全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1447~1453 1447
收稿 2013-06-27　　修定 2013-09-27
资助 山东省科技发展项目(2009GG10009022)、山东省自然科
学基金项目(ZR2011CL005)和山东省“泰山学者”建设工程
专项经费(BS2009NY040)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: xiashuchun@163.com; Tel: 0532-
88030496)。
间接竞争ELISA测定花生植株内源水杨酸含量
鄢洪海1,*, 王学武2,*, 张茹琴1, 况川1, 迟玉成3, 夏淑春1,**
1青岛农业大学农学与植物保护学院, 山东青岛266109; 2青岛市植物保护站, 山东青岛266100; 3山东省花生研究所, 山东青
岛266101
摘要: 以SA-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA为包被抗原, 利用SA-NH-CH2-NH-BSA为免疫原产生的抗体, 来建立能定量测定花
生组织中游离水杨酸(SA)的间接竞争ELISA工作程序, 并明确该方法的工作条件以及基本参数。结果表明: 该方法对SA标
准品的最低检测量为10 ng·mL-1, 线性检测范围为10 ng·mL~10 μg·mL-1。在该范围内, 标准曲线的批内和批间变异系数分别
为1.90%和6.81%; 花生叶片和根组织中添加SA的平均回收率分别为93.9%和91.0%。
关键词: 花生; 内源水杨酸; 间接竞争ELISA
An Indirect Competitive ELISA Determination to Detect Salicylic Acid in Peanut Plant
YAN Hong-Hai1,*, WANG Xue-Wu2,*, ZHANG Ru-Qin1, KUANG Chuan1, CHI Yu-Cheng3, XIA Shu-Chun1,**
1College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China; 2Qingdao Plant Protection
Station, Qingdao, Shandong 266100, China; 3Peanut Research Institute in Shandong Province, Qingdao, Shandong 266101, China
Abstract: SA-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA was used as coating antigen, and SA-NH-CH2-NH-BSA was used as
immunogen to induce antibodies to establish a procedure that could quantitatively determine free salicylic acid
(SA) in peanut plants, and clear the working conditions and basic parameters in the procedure. The results
indicated that, using the procedure, the minimum detectable content of SA in peanut plants was 10 ng·mL-1, the
linear detectable content range from 10 ng·mL-1 to 10 μg·mL-1. Within this range, the intra- and inter-assay
coefficients of standard curve were 1.90% and 6.81%, respectively; the average recovery of added SA in peanut
leave and root tissues were 93.9% and 91.0%, respectively.
Key words: Arachis hypogaea; endogenesis salicylic acid; indirect competitive ELISA
水杨酸(salicylic acid, SA)是植物体内普遍存
在的一种小分子酚类物质, 化学名称为邻羟基苯
甲酸, SA参与了多种植物生理功能的调节与代谢,
