全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (4): 445–453　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0011 445
收稿 2016-01-13　　修定 2016-03-30
资助 烟草行业重点实验室专项(110201403019和110201403018)
和中国烟草总公司科技重点项目(110201302004)。
* 通讯作者(E-mail: xiaolian_zhang@sina.cn)。
烟草赖氨酸脱羧酶基因NtLDC1的克隆和表达分析
张吉顺1, 张孝廉1,*, 林世锋1, 付强1, 余婧1, 邹颉1, 李勇2
1贵州省烟草科学研究院, 烟草行业分子遗传重点实验室, 贵阳550081; 2遵义师范学院生命科学学院, 贵州遵义563002
摘要: 赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase, LDC)是生物碱合成第一步所需的关键酶。为研究LDC基因在烟草中特性和功能,
本研究采用同源克隆和RT-PCR方法从栽培烟草‘K326’中克隆得到一个LDC基因, 命名为NtLDC1, GenBank登录号为
KU507075。序列分析表明烟草NtLDC1基因ORF全长666 bp, 编码221个氨基酸的蛋白, 相对分子质量为24 264.9 Da, 等电
点为5.43。不同植物中LDC蛋白较为保守, NtLDC1与番茄和马铃薯的LDC蛋白高度相似, 进化分析表明NtLDC1与番茄中
LDC的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR对NtLDC1基因进行组织表达分析, 结果显示NtLDC1基因在烟草根、茎、
叶、花中均有表达, 在叶片中的表达水平最高。低温可以诱导NtLDC1基因的表达, 在低温处理8 h基因的表达量达到最高,
表明NtLDC1可能在烟草低温胁迫应答中发挥作用。
关键词: 烟草; 赖氨酸脱羧酶(LDC); 基因克隆; 表达分析
赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase, LDC)是
生物碱合成第一步所需的关键酶, 赖氨酸在LDC
的催化下生成戊二胺(尸胺) (Hartmann等1980)。
有研究发现LDC和尸胺的含量与植物的抗逆性有
关(苗永美等2013; Kuznetsov等2007)。烟草是一种
重要的经济作物, 生物碱的含量和类型是影响烟
叶品质和安全的重要因素, 此外, 温度对烟草生长
发育有很大影响, 苗期遭遇低温会引起早花(杨静
等2013), 从而严重影响烟叶产量, 因此培育苗期耐
低温的品种对提高烟叶产量会有很大帮助。
目前已有学者研究了苦豆子、蛇足石杉、羽
扇豆和黄瓜等植物的赖氨酸脱羧酶活性和功能,
克隆了部分LDC基因。杨毅等(2015)用PEG6000
处理刚萌动的苦豆子 , 发现干旱条件下苦参碱
(matrine, MA)和氧化苦参碱(oxymatrine, OMA)的
含量与LDC表达量有一定关系。杜次等(2014)通
过RT-PCR方法克隆从蛇足石杉中得到2个赖氨酸
脱羧酶基因LDC1和LDC2, 并进行了原核表达和功
能分析, 发现重组融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2
均能催化赖氨酸脱羧生成尸胺。Bunsupa等(2012)
将羽扇豆的LaLDC基因转入模式植物拟南芥和烟
草后发现转基因植株的尸胺含量发生变化。经过
NaCl处理的冰叶日中花LDC活性提高, 且尸胺含
量增加(Kuznetsov等2007)。在黄瓜中的研究发现
黄瓜发芽期的耐冷性与LDC基因表达有关, 低温和
盐胁迫可诱导LDC的表达, 并克隆得到了黄瓜LDC
基因, 进行了遗传转化(逯明辉等2005; 苗永美等
2013; 简兴等2015)。
鉴于LDC基因可能在栽培烟草的生物碱合成
及耐低温作用中发挥重要作用, 本研究采用RT-
PCR方法克隆了栽培烟草LDC基因的全长序列, 并
对该基因进行生物信息学分析, 应用荧光定量PCR
技术分析了NtLDC1基因在烟草不同组织和低温诱
导下的表达情况, 为进一步阐明NtLDC1基因在栽
培烟草生物碱合成及耐低温中的作用奠定基础。
材料与方法
1 材料
试验所用材料为栽培烟草(Nicotiana tabacum
L.) ‘K326’, 采用漂浮育苗法育苗, 温室培养至5~6
片真叶时将幼苗移栽至含有基质的花盆中培养。
分别取生根期幼苗的根、茎和开花期的叶片和花,
液氮迅速冷冻, 于–80°C保存备用。对于低温处理
