至少发现有两类
DGATs, 即DGAT1和DGAT2 (Burgal等2008; Shockey
等2006; Li等2013)。尽管二者不具序列同源性, 但
均能催化将结合于CoA的酰基转移到DAG分子的
sn-3位置生成TAG酶促反应。与DGAT不同, PDAT
不依赖酰基-CoA, 而是催化将磷脂酰胆碱(phos-
phatidylcholine, PC)分子中的酰基导入DAG分子的
sn-3位置生成TAG酶促反应(Dahlqvist等2000)。应
用基因修饰技术对DGAT酶表达进行遗传操作, 在
拟南芥、大豆和玉米等作物上已获得种子含油量
提高的工程株系(Jako等2001; Lardizabal等2008;
Oakes等2011)。
我们实验室前期从一种高油的野生菊科植物
Vernonia galamensis发育种子中分离到编码DGAT1
的cDNA克隆(VgDGAT1, GenBank登录号EF653277),
多种酶学试验证明VgDGAT1酶活性3倍多高于大
豆等油料作物DGAT1活性(Yu等2006, 2008)。在大
豆种子中特异共表达VgDGAT1和一种催化生成环
氧化脂肪酸的环氧化酶基因(SlEPX), 不仅使大豆
种子新合成了环氧化脂肪酸(积累量达总油脂的
15%), 而且完全克服了单独表达SlEPX引起的种子
油和蛋白含量减低以及其他负效应(Li等2010b,
2012), 显示了VgDGAT1在油料作物遗传改良及代
谢工程上重要应用价值。本文在亚麻荠种子中特
异超表达VgDGAT1基因, 以期培育种子含油明显
提高而蛋白质含量不减和其他农艺性状优良的新
种质。研究结果显示, 与空载体转基因亚麻荠和
非转化的对照植株相比 , 种子特异超表达Vg-
DGAT1基因的纯合转基因系成熟种子含油量由
37%提高到51%, 蛋白含量(28%)不减低和种子产
量等农艺性状未显负效应。本研究的发现有助于
全面认识亚麻荠等油料作物种子油脂等储藏物合
成积累调控机制, 也为其他油料作物种子代谢工
程提供借鉴。研究获得高油亚麻荠新种质可进一
步用于商业化优良新品种的培育。
材料与方法
1 目的基因及种子特异表达载体构建
本文所用靶基因为从菊科斑鸠菊属一种植物
Vernonia galamensis L.的发育种子中分离到编码
植物生理学报670
DGAT1的cDNA克隆(VgDGAT1, GenBank登录号
EF653276), 保存于本实验室。参见Li等(2010b)描
述的种子特异表达载体构建方法, 构建本实验用
于在亚麻荠[Camelina sativa (L.) Crantz]发育种子
中超表达VgDGAT1的植物表达载体。先将种子特
异表达盒(Phaseolin promoter-Cloning sites-Termi-
nator)转移到pBluescript载体多克隆位点, 接着将
VgDGAT1编码序列(1 571 bp)插入到种子特异表达
启动子下游, 形成携带有种子特异表达盒和靶基
因(Phaseolin promoter-VgDGAT1-Terminator)的中
间质粒载体。最后, 将该表达盒从中间质粒载体
上酶切下来, 再连接于表达载体pCAMBIA1301的
多克隆位点, 生成VgDGAT1种子特异表达载体(图
1), 仅载有种子特异表达盒、无VgDGAT1序列的
pCAMBIA1301载体用作空载体对照。
2 亚麻荠种质材料及其遗传转化
本文选用的亚麻荠种质材料为‘SNC104’, 种
子油和蛋白含量分别为37%和28% (种子干重)。
亚麻荠遗传转化采用Lu和Kang (2008)描述的农杆
菌介导花序浸染法(floral dip infiltration)进行。简
要操作如下: 上述构建的种子特异表达VgDGAT1
载体质粒用电击法导入根癌农杆菌GV3101菌株,
涂盘抗性选择培养(28 ℃)。挑取抗性阳性单克隆
于含有Kan 50 mg·L-1的5 mL YEP液体培养基(5
g·L-1 yeast extract, 10 g·L-1 peptone, 5 g·L-1 NaCl, pH
6.8)过夜震荡培养(28 ℃)。将过夜培养的菌液转
入500 mL相同培养基中震荡培养24~48 h, 离心
(4 000×g) 10 min收集菌体, 并重新悬浮于渗透培
养基(含有1/2MS盐离子, 50 g·L-1蔗糖和0.05% (V/V)
Silwet L77E表面活性剂)。
将生长于花盆内的早花期亚麻荠花序浸入新
悬浮的农杆菌渗透培养基, 于85 kPa压力下抽真空
5 min。菌液浸渗的亚麻荠植株用塑料袋覆盖24 h,
然后移植于苗床, 在温室正常条件下生长至成熟。
3 转基因植株的分子鉴定
将从转基因处理的亚麻荠植株收获的T1代种
子, 表面消毒后播种于含潮霉素的MS培养基上。