以至于将其列为一种新的植物激素(Lee等1995;
Raskin 1992; Malamy等1990; Gaffney等1993)。尤
其是SA还与植物抗病性及转导密切相关, 更引起
了人们的广泛关注(Alvarez 2000)。目前, 关于植
物内源水杨酸变化和含量的测定已有一些报道,
其中, 以高效液相色谱法(HPLC)居多, 但HPLC分
析时间长, 溶剂消耗量大, 对样品的纯度要求高和
操作复杂, 不适合对大批量样品的检测(李兆亮等
1997; 刘成科等2006; 邓文红等2007)。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是20世纪70年代
初发展起来的检测技术。最初, ELISA主要用于病
毒、细菌的检测, 之后范围涉及到一些药物、激
素、毒素等半抗原分子的定量检测。定量检测半
抗原的ELISA在植物学研究中已得到广泛应用
(Pence等1987; Nuryono等2005), Bennett等(1987)成
功的将4-氨基水杨酸与铜蓝蛋白(KLH)偶联制备
了水杨酸的羊抗体, 并建立了可用于临床的荧光
免疫分析技术, 但其建立比较困难。虽然制备单
克隆抗体时, 可以筛选专一识别半抗原的抗体, 通
过改变半抗原与载体蛋白的链接桥等方法来提高
ELISA测定水杨酸的灵敏度等(陈金桂和周燮1996;
王树才和周燮1996)。但是单克隆亲和力相对小,
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报1448
检测抗原灵敏度相对低, 在沉淀和凝集反应方面
也存在缺陷。而基于多克隆抗体的ELISA (TAS-
ELISA)虽然因多种抗体并存, 使得非特异结合率
增高, 但由于多克隆所反应的时间较长, 捕获抗体
和酶标抗体都起到了扩大信号的作用, 使得TAS-
ELISA测定结果灵敏度也能高于单克隆ELISA方
法(刘成科等2006)。为此, 我们探索研究了一种适
合花生体内水杨酸含量测定的间接竞争ELISA方
法, 以期建立线性范围宽、灵敏度更高、安全、
无污染、仪器设备简单、操作简便、分析快速和
容易实现自动化的水杨酸检测技术。
材料与方法
1 免疫原SA-NH-CH2-NH-BSA的合成
取1 g BSA (牛血清白蛋白)溶于20 mL双蒸水
中, 按顺序依次加入3 mol·L-1的乙酸钠6.7 mL,
7.5% (W/V)甲醛12 mL, 5-ASA (5-氨基水杨酸,
Sigma公司生产, 分析纯)溶液(0.5 g 5-ASA溶于25
mL NaOH中), 调节pH至8.5, 置于4 ℃冰箱中搅拌
反应过夜, 然后将反应物装入透析袋中, 4 ℃下先
用0.1 mol·L-1 NaHCO3透析48 h, 每4 h更换一次透
析液, 后用双蒸水进行透析, –20 ℃冷冻干燥后,
于–20 ℃冰箱中保存(陈金桂和周燮1996)。
2 包被物SA-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA的合成
参照陈金桂和周燮(1996)方法: 0.55 g 5-ASA
溶于14.3 mL乙腈和1.4 mL双蒸水, 在连续搅拌条
件下逐滴加至戊二醛溶液(1.5 mL溶于2.9 mL乙腈)
中, 继续反应30 min。将上述反应混合液缓慢加到
OVA (卵清蛋白)溶液(1 g OVA溶于100 mL双蒸水)
中, 以2 mol·L-1 NaHCO3调节pH至6.0, 搅拌反应60
min。用60 min的时间缓慢加入1 g NaBH4, 继续搅
拌60 min。将反应物装入透析袋, 4 ℃下用0.1
mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.2)进行透析, 每4 h换一
次透析液, 冷冻保存, 经–40 ℃冷冻干燥后, 放
在–20 ℃冰箱中保存。
3 抗体球蛋白IgG的制备
免疫对象为二月龄的家兔, 将免疫原溶液乳
化与等量的福氏完全佐剂(北京鼎国生物技术公司
生产)混匀制成乳剂, 用于基础免疫。基础免疫2
次, 间隔2周。免疫原溶液减半加等量的福氏不完
全佐剂, 乳化后用于加强免疫。对家兔的免疫采
用背部皮内、皮下及腹股沟-腋窝多点注射, 分别
于加强免疫后的7~10 d, 采用免疫双扩散和EL1SA
两种方法做抗体检测。
4 抗血清特异性鉴定
4.1 抗血清的沉淀反应性鉴定
采用免疫双扩散法, 即以2倍连续稀释法将抗
血清稀释, 分别加入外周各孔, 每孔20 μg, 置37 ℃
保温1 h。然后将免疫原溶液20 μL (含SA-NH-
CH2-NH-BSA 20 μg)加于中央孔内, 置4 ℃保温48
h, 记录结果。