实验的幼苗, 待7~8片真叶时, 将烟苗转移至低温
光照培养箱中, 设置光周期12 h/12 h, 温度4°C, 湿
度60%, 分别在处理的0、2、4、8、12和24 h取叶
片, 设置3次重复。
2 DNA、RNA的提取和cDNA第一链的合成
所有烟草组织在液氮中磨成粉末, DNA和总
RNA的提取分别参照天根植物DNA提取试剂盒和
总RNA提取试剂盒的说明书进行, 参照TaKaRa公
司反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA第
一条链。
植物生理学报446
3 NtLDC1基因的克隆及测序
以黄瓜LDC基因全长CDS序列(登录号: KC-
202438)为信息探针, 利用NCBI烟草EST数据库比
对, 利用Primer Primer 5.0设计引物LDC-F1和
LDC-R1 (表1), 分别以烟草‘K326’的cDNA和基因
组DNA为模板, 使用全式金公司的HiFi高保真酶
进行烟草LDC基因的CDS和全长基因组序列的
PCR扩增。利用胶回收试剂盒对PCR产物进行胶
回收后, 连入pGEM-T载体, 转化大肠杆菌DH5α,
挑取阳性克隆送去Invitrogen公司测序。
表1 引物序列及预期片段大小
Table 1 Sequences of primers and preproduction length
引物名称 引物序列(5′→3′) 扩增片段长度/bp
LDC-F1 ATGGAGAGGGAGATGATCAGTGA 666
LDC-R1 TCACCGCGCCATTTCTTGT
LDC-RT-F1 CGGTAGGATTGCTGAATGTGG 229
LDC-RT-R1 ATTTCTTGTGCTTGCGGATAG
LDC-RT-F2 GGTGAAACAGTAGGAGAAGTGAAG 183
LDC-RT-R2 CACATTCAGCAATCCTACCG
Ref-RT-F CAAGGAAATCACCGCTTTGG 108
Ref-RT-R AAGGGATGCGAGGATGGA
4 NtLDC1蛋白的生物信息学分析
在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上
BLASTp进行蛋白预测, 利用Specialized BLAST
(CDD search)进行保守域分析。选择其他物种中
相似性较高的LDC序列19条用MEGA5.0构建系统
进化树, 采用邻接法(Neighor Joining Method)作图,
重复次数为1 000。在蛋白生物信息学网站(http://
www.expasy.org/proteomics)对NtLDC1蛋白的理化
性质、亲水性/疏水性、跨膜结构及二级结构进行
预测和分析。
5 NtLDC1基因的表达分析
根据NtLDC1的cDNA序列设计荧光定量特
异引物 2对 (表 1 ) , 同时选用烟草A c t i n基因
(NTU60495)为内参基因, 并设计定量PCR引物Ref-
RT-F和Ref-RT-R (表1)。采用SYBR Green法在ABI
Stepone Plus实时荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR
实验, 设置3次生物学重复和3次实验重复, PCR反
应体系和反应程序参照TaKaRa定量PCR试剂盒说
明书。对溶解曲线、扩增效率和相关系数进行分
析, 选取特异性好、扩增效率接近1的引物进行实
验, 分析NtLDC1基因在烟草不同组织中及不同低
温处理时间的表达情况。将茎中和低温处理0 h的
叶片的相对表达量分别设置为1, 其余组织中相对
表达量按照2-∆∆CT法进行计算。
实验结果
1 NtLDC1基因的克隆
以栽培烟草‘K326’的cDNA为模板进行PCR
扩增, 获得与预期片段大小(666 bp)一致的条带(图
1)。同时, 以‘K326’的基因组DNA为模版进行PCR
扩增获得4 542 bp大小的片段(图1)。
为分析NtLDC1基因的结构, 将其cDNA序列
与克隆获得的基因组序列进行比较 , 结果显示
NtLDC1基因包含7个外显子和6个内含子(图2)。
将该基因和蛋白的序列提交到NCBI数据库中 ,
图1 烟草NtLDC1基因的PCR扩增结果
Fig.1 The PCR amplification results of NtLDC1 gene from
N. tabacum
M1: 100 bp Ladder Marker, M2: DL5000 Marker; 1~3泳道为
cDNA模板的PCR产物, 4、5泳道为基因组DNA模板的PCR产物。
