全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (1): 81~84 81
收稿 2011-10-30　　修定 2011-11-23
资助 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08002-
011B)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: yongchunli71@yahoo.com.cn; Tel: 0371-
63558215)。
转TPSP融合基因小麦的耐旱相关特性
李金花1,*, 孙敏善1,*, 张春艳1, 张宁1, 孟凡荣2, 任江萍1, 牛洪斌1, 王翔1, 尹钧1, 李永春1,**
河南农业大学, 1国家小麦工程技术研究中心, 2生命科学学院, 郑州450002
摘要: 在获得转TPSP基因小麦纯合株系的基础上, 对3个转基因株系的耐旱相关生理特性进行了分析。脯氨酸含量测定显
示, 干旱胁迫过程中小麦叶片中脯氨酸含量逐渐增加, 且3个转基因株系叶片中脯氨酸的积累速度和积累量均显著高于非
转基因对照; 叶绿素荧光参数测定显示, 3个转基因株系的Fv/Fm值在胁迫过程中均略高于非转基因对照, 转基因株系4-4-4
的Fv/Fo值显著高于非转基因对照, 表明转基因株系在水分胁迫条件下光合系统II (PSII)的光合效率有所增强; 转基因小麦
耐旱性鉴定显示: 模拟干旱胁迫100 h时对照小麦叶片几乎全部萎蔫, 而3个转基因株系均表现出较强的耐旱性; 复水24 h后转
基因株系4-9-1、4-4-4和30-1-2的叶片黄化率分别为25.2%、23.3%和27.6%, 显著低于非转基因对照(48.8%)。上述研究结
果表明转TPSP基因小麦具有较强的耐旱能力, 为转基因材料进一步应用于小麦抗旱育种提供了依据。
关键词: 小麦; TPSP融合基因; 耐旱性
The Drought Tolerance Related Characteristics of Transgenic Wheat with the
TPSP Fusion Gene
LI Jin-Hua1,*, SUN Min-Shan1,*, ZHANG Chun-Yan1, ZHANG Ning1, MENG Fan-Rong2, REN Jiang-Ping1, NIU Hong-Bin1,
WANG Xiang1, YIN Jun1, LI Yong-Chun1,**
1National Engineering Research Center for Wheat, 2College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,
China
Abstract: Based on the transgenic homozygous lines of wheat with the TPSP fusion gene, the drought toler-
ance related characteristics of 3 transgenic lines were analyzed. Comparative analysis on proline content in
wheat leaves showed a gradually increasing pattern during the drought stress, and the accumulating speed and
volume of praline in 3 transgenic lines were significantly higher than that in no-transgenic control. The detec-
tion of chlorophyll fluorescence parameters showed that the Fv/Fm values of 3 transgenic lines were slightly
higher than that of no-transgenic control under the drought stress, while the Fv/Fo values of transgenic line 4-4-4
were significantly higher than that of control, which indicated that the photosynthetic efficiency of photosystem
II in transgenic lines were enhanced under drought stress. The drought tolerance assay using an artificial water-
stress system indicated that almost all of no-transgenic leaves were severely withered at the time point of 100 h
after stress treatment, while the transgenic lines presented stronger drought tolerance. The percentage of yellow
leaves were calculated at the time point of 24 h after rewatering and the results showed that the yellow leaf ra-
tios of transgenic line 4-9-1, 4-4-4 and 30-1-2 were 25.2%, 23.3% and 27.6%, which were significantly lower
than the ratio (48.8%) of no-transgenic control. All these results indicated that the drought tolerance of trans-
genic wheat with TPSP gene was greatly enhanced and this provide an important basis for the further applica-
tion of these transgenic materials in drought resistant breeding of wheat.