能萌发且正常生长的抗性阳性幼苗再移植于营养
苗床, 在温室下生长至成熟。取T1代植株幼叶提取
基因组DNA, 用常规Southern blot方法鉴定Vg-
DGAT1是否整合到亚麻荠基因组。选取仅检测出
一条VgDGAT1片段的T1代转基因植株收获T2代种
子用于后续试验和检测。
采用常规Northern blot方法检测VgDGAT1基
因是否种子特异高效表达(详见Li等2010b的描
述)。取T2代不同发育时期的种子, 以及取T2代种
图1 VgDGAT1基因种子特异表达载体pCAMBIA1301的构建
Fig.1 Schematic representation of seed-specific expression construct of VgDGAT1 in pCAMBIA1301
A: 载有VgDGAT1种子特异表达盒的中间载体pBluescript; B: 将VgDGAT1种子特异表达盒插入双元载体pCAMBIA1301的多克隆位点
形成VgDGAT1种子特异表达的植物表达载体; C: 仅含有种子特异表达盒的启动子和终止子、无VgDGAT1基因编码序列的pCAMBIA1301
载体, 用作空载体对照。Pha P: 菜豆蛋白启动子; Pha T: 菜豆蛋白终止子; VgDGAT1: Vernonia galamensis DGAT1酶基因编码序列; 35S: 花
椰菜花叶病毒35S启动子; HPT: 潮霉素抗性基因; GUS: β-葡萄糖苷酸酶; 35S poly A: 35S poly A信号; Nos poly A: 胭脂碱合酶poly A信号。
苑丽霞等: 种子特异表达二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1)提高亚麻荠种子油脂积累 671
子萌发长成的幼苗茎和叶片作为对照 , 提取总
RNA样品, 电泳分离、转膜和用生物素标记的Vg-
DGAT1探针进行杂交 , 以及自显影。检测样品
RNA blot带的有无及强弱来分析VgDGAT1转基因
是否种子特异表达和表达水平, 确定发育种子Vg-
DGAT1峰值表达时期。
T2和T3代转基因种子VgDGAT1表达水平的大
量样品检测采用荧光定量Real-time PCR方法(Xue
等2013)。正向和反向引物分别为: 5′-CAAGCCT-
GATGCTGGAATCG-3′和5′-TGCTTGAAGATGG-
CGTCAGA-3′。
Real-time PCR应用SYBR Green I试剂盒和
iCycler iQ定量PCR仪(Bio-Rad)。每个96孔PCR板
上同一RNA样品重复3次, 各RNA样品分别进行3
次独立的实验。PCR反应程序为: 95 ℃ 2 min; 95 ℃
30 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环; 最后72 ℃延
伸5 min。18S RNA用作内参对照。依Livak和
Schmittgen (2001)描述的方法计算各样品中VgDGAT1
的相对表达量。即ΔCT=CT目标基因–CT内参基
因, 目标基因的CT相对于内参基因的CT为2-ΔCT, 转
基因植株基因表达的变化表示为对照的2-ΔCT记为1
时目标基因2-ΔCT的相对值(即2-ΔΔCT), 各基因表达量
用均值±标准误表示。
4 微体蛋白提取与DGAT酶活性的测定
前期预实验显示发育种子中DGAT酶活性峰
值出现在发育时期3。因此, 本文用于DGAT酶活
性分析的样品均取自发育时期3的种子。依据Yu
等(2008)描述的方法进行微体蛋白分离和DGAT酶
活性分析。主要步骤包括: 取足量的发育种子样
品(500~800 mg), 置于液氮中研磨成粉末状, 加入
提取缓冲液(100 mmol·L-1 HEPES-KOH, pH 7.4,
0.32 mol·L-1蔗糖, 1 mmol·L-1 EDTA, 1 mmol·L-1二
硫苏糖醇), 冰上继续研磨。将研磨所得细胞混液
过滤后离心(10 000×g, 20 min), 取上清液超高速离
心(105 000×g, 1 h), 获得粗蛋白样品。用提取液重
新悬浮微体蛋白, 测蛋白浓度和将各样品蛋白浓
度标定一致便于后续分析。
DGAT酶活性测试所用放射性底物均从Sigma试
剂公司定制, 包括1-[14C]18:1-CoA (56 mCi·mmol-1)、
1-[14C]18:2-CoA (56 mCi·mmol-1)、1-[14C]18:3-CoA
(56 mCi·mmol-1)和18C DAG (sn-1, 2 di18:1, sn-1, 2
di18:2, sn-1, 2 di18:3) (56 mCi·mmol-1)。非放射性
标记的CoAs、ATP、CoASH以及TAG标样等酶活