4.2 间接竞争ELISA工作条件的筛选
采用硫酸铵盐析和Sephadex G-200柱层析法,
从兔抗血清中分离纯化出IgG。参照王硕等(2011)
方法, 采用间接竞争ELISA抑制试验, 测得结合率
和抑制率、添加回收率、批内变异系数和批间变
异系数。
加标准样品孔的OD490 nm值(B)与对照孔(不加
标样) OD490 nm值(B0)之间的比值即为结合率: B/B0
(%)。抑制率(IC)＝(B0–B)/B0 (%)。
4.3 间接竞争ELISA测定
将聚苯乙烯酶标板用0 .2%的戊二醛处理
(Tijssen 1985)。经棋盘滴定选用1/2 000免疫物/孔
(100 μL)包被, 10 mg·mL-1 BSA封闭, 加入不同稀释
度的抗血清(100 μL·孔-1), 同时设置空白和阴性对
照孔, 加入OPD (底物溶液)和底物, 显色后加入2
mol·L-1 H2SO4终止反应, 于490 nm波长测光密度。
以光密度值为0.1时的抗血清稀释度为抗血清的
效价。
4.4 抗体特异性的测定
采用间接竞争方法测定抗体与SA及其类似物
质(乙酰水杨酸、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸、
5-磺基水杨酸、水杨酸钠、对氨基苯甲酸)的交叉
反应性, 测定中, 以系列稀释的竞争物溶液作为被
检抗原。抗体的特异性以交叉反应率表示, 即抑
制率与固相化抗原结合达到50%时, 水杨酸所需克
分子数与类似物所需克分子数之比。
5 花生叶片组织中SA的ELISA测定
5.1 花生叶片中SA的提取
参照Palva等(1994)的方法并稍加修改。取花
生(Arachis hypogaea L.)品种‘鲁花22’植株处于下
针期的根和叶片组织各10 g, 液氮研磨后加40 mL
鄢洪海等: 间接竞争ELISA测定花生植株内源水杨酸含量 1449
80%预冷乙醇, 振荡后4 ℃离心(10 000×g, 10 min),
沉淀用80%预冷乙醇再抽提一次。上清液在–20
℃冰箱中放置1 h, 再离心一次(10 000×g, 10 min)
后上清液经旋转真空干燥仪浓缩至体积的1/10, 加
重蒸水至10 mL, 然后加入偏磷酸至终浓度为2%,
用5 mL乙酸乙酯抽提3次, 有机相用氮气吹干并溶
于适量PBST (含4% NaCI和0.1% Tween-20的磷酸
盐缓冲液, pH 7.5)中, 即得到游离态SA粗样。水相
直接浓缩至一定体积为结合态SA粗样, 或在水相
中加入6 mol·L-1 HCl至终浓度为1 mol·L-1, 密闭后
在80 ℃恒温水浴中水解1 h, 冷却后用乙酸乙酯抽
提3次, 有机相用氮气吹干并溶于适量PBST中, 即
使得结合态SA变为游离态SA粗样(Palva等1994)。
5.2 水杨酸添加回收率
取上述花生叶片中提取的SA粗提样品 , 按
50、100、500和1 000 ng·mL-1的浓度添加水杨酸,
进行ELISA检测。每个添加浓度做4份样品, ELISA
检测时每份样品的提取液做2个平行重复孔。
各样品经上述方法处理后, 进行间接酶联免
疫吸附测定, 检测OD490 nm的吸光值, 并计算抑制率,
代入标准回归方程, 计算SA的含量。并根据以下
公式计算添加回收率: 添加回收率(%)=实测值
(ng)/添加值(ng)×100。
5.3 精确度
精密度用变异系数(CV)来表示, 变异系数按
下述公式计算 : CV=标准差 (SD)/平均值 (X)×
100%。
5.3.1 批内变异系数的测定 批内变异系数是指同
一次测定的同一批内样本重复测定次数所得结果
的变异系数。每一梯度浓度的标准品作4次重复,
以其批内变异系数表示批内误差。
5.3.2 批间变异系数的测定 批间变异系数是指某
样本在不同批中重复测定所得结果的变异系数。
本试验共选择12块板, 每块板4个重复, 随机抽取6
个样品进行批间变异系数的测定。
实验结果
1 抗体的提纯
用饱和硫酸铵盐析沉淀提取出γ-球蛋白后, 上
Sephadex G-200层析柱, 收集洗脱液, 在280 nm处
用紫外分光光度计测定的结果如图1, 洗脱出来的
第一个蛋白峰即为纯度较高的IgG, 并收集于对应
的试管中备用。
2 抗血清的效价
在免疫处理6次以后, 免疫原所产生的抗血清
的双扩散效价大于64:1, 符合要求, 可以采血。由
图2可以看出, 当抗血清稀释倍数在6 400倍时, 吸
光值为1.0, 因此, 抗血清的效价约为6 400。
图1 Sephadex G-200分离抗血清结果
Fig.1 Antiserum by Sephadex G-200 separation results
图2 抗血清效价
Fig.2 Antiserum titer
3 包被抗原与抗体工作浓度的筛选