Key words: wheat; TPSP fusion gene; drought tolerance
干旱是限制小麦持续高产、稳产的重要逆境
因子, 设法提高小麦耐旱能力是当前小麦育种研
究的重要方向之一。近年来, 随着植物生物技术
的迅速发展, 转基因育种正在成为作物常规育种
的有效补充。研究发现, 一些植物, 如沙漠中生长
的复活草[Selaginella lepidophylla (Hook. and
Grev.) Spring]具有的超强耐旱能力与其体内高浓
度的海藻糖(trehalose)积累密切相关(Goddijn和van
植物生理学报82
Dun 1999; Zentella等1999)。进一步分析表明, 海
藻糖是一种非还原性二糖, 在胁迫条件下可有效
维持生物膜及细胞内活性物质的稳定性, 从而提
高生物体对逆境胁迫的耐受能力(Iturriaga等2009;
Chary等2008)。因此, 通过转基因技术提高作物中
海藻糖的合成能力是获得耐旱作物新材料的重要
策略之一(Karim等2007; Garg等2002)。已有研究
报道, 海藻糖合成相关基因TPS或TPP在水稻(Garg
等2002)、小麦(杜丽璞等2007)和烟草(Almeida等
2005)等植物中过表达后均可不同程度地提高转基
因植株的耐旱性。为了进一步获得耐旱性强的转
基因小麦材料 , 我们在前期研究中构建了海藻
糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因otsA和海藻糖-6-磷酸
磷酸酯酶(TPP)基因otsB的融合基因TPSP及其干旱
诱导型表达载体, 并获得了转基因小麦新材料(李
永春等2009)。在此基础上, 本研究对转基因小麦
的耐旱相关生理指标进行了分析和鉴定, 为转基
因小麦新材料在抗旱育种中的应用奠定基础。
材料与方法
供试材料为3个转TPSP基因小麦(Triticum
aestivum L.)纯合株系4-4-1、4-9-1和30-1-2, 以‘豫
麦18’ (Y18)作为对照。室内培养条件为: 挑选发育
良好的种子60粒, 在培养箱中(温度为26 ℃, 相对
湿度为70%~78%, 光照条件为160 μmol·m-2·s-1, 14 h)
水培至两叶一心期, 用于各项室内鉴定分析。模
拟干旱胁迫方法为: 在两叶一心期用20%聚乙二醇
(PEG6000)代替水继续在培养箱中培养, 在干旱胁
迫的不同时间点观察各材料的生长状态, 并进行
脯氨酸含量和光合特性分析。脯氨酸含量的测定
采用茚三酮法(邹琦2000), 叶绿素荧光参数的测定
使用OS5-FL型调制式叶绿素荧光分析仪(美国OP-
TI-SCIENCES公司)进行。剪取胁迫前和胁迫100
h后的小麦茎叶组织, 用液氮研磨后采用Megazyme
海藻糖检测试剂盒(K-TREH)测定海藻糖的含量,
具体操作和计算方法参照试剂盒的说明书进行。
上述所测定实验均设3次生物学重复。采用CTAB
法提取小麦叶片的基因组DNA用于转基因材料的
PCR鉴定分析 , 转基因特异性引物为 : TPSP-8
(5-GTGGGGAAGTAATCCTTGTGC-3)和TPSP-9
(5-ACGCGGGTCAGGTTAGAAA-3), 预期扩增产
物为734 bp; PCR反应体系为20 μL, PCR 扩增程序
为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 56.5 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,
35个循环; 72 ℃ 7 min。
结果与讨论
1 转基因小麦中海藻糖的诱导性积累
所有转基因株系均经过PCR鉴定后才用于后
续的耐旱特性分析。PCR检测显示, 转基因株系基
因组中均可以扩增到和预期的目标片段大小(734
bp)一致的条带, 而非转基因对照中未检测到目标条
带(图1-A)。对转基因株系中海藻糖含量的测定表
明, 在水分胁迫100 h后转基因小麦中海藻糖的含量
显著高于非转基因对照, 在水分胁迫条件下转基因
株系中海藻糖的含量为胁迫前的3~8倍, 其中株系
4-4-4在胁迫条件下海藻糖的含量达486.8 mg·g-1
(FW) (图1-B)。可见, 转基因小麦中海藻糖的含量
受水分胁迫诱导而大幅度提高, 这与目的基因TPSP
受干旱诱导性启动子的驱动有关(李永春等2009)。
图1 转基因小麦中目的基因的鉴定及海藻糖检测
Fig.1 Identification of transgene and detection of trehalose in
transgenic wheat
A: 转基因小麦PCR鉴定; B: 转基因小麦海藻糖含量测定。M:
1 kb plus DNA ladder; P: 质粒DNA阳性对照; Y18: 非转基因对照
‘豫麦18’; 4-9-1、4-4-4和30-1-2分别为3个转基因株系。
李金花等: 转TPSP融合基因小麦的耐旱相关特性 83
2 转基因小麦叶片中脯氨酸的积累动态
在利用20% PEG6000溶液处理的模拟干旱条
件下, 对转基因株系幼苗叶片中脯氨酸含量的测
定表明(图2): 在胁迫前, 转基因株系和非转基因对
照叶片中脯氨酸的含量没有显著差异; 随着胁迫