性测试化学药品也购自Sigma。酶活性测试反应
体系(500 µL): 微体蛋白(富集DGAT) 100~200 µg,
90 mmol·L-1 HEPES-NaOH, 0.5 mmol·L-1 ATP, 0.5
mmol·L-1CoASH, 1 mmol·L-1 MgCl2, 200 µm
14C
labeled sn-1, 2 di18:1 (溶于0.02% Tween 20, V/V, 10
nCi·nmol-1), 18或40 µm 14C-labeled acyl-CoA (10
nCi·nmol-1)。反应体系在pH 7.4, 30 ℃水浴震荡
(100 r·min-1)反应30~60 min。加入二氯甲烷:异丙
醇(1:2)终止反应。分层后取有机相用硅胶G板进
行TLC层析, 分离和纯化放射性标记TAGs。层析
介质为已烷:二乙醚:乙酸(70:30:1, V/V/V)。用放射
性TCL扫描仪查看TCL板上放射性条带, 并将其带
刮下来, 用液体闪烁计数器检测各样品的放射性
TAG条带的放射强度, 并计算样品所含DGAT酶活
性[pmol·min-1·mg-1 (蛋白)]。
5 种子含油量、蛋白含量和脂肪酸成分的测定
亚麻荠种子含油量(%干重)和蛋白含量(%干
重)用近红外反射光谱种子成分分析仪(Perten
DA7200 NIR seed analyzer)测定。大量样品测定前,
系统标准曲线用一组已知含油量和蛋白含量的亚
麻荠品种标样(经多种化学分析方法验证)作精细
校正。每个品系取样重复6次, 每个样品测试3次,
计算平均值和标准误。
种子脂肪酸成分测定依据薛金爱等(2013)描
述的方法进行。取25~30 mg种子研磨成粉末, 加
入三甲基氢氧化物或2.5% (V/V)硫酸甲醇溶液, 转
移至玻璃试管中进行甲酯化反应, 同时加入十七
烷酸甘油三酯(17:0)作为内标 , 加入1 mL含有
0.01% (W/V)丁化羟基甲苯(BHT)防止脂肪酸氧化,
混匀后离心分层。取上层[含脂肪酸甲酯(FAME)
的己烷层]用于Hewlett-Packard 5890A气相色谱仪
(0.25 mm i.d.×0.33 μm×10 m FFAP柱, 火焰离子化
检测器)检测各种脂肪酸, 并计算脂肪酸含量。
上述所有测试数据均用SAS统计分析包相应
软件进行统计学分析, 差异显著性用t-test检验。
实验结果
1 转基因亚麻荠植株的分子鉴定
采用农杆菌介导花序浸染法对亚麻荠进行遗
植物生理学报672
传转化, 从转化植株上收获种子, 在含有潮霉素的
1/2MS培养基上能萌发的种子, 再栽植于育苗营养
土中, 共获得193株潮霉素抗性T1代亚麻荠植株。
取T1代植株的叶片分别提取核基因组DNA, 用
Southern blot和PCR分别鉴定VGDGAT1基因的整
合。从仅有一条杂交片段的T1株系上收获T2代种
子。T2代种子在含有抗生素培养基上萌发和移栽
于苗床, 生长至成熟并收获T3代种子。
为检测VgDGAT1基因是否按设计仅在发育种
子中表达, 分别取T1代植株茎、叶片组织和不同发
育时期的T2代种子样品, 用Northern blot和RT-PCR
检测VgDGAT1基因表达情况。依据亚麻荠种子大
小、色泽和鲜重以及花后天数(DAF)将种子分为5
个不同发育时期取样(发育时期1至发育时期5) (图
2)。发育时期2及以前为种子发育早期阶段(幼期),
发育时期3和4为种子快速生长阶段(中期), 从发育
时期5起, 种子开始脱水、颜色变黄, 至成熟(成熟
期)。Northern blot (图3)显示, 非转基因植株叶片,
转基因T1代茎和叶片组织均未检测到VgDGAT1表
达。然而, 转基因T2代种子中VgDGAT1高表达, 以
发育时期3表达量最大。这表明VgDGAT1仅在发
育种子中特异表达。
接着, 我们取发育时期3的种子RNA样品, 用
Real-time PCR分别检测T3代转基因系(61个VgDGAT1
转基因纯合系)种子中VgDGAT1的表达。由图4可
见, VgDGAT1在所检测的各转基因系种子中均高表
达。统计分析显示在不同转基因系种子中表达量高
低有显著差异(P<0.05), 但未达极显著水平(P<0.01)。
2 转基因发育种子中DGAT活性检测
如引言中所述, 与膜结合的DGAT催化酰基-
CoA分子中的酰基转移到DAG分子的sn-3位置而
形成TAG。为鉴定导入并在种子特异表达的Vg-
DGAT1所编码的蛋白是否正确行使功能, 我们分
析T3代转基因系发育种子的DGAT活性。我们前
图3 转基因亚麻荠种子及茎叶组织中VgDGAT1表达的
Northern blot分析
Fig.3 Northern blot on development seeds and other tissues of