张吉顺等: 烟草赖氨酸脱羧酶基因NtLDC1的克隆和表达分析 447
GenBank登录号为KU507075。NtLDC1基因的
CDS序列及其编码的氨基酸序列如图3所示。
2 生物信息学分析
用Protparam工具预测NtLDC1编码蛋白的基
本理化性质, 发现该蛋白含有221个氨基酸, 分子
式为C1073H1719N291O324S12, 相对分子质量为24 264.9
Da, 等电点(pI)为5.43, 其水溶液在280 nm处的消光
系数约为21 555, 该蛋白的不稳定系数为34.99, 为
稳定蛋白。脂肪系数是95.25, 平均亲水系数为
–0.082, 具有亲水性。进一步在ExPasy网站上利用
ProtScale软件对NtLDC1蛋白亲水性/疏水性进行
分析, 结果(图4)显示该蛋白多肽链的第30位分值
最低, 为–2.4, 第59位分值最高, 为1.8。总体上看
其亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸, 可初步推测
NtLDC1蛋白为亲水蛋白。
利用SOPMA软件对NtLDC1蛋白的二级结构
进行预测 , 结果如图5所示 , 该蛋白的α螺旋占
50.68%, 延伸链占14.03%, β转角占7.69%, 无规则
卷曲占27.06%。
利用在线分析软件SignalP 4.0 (http://www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对NtLDC1蛋白的信号
肽进行预测, C-值、S-值和Y-值都很小(图6), 说明
该蛋白不存在信号肽, 表明NtLDC1蛋白不属于膜
蛋白或者分泌蛋白。利用SubLoc v1.0在线软件
(http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)对
NtLDC1蛋白进行亚细胞定位, 结果显示该蛋白可
能定位于细胞质中。
在ExPASY网站使用NetPhoS2.0server对
NtLDC1蛋白序列的磷酸化位点进行预测, 结果表
明靶标蛋白在第30、31、112、158、205位氨基酸
残基有5个丝氨酸(sernine)磷酸化位点, 在第88、
91、124和182位氨基酸残基有4个苏氨酸(thre-
onine)磷酸化位点, 在第32和152位氨基酸残基有2
个酪氨酸(tyrosine)磷酸化位点(图7)。磷酸化位点
的存在说明可能是植物受到胁迫时, 某些蛋白激
酶或因子激活该蛋白, 从而在植物抵抗外界胁迫
中发挥作用。
3 序列比对和系统进化分析
在NCBI数据库中使用Protein Blast程序对
NtLDC1蛋白进行保守区域检索, 发现该蛋白包含
一个lysine decarbox结构域, 属于DNA processg A亚
家族, 这一家族的成员具有一个高度保守的基序
PGGXGTXXE (图8), 该基序很可能具有重要功
能。经过蛋白同源检索, 发现来自不同植物物种的
LDC蛋白有很高的相似性, 与烟草LDC1蛋白序列
覆盖度为80%~100%, 序列一致性为78%~98%。其
中, 烟草LDC1蛋白与茄科植物番茄、马铃薯具有
98%~100%的序列覆盖度和92%~95%的序列一致
性, 与锦葵科植物棉花序列一致性最高, 为98%, 但
序列覆盖度较低, 为90%, 综上可以看出烟草LDC1
与番茄和马铃薯LDC蛋白相似度最高。选择部分
功能注释明确的、有文献报道的以及模式植物拟
南芥和水稻的LDC蛋白序列, 利用Clustral X进行序
列比对, 用MEGA5.0进行系统进化树的绘制(图9),
图2 NtLDC1的基因结构示意图
Fig.2 The gene structure schematic diagram of NtLDC1
上图为基因全长, 方框表示外显子, 折线表示内含子, 下图为ORF全长。
植物生理学报448
结果可以看出, 除了烟草中已经报道的另一个LDC
家族蛋白AII20186.1外(Goossens等2003), 烟草和马
铃薯、番茄LDC序列处于同一分枝上, 这和烟草、
马铃薯、番茄同属茄科植物的亲缘关系一致。
4 NtLDC1基因的表达特性分析
通过实时荧光定量PCR检测NtLDC1基因在各
组织中的表达量, 发现该基因在烟草‘K326’的各组
织中均有表达(图10), 但在叶片中的表达量最高,
茎中的表达量最低, 整体表现为叶片>花>根>茎。
在4°C低温处理条件下, NtLDC1基因的表达
量表现出显著变化, 由图11可以看出, 随着低温处
理时间的延长, NtLDC1基因的表达量呈现先升高
后降低的趋势, 在8 h时达到顶峰, 为未处理叶片中
的9.2倍。
图3 NtLDC1的CDS序列及其编码的氨基酸序列