时间的延长, 转基因株系和对照叶片中脯氨酸的
含量均呈现出逐渐增加的趋势, 但3个转基因株系
叶片中的脯氨酸积累速度和积累量均显著高于非
转基因对照; 转基因株系4-4-4叶片中脯氨酸的积
累最快, 在胁迫6 h时叶片中脯氨酸的含量已经达
到101.6 mg·g-1 (FW), 而非转基因对照在胁迫12 h时
才达到这一水平; 在胁迫12 h以后, 转基因株系30-
1-2叶片中脯氨酸的含量最高, 在胁迫后48 h时达
到400.9 mg·g-1 (FW)。大量研究表明, 许多植物在
干旱、盐渍等胁迫条件下叶片中会有大量的脯氨
酸积累, 而且脯氨酸的积累能力与植物的抗旱性
呈正相关, 因此脯氨酸含量已成为评价植物抗旱
能力的重要指标之一(陈吉宝等2010)。本研究发
现, 在没有胁迫时3个转基因株系叶片中的脯氨酸
含量与对照差异不大, 但在干旱胁迫条件下转基
因株系的脯氨酸积累速度和积累量均显著高于对
照, 表明转基因株系中脯氨酸的干旱诱导性积累
能力显著提高, 这可能与转基因株系中TPSP基因
受干旱诱导性启动子驱动有关(李永春等2009)。
系叶绿素荧光参数的测定显示(图3): 随着胁迫时
间的延长, 可变荧光值(Fv)与最大荧光值(Fm)之比
(Fv/Fm)逐渐降低, 而且3个转基因株系的Fv/Fm值在
水分胁迫后的各个时间点均略高于非转基因对照
(图3-A); 可变荧光值(Fv)与固定荧光值(Fo)之比(Fv/
Fo)也表现出类似的动态, 其中转基因株系4-4-4在
胁迫过程中的各个时间点Fv/Fo值均显著高于非转
基因对照(图3-B), 说明转基因株系在胁迫条件下
的光系统II (PSII)光化学效率有所增强, 这可能与
转基因株系中海藻糖的干旱诱导性积累有关, 这
与Garg等(2002)在水稻中的相关研究结果一致。
4 转基因小麦幼苗的耐旱性
在模拟干旱条件下进行的耐旱性鉴定显示, 3
个转基因株系具有较强的耐旱能力(图4)。在胁迫
前, 转基因株系和非转基因对照的生长状态基本
一致(图4-A); 胁迫12 h时, 小麦幼苗出现部分叶片
萎蔫下垂和少数叶尖变黄现象, 但转基因株系和
对照植株差异不明显; 胁迫24 h时, 大部分叶片出
现萎蔫下垂, 48 h时转基因株系的萎蔫程度明显要
低于非转基因对照; 胁迫100 h时, 非转基因对照叶
片几乎全部萎蔫, 且失绿严重, 而转基因株系则表
现出不同程度的耐旱性(图4-B); 之后进行复水实
图2 转基因小麦的脯氨酸积累动态
Fig.2 The accumulation patters of praline in transgenic wheat
lines
3 转基因小麦的叶绿素荧光参数变化
叶绿素荧光参数是评价干旱胁迫对植物光合
作用影响的有效方法(张仁和等2011), 对转基因株
图3 干旱胁迫过程中转基因小麦的叶绿素荧光参数变化
Fig.3 Changes of chlorophyll fluorescence parameters in
transgenic wheat under water-stress
植物生理学报84
验, 复水6 h时转基因株系已基本恢复正常生长, 而
非转基因对照植株仍表现出干旱胁迫症状; 复水
24 h时, 转基因株系和对照均已恢复正常生长, 但
叶片黄化率仍存在显著差异, 非转基因对照的黄
化率平均为48.8%, 而转基因株系4-9-1、4-4-4和
30-1-2的叶片黄化率分别为25.2%、23.3%和
27.6%, 显著低于非转基因对照。
抗旱能力。在自然干旱条件下, 转基因株系在田
间的生长发育正常, 且表现出很强的耐旱性, 转基
因株系的千粒重明显高于非转基因对照(未发表数
据), 这与Suarez等(2008)在大豆中的研究结果一
致。可见, 转TPSP基因小麦具有较强的耐旱性和
良好的综合性状, 这为转基因材料作为亲本资源
在小麦抗旱育种中的应用奠定了基础。
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海藻糖作为一种重要的渗透条件物质, 在干
旱、高温、冷冻等非生物胁迫条件下具有保护植
物细胞膜结构及维持细胞内蛋白质活性的作用,
通过基因工程的方法提高植物体内海藻糖的积累
能力已成为植物抗旱研究的重要方向(Iordachescu
和Imai 2008)。然而, 海藻糖合成相关基因的组成
型表达会造成转基因植株矮化等不良性状, 这可
能与转基因植株中海藻糖的过量积累有关(Karim
等2007)。另外, 将海藻糖合成相关的单个基因导
入植物后, 转基因植株的抗旱能力也显得非常有
限(Iordachescu和Imai 2008)。因此, 本课题组在前
期的研究中, 克隆构建了海藻糖合成酶(TPS)和海
藻糖磷酸酯酶(TPP)的融合基因TPSP, 并利用干旱
诱导性启动子驱动目的基因, 以防止因转基因植
株中海藻糖的过渡积累而导致的不良性状(李永春
等2009)。本研究发现, 转TPSP基因小麦纯合株系
的耐旱相关生理指标均优于对照, 表现出较强的
图4 转基因株系耐旱性鉴定
Fig.4 Drought tolerant assay of transgenic lines
A: 胁迫前植株; B: 胁迫100 h的植株; 1~4: 分别为非转基因对
照、转基因株系4-9-1、4-4-4和30-1-2。