VgDGAT1 transgenic camelina
图2 亚麻荠种子和角果5个发育时期的形态及种子鲜重
Fig.2 Five development stages of camelina seeds and siliques and seed fresh weight
苑丽霞等: 种子特异表达二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1)提高亚麻荠种子油脂积累 673
期试验证实发育种子中DGAT活性从发育时期3
开始急剧升高 , 在发育时期 4达峰值 ( L i等
2010b)。因此, 本文用于种子DGAT活性检测的
样品均取样于发育时期4的种子, 以便比较不同样
品间的差异。用发育种子样品制备分离微体蛋
白、富集DGAT酶蛋白。反应底物18C的DAG和
18:1酰基- CoA分别用[14C]放射性标记。将富集
的DGAT酶蛋白和放射性底物加入反应体系, 通
过反应生成放射性TA G的多少和速率来检测
DGAT活性。与非转基因(NT)和空载体对照(VC)
的亚麻荠种子相比, VgDGAT1转基因系种子的
DGAT活性提高了至少30多倍(图5), 各转基因系
种子的DGAT活性也有显著差异(P<0.05)。我们
进一步将各T3代转基因种子的VgDGAT1 mRNA
表达量与其DGAT活性作相关分析(图6), 发现二
者呈正相关(R2= 0.7922), 表明在转基因亚麻荠种
子中, VgDGAT1基因不仅能高效表达, 且编码的
蛋白具有正确的DGAT活性。
图4 转基因亚麻荠纯系种子中VgDGAT1 mRNA的表达
Fig.4 Expression of VgDGAT1 mRNA in the transgenic camelina seeds
用SYBR Green I试剂盒进行实时定量PCR检测VgDGAT1 mRNA, 以18S RNA为内参基因。RNA样品为随机选取的转基因纯合系。各
柱形上不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 图5、7、9同。
图5 VgDGAT1转基因亚麻荠发育种子中DGAT活性检测
Fig.5 DGAT activity in microsomal fractions prepared from pooled developing seeds (stage 4) of the transgenic camelina lines
NT: 非转基因种子; VC: 空载体对照的种子; DT: VgDGAT1转基因T3种子。图7、9同。
植物生理学报674
3 VgDGAT超表达促进亚麻荠种子油脂积累但不
损伤蛋白积累
为检测VgDGAT1基因超表达及DGAT活性显
著提高是否引起亚麻荠种子油脂和蛋白质合成积
累发生明显变化, 我们分别测试T3代转基因系成熟
种子的含油量和蛋白含量。如图7所示, VgDGAT1
转基因系种子含油量由非转基因(NT)的37%提高
到46%~51%, 比非转基因(NT)和空载体对照(VC)
的亚麻荠种子含油量增加了9%~14%。然而, 与非
转基因(NT)和空载体对照(VC)的亚麻荠种子蛋白
含量(28%)相比, VgDGAT1转基因种子的蛋白含量
(27.5%~29.6%) (图7)则没有显著变化, 尽管部分转
基因系蛋白含量有轻微上升。显然, DGAT活性的
提高加快了TAG合成, 进而拉动油脂合成途径上游
合成更多的脂肪酸, 使得油脂积累增多。但这种油
脂积累上升并没有以消耗蛋白质积累为代价。
为检测这种转基因高油表型是否能稳定遗
传, 我们对温室生长收获的T3代转基因系及其衍
生的T4代转基因种子的含油量作对比(图8), 统计
分析揭示T3代种子含油量与相应T4代种子含油量
高度正相关(R2=0.8538)。可见这种转基因高油表
型是能够稳定遗传的。进一步需在大田条件下
进行多年多点试验来评估这种高油性状表达的
稳定性。
图6 T3代转基因亚麻荠发育种子中VgDGAT1表达与DGAT活性相关性分析
Fig.6 The relation between VgDGAT1 expression and DGAT activity for T3 transgenic camelina seeds
图7 VgDGAT1转基因亚麻荠T3代种子中油脂和蛋白含量
Fig.7 Oil and protein contents of T3 VgDGAT1-transgenic camelina seeds
苑丽霞等: 种子特异表达二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1)提高亚麻荠种子油脂积累 675
4 VgDGAT超表达对亚麻荠种子重量和种子萌发
的影响
