全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 9期，2009年 9月 843
收稿 2009-04-30 修定 　2009-08-19
资助 河南省自然科学基金(2007210015)和国家烟草栽培重点
实验室科技支撑项目(TCKL06 00 6)。
* 通讯作者(E-mail: liuweiqun2004@126.com; Tel: 0371-
6 3 5 5 8 7 2 2 )。
酪氨酸蛋白磷酸酶参与脱氢抗坏血酸的信号途径
范邓鹏 1, 石永春 1,2, 刘卫群 1,2,*
河南农业大学 1国家烟草栽培生理生化重点实验室, 2生命科学学院, 郑州 450002
提要: 研究酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPase)的抑制剂氧化苯胂(PAO)、NaVO3和Zn2+在脱氢抗坏血酸(DHA)调控烟草气孔运动
中的作用。结果表明, 0.01 mmol·L-1 PAO、1 mmol·L-1 NaVO3和2 mmol·L-1 Zn2+抑制黑暗和DHA诱导的气孔关闭, 而对光诱
导的烟草气孔开度的影响不大。据此推测 PTPase参与DHA诱导的气孔关闭信号途径。
关键词: 烟草; 酪氨酸蛋白磷酸酶; 脱氢抗坏血酸; 气孔运动; 信号转导
Involvement of Protein Tyrosine Phosphatase in Signal Pathway of
Dehydroascorbate
FAN Deng-Peng1, SHI Yong-Chun1,2, LIU Wei-Qun1,2,*
1National Key Laboratory of Tobacco Planting and Physiology and Biochemistry, 2College of Life Science, Henan Agricultural
Universtiy, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The effects of protein tyrosine phosphatase (PTPase) inhibitor, phenylarsine oxide (PAO), NaVO3
and Zn2+ on the stomatal movement regulated by dehydroascorbate (DHA) were investaged in Nicotiana tabacum.
The results indicated that 0.01 mmol·L-1 PAO, 1 mmol·L-1 NaVO3 and 2 mmol·L-1 Zn2+ had no effects on
stomatal aperture induced by light, but inhibited the stomatal closure induced by darkness and DHA, suggesting
that PTPase might be involved in the signal pathway of stomatal closure induced by DHA.
Key words: Nicotiana tabacum; protein tyrosine phosphatase; dehydroascorbate; stomatal movement; signal
transduction
气孔运动是植物适应周围环境的一种方式, 而
植物对气孔运动的调控机制则是植物适应逆境机制
中的组成部分。已有的报道认为, 黑暗、ABA、
H2O2、NO、水杨酸(SA)等信号分子都能导致气
孔的关闭(Gray 2005; Hetherington 2001; Desikan等
2003; Liu等 2003)。近年来的研究表明, 脱氢抗坏
血酸(dehydroascorbate, DHA)也能够诱导植物气孔
关闭(Fotopoulos 等 2008)。DHA 是抗坏血酸
(ascorbic acid, AsA)的氧化态, 与AsA共同调控细
胞的氧化还原状态(Pastori和 Foyer 2002), 影响细
胞的分裂和分化(Pinto和Gara 2004)、开花时间和
衰老(Barth等 2006; Chen和Gallie 2006)。在烟草
中过表达脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate
reductase, DHAR)减少DHA含量, 增大气孔开度; 而
DHAR反义表达则增加DHA含量, 减小气孔开度
(Chen和Gallie 2004)。Fotopoulos等(2008)认为烟
草中的抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase, AO)过
表达会导致转基因植株中DHA和H2O2含量的升高,
气孔导度降低; 表皮条用 1 mmol·L-1 DHA或 100
μmol·L-1 H2O2处理后, 野生型烟草的气孔即快速关
闭, 而转基因烟草的气孔开度变化较小, 证明DHA
是诱导气孔关闭的; 因此认为植物中存在DHA信号
途径, 并推测DHA诱导的气孔关闭是通过H2O2信
号途径的。
此外, 酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine
phosphatase, PTPase)和酪氨酸蛋白激酶(protein ty-
rosine kinases)分别催化蛋白质的去磷酸化和磷酸
化, 在调节动物的细胞生长和分化的过程中起作用
( X u 等 1 9 9 8 )。但到目前为止, 植物中仅发现