本试验固定酶标二抗浓度1:2 000, 用方阵筛
选包被抗原与抗体的浓度, 结果如表1。包被抗原
最适工作浓度为1/2 000, 抗血清的稀释度为1:
6 400时, OD490 nm值接近1.0。故试验采用1/2 000为包
被抗原的工作浓度, 1:6 400为抗血清的工作浓度。
4 抗原包被条件及封闭液的选择
以5%牛血清白蛋白、0.1%卵清蛋白、5%和
10%脱脂奶粉(光明乳业)、5%和10%脱脂奶粉(琴
牌乳业)作为封闭剂, 其效果差异不显著(表2)。
5 竞争反应时间的确定
从表3可以看出, 竞争反应0.5 h时, IC50 (交叉
反应率为50%)最小, 但由于竞争时间短, 0孔与最
植物生理学报1450
大抑制孔的颜色都较浅, 不利于测定。竞争1 h时,
0孔OD值与最大抑制孔的OD值相差最大, 说明检
测灵敏度比竞争0.5 h的好。当竞争时间超过1 h时,
0孔OD值与最大抑制孔的OD值之差下降, 非特异
性吸附增加, IC50增大。因此, 选定最佳竞争时间
为1 h。
6 pH对水杨酸ELISA测定的影响
从图3可以看出pH的变化对水杨酸ELISA测
定结果的影响。当反应液中的pH为中性或弱酸性
时, IC50值最小, 且OD490nm值也很高, 可视为在该区
域检测的灵敏度最佳。而当pH在酸性和碱性较强
表1 包被抗原和抗血清工作浓度的筛选结果
Table 1 Screening results of concentration of coating antigen and antibody
包被抗原稀释度
抗血清浓度
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1 600 1/3 200 1/6 400 1/12 800 1/25 600 1/51 200 空白
250 2.48 2.09 2.05 2.00 1.94 1.77 1.32 0.87 0.61 0.21 0.04
500 2.25 2.05 1.88 1.87 1.75 1.65 1.26 0.82 0.59 0.11 0.04
1 000 2.31 2.18 2.18 2.16 2.03 1.90 1.44 1.06 0.69 0.11 0.04
2 000 2.14 2.20 1.77 1.66 1.54 1.42 1.01 0.73 0.45 0.08 0.05
4 000 2.40 2.15 2.09 1.76 1.72 1.31 0.90 0.68 0.45 0.07 0.05
8 000 1.91 1.71 1.61 1.32 1.24 0.97 0.63 0.45 0.28 0.10 0.05
　　表中数值为测定的OD490 nm值。
表2 抗原最佳包被条件及封闭剂的选择
Table 2 Optimal coating conditions and sealants for antigen
封闭剂
包被条件
pH 9.6, 37 ℃ 2 h pH 9.6, 4 ℃过夜 pH 9.6, 37 ℃ 2 h pH 7.2, 37 ℃ 2 h pH 7.2, 4 ℃过夜
5%牛血清白蛋白 0.396 0.462 0.513 0.795 0.856
0.1%卵清蛋白 0.420 0.435 0.697 1.024 1.236
5%脱脂奶粉(光明乳业) 0.576 0.605 0.716 1.465 1.413
10%脱脂奶粉(光明乳业) 0.425 0.436 0.884 1.432 1.320
5%脱脂奶粉(琴牌乳业) 0.390 0.354 0.747 1.393 1.269
10%脱脂奶粉(琴牌乳业) 0.350 0.321 0.765 1.261 1.302
　　表中数值为测定的OD490 nm值。
表3 不同竞争时间下SA-ELISA的检测结果
Table 3 ELISA results of SA under different competitive time
竞争时间/h
不同浓度SA (ng·mL-1)下的OD490 nm值
IC50/μg·mL
-1
0 10 50 100 200 500 1 000 2 000
0.5 0.73 0.43 0.34 0.31 0.25 0.18 0.08 0.01 0.79
1.0 1.17 0.71 0.59 0.49 0.40 0.35 0.20 0.10 0.84
1.5 1.23 0.83 0.68 0.60 0.52 0.40 0.32 0.29 1.23
2.0 1.36 0.94 0.84 0.83 0.61 0.53 0.45 0.39 1.31
图3 pH值对水杨酸ELISA分析的影响
Fig.3 Effect of pH on SA ELISA detection