为深入分析VgDGAT1种子特异超表达是否对
亚麻荠产量等农艺性状产生负影响, 本文定量检
测T3代转基因成熟种子的百粒重和种子萌发特性
等表型。对百粒重而言(图9), 所测转基因系(102~
110 mg)都不低于非转基因和空载体对照的种子
(98~99 mg), 其中约72%转基因系种子百粒重高于
对照种子平均5.7 mg以上(P<0.05), 尽管统计分析
未达极显著水平(P<0.01)。种子萌发率(图10)和种
子活力测试发现, 转基因系种子与对照种子没有
明显差异。这些数据显示VgDGAT1种子特异超表
达未对种子萌发等性状构成负影响, 而且还导致
种子百粒重小幅度提高。进一步需在大田条件下
检验转基因表达是否对其他农艺性状产生影响。
讨　　论
亚麻荠是重新发掘的可广泛用于生产优质生
物燃油和富营养保健品以及其他高值油脂化工产
品的“低耗、高效、环保”非粮型油料作物。培育
种子油脂和蛋白含量双高及其他农艺性状优良的
种质/品种将极大增加基于亚麻荠种子的燃油业和
油脂工业的商业开发利用经济价值和社会效益。
本文首次报道应用基因工程对二酰甘油酰基转移
酶(DGAT1)进行遗传修饰, 获得了种子含油量显著
提高、而蛋白积累不减、且其他农艺性状未现负
图8 VgDGAT1转基因亚麻荠T3和T4代种子高油表型的遗传分析
Fig.8 Heritability of the high oil trait from T3 transgenic seeds (generation) to the average values for the corresponding T4 seeds
(progeny) of camelina
图9 对照和VgDGAT1转基因亚麻荠T3代种子的百粒重
Fig.9 100-seed weight of the control and T3 VgDGAT1-transgenic camelina
植物生理学报676
效应的亚麻荠转基因新种质。
如前文所述, DGAT是控制种子TAG生物合成
和油脂积累的关键限速酶之一。反义抑制油菜
(Brassica napus) DGAT基因表达, 引起转基因油菜
种子含油量显著减少, 且种子发育不正常(Lock等
2009), 显示DGAT在种子油脂合成积累中起重要
作用。Jako等(2001)发现, 种子特异表达(napin启
动子驱动)拟南芥AtDGAT1, 导致拟南芥种子含油
量由野生型的27%上升到32%~37%, 平均提高了
7.5%。转基因拟南芥种子千粒重由野生型的19.6
mg增加到20.3~25.8 mg, 平均上升约3.8 mg。Lard-
izabal等(2008)从一种真菌Umbelopsis ramanniana
分离到UrDGAT2A基因, 对其密码子作适于植物表
达优化编辑后导入大豆, 种子特异表达(大豆7S-a
启动子)优化的UrDGAT2A基因提高了种子油脂的
合成积累。UrDGAT2A高表达的纯合转基因大豆
品系经多年多点大田试验, 大豆种子含油量比非
转基因对照平均提高了1.5%, 蛋白质含量减少与
对照相比未达显著水平(P<0.05), 转基因种子产量
与非转基因对照相比也没有明显差异。将该UrD-
GAT2A基因在玉米种子胚中特异表达(由大麦胚增
强型启动子Per1驱动), 使玉米籽粒含油量比非转
基因对照(含油量为4%)提高了0.2%~0.6% (Oaks等
2011)。同样的Per1启动子驱动另一个真菌Neuros-
pora crassa的DGAT2基因(NcDGAT2)在玉米籽粒
中超表达, 导致玉米籽粒含油量上升0.5%~0.9%。
尽管这种NcDGAT2转基因玉米品系种子产量与对
照相比没有显著差异, 但其种子萌发及幼苗生长
表现出轻度生理障碍(Oaks等2011)。有趣的是, 在
玉米种子胚中特异表达(种胚特异的16 kDa油质蛋
白启动子驱动)玉米本身DGAT1-2的高油等位基因
ASKC281B1, 较大幅度促进玉米籽粒中油脂积累,
含油量比野生型提高了0.9%~1.3%, 同时引起油酸
含量上升18%和亚油酸减低13.7% (Zheng等2008)。
可见, 超表达DGAT提高种子油脂积累的幅度以及
对其他农艺性状的影响大小在不同植物上的效应
有差异, 这可能与DGAT的来源、使用的种子特异
启动子和受体植物种类不同有关。
我们实验室从一种野生菊科油料植物Vernonia
galamensis发育种子中分离到编码DGAT1的cDNA
克隆(VgDGAT1), 前期一系列试验证明VgDGAT1
是迄今检测的活性较高的一个DGAT (Yu等2006,
2008; Li等2010b, 2012)。本文应用种子特异启动
子(菜豆蛋白phaseolin启动子)驱动VgDGAT1在亚
麻荠发育种子中超表达。对转基因亚麻荠株系表