Fig.3 The CDS sequence of NtLDC1 and its predicted amino acid sequence
张吉顺等: 烟草赖氨酸脱羧酶基因NtLDC1的克隆和表达分析 449
讨　　论
赖氨酸脱羧酶可以催化赖氨酸脱羧反应形成
尸胺(Kim等1998, 2015), 尸胺不仅可以作为氧化胁
迫下H2O2的来源(Federico和Angelini 1986), 而且是
大豆种子萌发过程中根正常发育的必要条件
(Gross等1977; Gamarnik和Frydman 1991)。此外,
尸胺的含量还与植物的抗逆性有关, 对低温胁迫
下生长的黄瓜幼苗施用外源尸胺, 其叶片可溶性
物质含量增加, 抗氧化酶活性水平提高, 膜脂过氧
化水平降低, 从而增加黄瓜幼苗的抗冷性(曹玉杰
等2015)。苗永美等(2013)从低温处理的黄瓜幼苗
分离到一个赖氨酸脱羧酶基因(CsLDC), 本研究以
黄瓜的LDC基因序列为参考, 通过同源克隆获得栽
培烟草LDC基因, 该基因全长4 542 bp, CDS区666
bp, 包含7个外显子, 编码221个氨基酸。对其编码
的蛋白进行生物信息学分析, 结果表明NtLDC1蛋
白相对分子质量为24 264.9, 等电点(pI)为5.43, 初
步推测其为稳定的亲水性蛋白。对NtLDC1蛋白
的二级结构进行预测 , 发现该蛋白的α螺旋占
50.68%, 延伸链占14.03%, β转角占7.69%, 无规则
卷曲占27.06%。该蛋白不存在信号肽, 可能位于
细胞质中。经过蛋白同源检索, 不同植物物种的
LDC蛋白有很高的相似性, NtLDC1与茄科植物番
茄、马铃薯相似性最高且亲缘关系最近。黄瓜中
的实时荧光定量PCR证明低温会上调CsLDC基因
的表达, 说明该基因可能与黄瓜幼苗期的耐低温
性存在一定关系(苗永美等2013)。而本研究中低
温处理也可以诱导烟草植株NtLDC1基因的表达,
在处理8 h时基因相对表达量达到顶峰, 后又表现
出下降趋势。然而, NtLDC1基因在烟草耐逆中的
作用机制仍有待于进一步深入研究。
研究发现LDC除了与耐逆相关, 还参与了生
物碱的合成过程(Goossens等2003), 生物碱是烟草
中的重要物质, 其种类和含量是影响烟叶品质和
安全的重要因素。早在1986年就有人研究过尸胺
和赖氨酸脱羧酶活性在粉蓝烟草中的分布, 发现
在根、茎、叶中均能检测到LDC活性和尸胺的分
布, 但在根中LDC活性高于茎和叶片, 尸胺在根中
图4 NtLDC1蛋白的亲水性/疏水性预测
Fig.4 Analysis of hydrophily/hydrophpbicity of NtLDC1
图5 NtLDC1蛋白二级结构预测
Fig.5 Prediction for secondary structure of NtLDC1 protein
蓝色代表α螺旋, 红色代表延伸链, 绿色代表β转角, 紫色代表无规则卷曲。
植物生理学报450
合成后迅速运输到叶片中(Bagni等1986)。而本研
究发现NtLDC1基因在烟草‘K326’的各组织中均
有表达, 整体表现为叶片>花>根>茎。也有研究将
细菌LDC基因导入到烟草根系培养物中, LDC活
性升高, 尸胺合成增多, 导致新烟碱含量的大幅提
高和羟基肉桂尸胺的形成(Berlin等1998)。在返青
图6 NtLDC1蛋白的信号肽预测
Fig.6 Prediction for the signal peptide of NtLDC1 protein
图7 NtLDC1蛋白磷酸化位点预测
Fig.7 Prediction of phosphorylation sites in NtLDC1 protein
sequence
图8 不同植物LDC蛋白序列同源性比较
Fig.8 Alignment of LDC proteins from different plants
张吉顺等: 烟草赖氨酸脱羧酶基因NtLDC1的克隆和表达分析 451
图10 NtLDC1在烟草不同组织中的相对表达量
Fig.10 The relative expression level of NtLDC1 in different
tissues of tobacco
期的羽扇豆(Lupinus polyphyllus)叶片中LDC活性
与叶绿素含量正相关, 在白羽扇豆(L. albus)和黄
羽扇豆(L. luteus)叶片中生物碱的含量与LDC活性
呈现正相关 ( S c h o o f s等1 9 8 3 )。有关烟草中
NtLDC1基因在生物碱合成中的作用还有待于进
一步研究。