鄢洪海等: 间接竞争ELISA测定花生植株内源水杨酸含量 1451
时, 检测的灵敏度降低。因此, 在进行免疫分析时,
反应体系中的pH值应为中性。
7 标准抑制曲线的建立
根据上述试验结果 , 确定水杨酸间接竞争
ELISA工作条件如下: 采用包被抗原稀释倍数为
1/2 000, 抗体稀释倍数为1/6 400, 酶标二抗为1/
2 000, 竞争抑制反应在37 ℃条件下进行1 h。从表
4及图4-A可以看出, 当SA到达10 ng·mL-1时, OD值
与零标准品的OD值之间出现明显差异, 故检测限
为10 ng·mL-1。从图4-B可以看出, 在10 ng·mL-1~10
μg·mL-1之间, 曲线呈现良好的线性关系, 并且此段
斜率较大, 因此, 最适合检测范围为10 ng·mL-1~10
μg·mL-1。根据ln[B/(B0–B)], 再对lgC进行回归分
析, 得到一条回归曲线, 回归方程为y=–0.5523x–
0.5663, R2=0.9856。
8 抗体的特异性
从表5结果看, 如果以抗体与水杨酸的交叉反
应率为100%, 则抗体对5-ASA的识别能力最高, 这
与免疫原是由5-ASA合成的有关, 同时C5位上与载
体蛋白连接也是一个影响因素, 说明抗体可以部分
识别连接桥结构。抗体与4-ASA和乙酰水杨酸的交
叉反应率为2.1和1.5, 而与5-磺基水杨酸和对氨基苯
甲酸几乎没有识别反应。说明抗体对其他化学结
构与水杨酸类似的水杨酸衍生物特异性很好。
9 水杨酸添加回收率测定
在花生叶片中添加不同浓度的SA标样后, 其
回收率如表6所示。回收率都在88%以上, 说明
图4 SA ELISA的标准曲线
Fig. 4 A standard curve for the competitive SA ELISA
C为标准品浓度; B为不同浓度标准品的OD490 nm值; B0为零标准品的OD490 nm值。
表4 水杨酸间接竞争ELISA结果
Table 4 Result of indirect competitive ELISA for SA
SA浓度/μg·mL-1 lgCSA OD490 nm值 结合率(B/B0)/%
1 000 3 0.029 2.7
100 2 0.038 4.0
10 1 0.131 12.0
1 0 0.225 23.2
0.1 –1 0.396 43.0
0.01 –2 0.650 64.5
0.001 –3 0.950 94.6
0.0001 –4 0.978 97.8
0 1.009 100
表5 多克隆抗体与水杨酸及其结构类似化合物的交叉反应率
Table 5 Cross-reactivity rates between polyclonal antibody
and SA and SA its structure-like compounds
水杨酸及其类似物 交叉反应率/%
水杨酸(salicylic acid) 100
5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid) 112
4-氨基水杨酸(4-aminosalicylic acid) 2.1
乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid) 1.5
水杨酸钠(sodium salicylate) 1.0
对氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid) 0.9
5-磺基水杨酸(5-sulfosalicylic acid) 0.7
ELISA方法测定结果是可靠的。
10 方法的检测精确度
从表7可以看出CV=SD的平均值/平均批内结
合率×均批内%=1.90%, 批间变异系数在2.67%~
14.37%之间, 平均为6.81%。由此可以看出, 本试
验方法的重复性好。
植物生理学报1452
表8 不同生长期花生体内SA含量
Table 8 Free SA levels in peanut plants at different growth stage
SA浓度/ng·mL-1
品种 苗期 盛花期 结颊期
叶片 根 叶片 根 叶片 根
‘花育23’ 80.3 15.4 85.4 17.6 99.7 20.2
‘花育19’ 80.0 12.7 92.3 20.0 98.6 19.1
‘潍花6号’ 82.4 13.1 90.4 23.9 94.3 21.2
‘鲁花15’ 84.6 13.2 93.6 19.5 96.7 20.7
‘白沙1016’ 82.5 14.0 91.7 22.4 100.2 21.8
‘花育21’ 80.9 15.6 92.5 15.1 102.6 19.3