型分析显示, VgDGAT1基因纯合转基因系成熟种
子含油量由非转基因的37%提高到46%~51% (图
7), 蛋白含量(28%)与对照相比没有减低(图7), 而
且部分转基因系种子蛋白含量有所升高, 尽管未
达显著水平。此外, 72%的VgDGAT1转基因亚麻
荠种子百粒重也平均提高了5.7 mg (图9) (P< 0.05),
尽管未达极显著水平(P<0.01)。高油转基因亚麻
荠种子活力和萌发率(图10)以及株高和生育期等
其他农艺性状(数据未发表)与非转基因品系和对
图10 对照和VgDGAT1转基因亚麻荠种子的萌发
Fig.10 Germination of the control and VgDGAT1-transgenic camelina seeds
苑丽霞等: 种子特异表达二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1)提高亚麻荠种子油脂积累 677
照品系没有差异。温室条件下, T3代转基因种子含
油量与相应T 4代转基因种子含油量呈正相关
(R2=0.8538) (图8), 说明这种转基因高油表型是可
稳定遗传的。这与上述种子特异表达DGAT导致
种子高油表型遗传一致, 进一步还需在大田条件
下验证本文获得的转基因高油亚麻荠表型及其稳
定性。
统计分析表明, 不仅VgDGAT1 mRNA表达量
和转基因种子DGAT活性 (图6 )为正相关 (R 2=
0.7922), 而且DGAT活性与种子含油量也呈正相关
(R2= 0.74) (数据未发表)。与此结果相似的是 ,
Oakes等(2011)在玉米种子超表达真菌DGAT2和
Jako等(2001)在拟南芥种子超表达AtDGAT1的研究
也发现转基因表达水平、DGAT活性和种子含油
量之间存在中等水平的线性相关性。这些例证显
示发育种子具有某种可塑性使种子增加油脂积累
成为可能。种子特异超表达DGAT, 使DGAT活性
显著增强, 势必消耗更多的DGA和酰基-CoA分子
和扩充TAG库容量。这种代谢变化很可能产生某
种生理信号反过来上调油脂合成途径上游步骤,
促使更多的光合产物用于油脂合成。种子油脂的
高积累进而也促进种子重量的增加。另外, 为检
测用于油脂合成增加所需的额外碳源是否来自于
其他储藏化合物合成的减少 , 我们测试了Vg-
DGAT1超表达的亚麻荠成熟种子多糖类储藏物积
累情况, 与对照植株相比, 这类储藏物平均减少了
约4.9% (数据未发表)。与之相似的是, Lardizabal
等(2008)对UrDGAT2A基因超表达的大豆种子检测
发现寡聚糖类化合物相应降低。在DGAT超表达
的发育种子中, 这种多糖类化合物减少所节省的
碳源很可能部分地用于种子油脂合成, 从而使种
子油脂含量提高。种子油脂合成的提高可能没有
明显影响到用于蛋白质合成的碳源供给, 因而蛋
白质合成积累与在非转基因对照种子中一样, 未
受干扰。未来需设计精细试验鉴定超表达DGAT
的发育种子中来自光合作用的碳源是如何分配到
油脂和蛋白质以及其他储藏物合成途径的机制。
总之, 种子特异超表达VgDGAT1基因显著提
高了亚麻荠发育种子DGAT活性, 不仅较大幅度提
高了种子油脂合成积累, 而且打破了种子油脂含量
与蛋白含量负连锁, 未对蛋白质合成积累和种子重
量等农艺性状造成负影响。研究结果为全面解析
亚麻荠等油料作物种子油脂等储藏物合成积累调
控机制和进一步建立油料作物种子油脂遗传改良
的代谢工程策略提供了理论及技术参考。
参考文献
邓乾春, 黄凤洪, 黄庆德, 谢笔钧, 钮琰星, 万楚筠, 刘昌盛(2009). 一
种高利用价值油料作物—亚麻荠的研究进展. 中国油料作物
学报, 31 (4): 551~559
吴永美, 毛雪, 王书建, 薛金爱, 贾小云, 王计平, 杨致荣, 李润植
(2011). 植物ω-7脂肪酸的系统代谢工程. 植物学报, 46 (5):
575~585
谢光辉, 秦烁, 薛帅, 梁振兴(2012). 亚麻荠作为生物柴油原料树种
的研究现状与前景分析. 中国农业大学学报, 17 (6): 239~246
薛金爱, 毛雪, 吴永美, 杨致荣, 贾小云, 张莉, 王计平, 岳爱琴, 孙
希平, 李润植(2013). 酿酒酵母脂酰-∆9脱氢酶亚细胞定位
表达及其对烟草脂肪酸合成的影响. 生物工程学报, 29 (5):
630~645
岳爱琴, 李润植(2009). 新型可再生工业用油脂的代谢工程. 中国生
物化学与分子生物学报, 25 (6): 501~509
Burgal J, Shockey J, Lu C, Dyer J, Larson T, Graham I, Browse J
(2008). Metabolic engineering of hydroxy fatty acid production