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图9 不同植物物种中LDC构建进化树
Fig.9 The phylogenetic tree of LDC from different plant species
标尺为遗传距离, 单位cM。
图11 低温处理对NtLDC1基因表达水平的影响
Fig.11 The effect of low temperature treatment on NtLDC1
gene expression level
植物生理学报452
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Cloning and expression analysis of lysine decarboxylase gene NtLDC1 from Ni-
cotiana tabacum
ZHANG Ji-Shun1, ZHANG Xiao-Lian1,*, LIN Shi-Feng1, FU Qiang1, YU Jing1, ZOU Jie1, LI Yong2
1Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China; 2College
of Life Science, Zunyi Normal College, Zunyi, Guizhou 563002, China
Abstract: Lysine decarboxylase (LDC) is the key enzyme in the first step of alkaloid synthesis. In order to
study the characteristics and fuction of LDC in tobacco, we cloned a LDC gene from Nicotiana tabacum ‘K326’
by RT-PCR technology, naming NtLDC1, GenBank accession number is KU507075. NtLDC1 gene has a 666-
bp open reading frame (ORF), encoding 221 amino acids. The putative protein molecular weight was 24 264.9
Da and its theoretical isoelectric point was 5.43. Sequence alignment displayed that LDC protein from different
plants were conserved and that NtLDC protein showed high similarity to tomato and potato LDC proteins. Evo-
lution analysis result suggested that NtLDC1 has the nearest genetic relationship with tomato LDC. Real-time
PCR result showed that the relative expression level of NtLDC1 gene in leaf is the highest. Low temperature
can induce NtLDC1 gene expression, the expression level peak at 8 h after low temperature treatment, suggest-
ing NtLDC1 gene may play a role in the tobacco response to low temperature.
Key words: tobacco; lysine decarboxylase; gene clone; expression analysis
Received 2016-01-13 Accepted 2016-03-30
This work was supported by Special Projects of Tobacco Key Laboratory (Grant Nos. 110201403019 and 110201403018) and Key Technology
Program of China National Tobacco Corporation (Grant No. 110201302004).
*Corresponding author (E-mail: xiaolian_zhang@sina.cn).