11 不同生育期花生组织中SA含量
从表8结果看, 首先, 随着花生生育期发展, 其
体内SA含量也相应的增加, 盛花期时叶片和根中
SA含量比苗期高, 结颊期叶片和根中SA含量比苗
期和盛花期都高。说明花生一生中水杨酸的含量
并不是均一的, 生育后期相对含量较高。其次, 花
生根和叶片中SA的含量差异显著, 说明其内源SA
不是各组织均匀分布。
讨　　论
(1)水杨酸作为一种小分子化合物一般不具有
免疫原性, 但采用戊二醛法将5-氨基水杨酸以半抗
原的形式, 通过一定碳链长度的连接分子(linker,
又称为间隔臂, spacer arm)与分子量大的载体牛血
清蛋白以共价键相偶联制备成人工抗原, 连接在
载体蛋白上的小分子便成为特定的抗原决定簇,
以此人工抗原免疫兔子, 获得了针对水杨酸的特
异性兔抗体。
表6 水杨酸添加回收率
Table 6 Recovery of added SA
添加的SA浓度/ng·mL-1
测定的SA浓度/ng·mL-1 回收率/%
叶片 根 叶片 根
50 45 44 90.0 88.0
100 93 91 93.0 91.0
500 487 456 97.4 91.2
1 000 953 938 95.3 93.8
平均 93.9 91.0
表7 ELISA标准曲线批内误差
Table 7 Intra-deviation of the standard curve of ELISA
SA浓度/ng·mL-1
批内误差 批间误差
结合率% SD 结合率% SD 变异系数%
0 98.21 1.252 94.52 2.52 2.67
50 68.77 0.894 67.74 2.23 3.29
200 68.28 1.351 69.07 3.69 5.34
500 59.84 0.642 61.06 5.12 8.39
1 000 33.12 2.371 32.98 4.74 14.37
5 000 28.09 0.264 27.10 1.84 6.79
平均值 59.39 1.129 58.74 3.36 6.81

鄢洪海等: 间接竞争ELISA测定花生植株内源水杨酸含量 1453
(2)在免疫分析中, 对变异系数值有一定要求,
放射免疫测定(radioimmunoassay, RIA)要求批内变
异系数低于5%, 对于酶免疫测定(enzyme-immuno-
assay, EIA)也不能低于这个要求; 且批间变异系数
大于批内变异系数, RIA中要求批间变异系数小于
10%。王树才等初步建立了大蒜和黄瓜植株体内
水杨酸的SA-ELISA测定方法, 对大蒜植株内的SA
检测范围为0.064~200 nmol, 批内误差为2.62%, 批
间误差为1.25%, 对黄瓜体内SA的检测范围为
0.02~20 nmol (Wang等1997; 王树才等2001)。而以
往多采用的高效液相色谱(HPLC)方法测定, 由于
前处理比较烦琐, 有时回收率不高, 往往导致结果
误差很大(李兆亮等1997; 李宝聚等2005; 邓文红等
2007)。本研究选择pH 7或偏酸性反应液, 1 h竞争
反应时间, 1/2 000包被物的工作浓度, 1:6 400抗血
清的工作浓度建立的花生水杨酸间接竞争性
ELISA模式, 检测范围在10 ng·mL-1~10 μg·mL-1
(0.072~72 nmol), 批内变异系数平均为1.90%, 批间
变异系数平均为6.81%。测定的花生叶片和根组
织中的添加SA的平均回收率分别为93 .9%和
91.0%, 达到了高特异性反应, 且样品的稀释曲线
与标准曲线平行, 表明间接竞争ELISA测定水杨酸
含量具有良好的重复性。
(3)采用间接ELISA测定半抗原具有许多优点,
使反应的灵敏度和重复性得到提高。因为大多数
游离半抗原与抗体的亲和性不如包被抗原载体上
的抗原决定簇, 即包被抗原中的半抗原竞争力强,
因此加入样品和抗体的顺序对结果有一定的影响
(郑海金等1995; Smith和Davis 1986)。考虑到这一
点, 可以将抗体预先同样品中的待测抗原反应一
段时间后, 再与包被抗原在酶标板上竞争血清中
的抗体, 这样可使竞争抑制反应更加充分, 结果会
更加准确。
(4)本研究结果表明: 花生一生中水杨酸的含
量并不是均一的, 生育后期相对含量较高, 而且各
组织内SA也不是均匀分布, 叶片中水杨酸含量明
显比根多。另外, 不同花生品种之间内源水杨酸
含量略有差异, 但不显著。这和采用HPLC方法测
定的花生等植物内源SA含量变化规律基本一致
(Palva等1994; 王树才等2001; Kessmann等1994)。
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