in plants: RcDGAT2 drives dramatic increases in ricinoleate lev-
els in seed oil. Plant Biotechnol J, 6: 819~831
Dahlqvist A, Stahl U, Lenman M, Banas A, Lee M, Sandager L,
Ronne H, Stymne S (2000). Phospholipid: diacylglycerol acyl-
transferase: an enzyme that catalyzes the acyl-CoA-independent
formation of triacylglycerol in yeast and plants. Proc Natl Acad
Sci USA, 97 (12): 6487~6492
Eynck C, Falk KC (2013). Camelina (Camelina sativa). In: Singh
BP (ed). Biofuel Crops: Production, Physiology and Genetics.
London: Center for Agricuture and Bioscience International,
369~391
Gehringer A, Friedt W, Luhs W, Snowdon, RJ (2006). Genetic map-
ping of agronomic traits in false flax (Camelina sativa subsp.
sativa). Genome, 49 (12): 1555~1563
Jako C, Kumar A, Wei Y, Zou J, Barton DL, Giblin EM, Covello
PS, Taylor D (2001). Seed-specific over-expression of an Ara-
bidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase en-
hances seed oil content and seed weight. Plant Physiol, 126 (2):
861~874
Kagale S, Koh C, Nixon J, Bollina V, Clarke WE, Tuteja R, Spillane
C, Robinson SJ, Links MG, Clarke C et al (2014). The emerging
biofuel crop Camelina sativa retains a highly undifferentiated
hexaploid genomestructure. Nat Commun, 5: 3706
Lardizabal K, Effertz R, Levering C, Mai J, Pedroso MC, Jury T,
Aasen E, Gruys K, Bennett K (2008). Expression of Umbelopsis
ramanniana DGAT2A in seed increases oil in soybean. Plant
Physiol, 148 (1): 89~96
Li R, Hatanaka T, Yu K, Wu Y, Fukushinge H, Hildebrand DF (2013).
Soybean oil biosynthesis: roles of diacylglycerol acyltransferase.
Funct Integr Genomics, 13 (1): 99~117
Li R, Yu K, Hatanaka H, Hildebrand DF (2010a). DGAT1, DGAT2
植物生理学报678
and PDAT expression in seed and other tissues of epoxy and hy-
droxyl fatty acid accumulation plant. Lipids, 45 (2): 145~157
Li R, Yu K, Hatanaka T, Hildebrand DF (2010b). Vernonia DGATs in-
crease accumulation of epoxy fatty acids in oil. Plant Biotechnol
J, 8 (2): 184~195
Li R, Yu K, Wu Y, Tateno M, Hatanaka T, Hildebrand DF (2012).