PTPase的存在, 而对其所参与的信号途径还没有充
分了解(杨国辉等 2007)。有报道认为, PTPase在
研究报告 Original Papers
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植物中参与渗透胁迫和黑暗(MacRobbie 2002)、
ABA和H2O2 (石武良和张蜀秋 2004)、水杨酸(杨
国辉等 2007)诱导气孔关闭的信号途径, 但 PTPase
是否与 DHA诱导的气孔关闭有关, 还未见报道。
本文以烟草叶片下表皮为材料, 采用PTPase的抑制
剂氧化苯胂(phenylarsine oxide, PAO)、NaVO3和
ZnCl2探讨PTPase是否与DHA诱导的气孔关闭有
关。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L. cv. K326)种子放在
湿润的滤纸上催芽后播于烟草专用基质(由国家烟
草栽培生理生化重点实验室提供)上。光 /暗周期
为 16 h/8 h, 光照强度为 350 μmol·m-2·s-1, 昼夜温度
均为 28 ℃, 相对湿度 55%左右。生长至十叶期
时, 选取完全展开叶进行处理。生长期间无胁迫。
PAO购自Sigma公司, NaVO3购自Solarbio公司, 其
他试剂购自科密欧化学试剂有限公司。所有药品
和试剂均为分析纯。DHA按照Horemens等(2003)
文中的方法用AsA配制母液, 而后直接加入放有植
物材料的基本缓冲液(30 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1
Mes, pH 6.0)中制得DHA处理液。
取十叶期烟苗的第 7片完全展开叶(自下而
上), 用蒸馏水洗净, 去除主脉和叶缘部分, 将叶片
切为 5 mm×5 mm大小, 放入上述基本缓冲液和
0.01、0.1、1 mmol·L-1的DHA处理液中分别处理
4 h。或撕取叶片下表皮, 用毛笔轻轻刷去叶肉细
胞, 而后切为 5 mm×5 mm大小的表皮条, 置于上述
基本缓冲液中, 在促进气孔张开的条件(25 ℃、光
照强度同前)下培养 3 h, 促使气孔完全张开。然
后取出表皮条, 放入不同处理液(基本缓冲液中分别
加入不同试剂配成母液, 而后用基本缓冲液稀释至
0.01、0.1、1 mmol·L-1 DHA, 0 .001、0.01、
0.1、1 mmol·L-1 PAO, 0.1、1、2 mmol·L-1 NaVO3,
0.02、0.2、2、4 mmol·L-1 ZnCl2)中处理 4 h。
处理期间光照、温度及湿度与植株的培养条件相
同。
处理后表皮条于Olympus BX51显微镜下用测
微尺测定气孔开度。每个处理至少用 3个表皮条,
每个表皮条随机测 20个气孔, 每个处理重复 5次
(不少于 300个气孔), 统计平均值和标准误差。
分析H2O2含量时, 将不同浓度DHA处理后
的烟草叶片分别加丙酮后研磨为匀浆, 而后以
10 000×g于4 ℃下离心10 min, 取上清液按照Ichise
(1999)文中的方法测定H2O2。
结果与讨论
1 DHA对气孔开度和叶片中H2O2含量的影响
从图1可见, 光照条件下用DHA处理表皮条或
叶片, 气孔开度随着DHA浓度的升高而降低, H2O2
含量随着DHA浓度的升高而增加。说明DHA能
够导致气孔关闭, 且这种关闭与H2O2含量呈正相
关。
2 PAO、NaVO3 和 ZnCl2 对黑暗诱导气孔关闭的
影响
黑暗可诱导气孔关闭, PTPase的抑制剂PAO、
NaVO3和ZnCl2可以抑制这一现象(杨国辉等2007)。
为了选择适用于烟草气孔的PAO、NaVO3和ZnCl2
浓度, 我们又检测了黑暗条件下不同浓度的 PAO、
NaVO3和 ZnCl2对烟草气孔开度的影响。结果(图
2)表明, 三者都能抑制黑暗诱导的气孔关闭, 但并
不影响光照条件下的气孔开度。
3 PAO、NaVO3 和 ZnCl2 对 DHA 诱导气孔关闭
的影响
为明确 PTPase是否参与DHA诱导的气孔关
闭, 分别在DHA处理液中添加0.01 mmol·L-1 PAO、
1 mmol·L-1 NaVO3和 2 mmol·L-1 ZnCl2, 处理后检测
结果(图 3)表明, 添加 PAO、NaVO3或 ZnCl2均能
部分抑制DHA诱导的气孔关闭, 说明 PTPase参与
DHA诱导的气孔关闭。但三者的抑制效应略有不
图 1 DHA对烟草叶片的气孔开度和H2O2含量的影响
Fig.1 Effects of DHA on the stomatal aperture and H2O2
content of tobacco leaves
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图 2 PAO、NaVO3和 ZnCl2对烟草叶片气孔开度的影响
Fig.2 Effects of PAO, NaVO3 and ZnCl2 on the stomatal aperture of tobacco leaves
图 3 PAO、NaVO3和 ZnCl2对DHA诱导下气孔开度的影响
Fig.3 Effects of PAO, NaVO3 and ZnCl2 on the stomatal aperture of tobacco leaves induced by DHA
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同, DHA浓度较低时, NaVO3比PAO或ZnCl2具有
较强的逆转效应; 而当DHA浓度较高时, PAO的逆
转效应较强。
参考文献
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