Vernonia DGATs can complement the disrupted oil and protein
metabolism in epoxygenase-expressing soybean seeds. Metab
Eng, 14 (1): 29~38
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆CT method.
Methods, 25: 402~408
Lock YY, Snyder CL, Zhu W, Siloto RMP, Weselake RJ, Sha S (2009).
Antisense suppression of type 1 diacylglycerol acyltransferase
adversely affects plant development in Brassica napus. Physiol
Plant, 137: 61~71
Lu C, Kang J (2008). Generation of transgenic plants of a potential
oilseed crop Camelina sativa by Agrobacterium-mediated trans-
formation. Plant Cell Rep, 27: 273~278
Moser BR (2012). Biodiesel from alternative oilseed feedstocks:
camelina and field pennycress. Biofuels, 3: 193~209
Nguyen HT, Silva JE, Podicheti R, Macrander J, Yang W, Nazarenus
TJ, Nam J-W, Jaworski JG, Lu C, Scheffler BE et al (2013).
Camelina seed transcriptome: a tool for meal and oil improve-
ment and translational research. Plant Biotechnol J, 11 (6):
759~769
Oakes J, Brackenridge D, Colletti R, Daley M, Hawkins DJ, Xiong
H, Mai J, Screen SE, Val D, Lardizabal K et al (2011). Ex-
pression of fungal diacylglycerol acyltransferase2 genes to in-
crease kernel oil in maize. Plant Physiol, 155 (3): 1146~1157
Ohlrogge JB, Browse J (1995). Lipid biosynthesis. Plant Cell, 7:
957~970
Séguin-Swartz G, Eynck C, Gugel R, Strelkov S, Olivier C, Li J,
Klein-Gebbinck H, Borhan H, Caldwell C, Falk K (2009). Dis-
eases of Camelina sativa (false flax). Can J Plant Pathol, 31:
375~386
Shockey JM, Gidda SK, Chapital DC, Kuan JC, Dhanoa PK, Bland
JM, Rothstein SJ, Mullen RT, Dyer JM (2006). Tung tree
DGAT1 and DGAT2 have nonredundant functions in triacylglyc-
erol biosynthesis and are localized to different subdomains of the
endoplasmic reticulum. Plant Cell, 18: 2294~2313
Singh R, Bollina V, Higgins EE, Clarke WE, Eynck C, Sidebottom C,
Gugel R, Snowdon R, Parkin IA (2015). Single-nucleotide poly-
morphism identification and genotyping in Camelina sativa. Mol
Breeding, 35: 35
Vollmann J, Eynck C (2015). Camelina as a sustainable oilseed crop:
Contributions of plant breeding and genetic engineering. Biotech
J, doi: 10.1002/biot.201400200
Vollmann J, Moritz T, Kargl C, Baumgartner S, Wagentristl H (2007).
Agronomic evaluation of camelina genotypes selected for seed
quality characteristics. Ind Crop Prod, 26 (3): 270~277
Wu Y, Li R, Hildebrand DH (2012). Biosynthesis and metabolic engineer-
ing of palmitoleate production, an important contributor to human
health and sustainable industry. Prog Lipid Res, 51 (4): 340~349
Xue JA, Mao X, Yang ZR, Wu YM, Jia XY, Zhang L, Yue AQ, Wang
JP, Li RZ (2013). Expression of yeast acyl-CoA-∆9 desaturase
leads to accumulation of unusual monounsaturated fatty acids in
soybean seeds. Biotech Lett, 35 (6): 951~959
Yu K, Li R, Hatanaka T, Hildebrand DF (2008). Cloning and function-
al analysis of two type 1 diacylglycerol acyltransferases from
Vernonia galamensis. Phytochemistry, 69: 1119~1127
Yu K, McCracken Jr CT, Li R, Hildebrand DF (2006). Diacylglycerol
acyltransferase from Vernonia and Stokesia prefer substrates
with vernolic acid. Lipids, 41: 557~566
Zhang M, Fan J, Taylor DC, Ohlrogge JB (2009). DGAT1 and PDAT1
acyltransferases have overlapping functions in Arabidopsis tria-
cylglycerol biosynthesis and are essential for normal pollen and
seed development. Plant Cell, 21: 3885~3901
Zheng P, Allen WB, Roesler K, Williams ME, Zhang S, Li J, Glassman
K, Ranch J, Nubel D, Solawetz W et al (2008). A phenylala-
nine in DGAT is a key determinant of oil content and composi-
tion in maize. Nat Genet, 40 (3): 367~372