全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (10): 1010~10161010
收稿 2011-08-03　　修定 2011-08-17
资助 国家自然科学基金(90917005)、江苏省高校自然科学
研究基金(10KJB180010)和扬州大学科技创新培育基金
(2010CXJ047)。
* 通讯作者(E-mail: jssliang@126.com; Tel: 0514-87979320)。
H2O2和MAPK介导油菜素内酯诱导番茄抗氧化防护酶SOD和CAT的信号
途径
丁海东, 刘慧, 陈一, 王丹, 梁建生*
扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州225009
摘要: 本文以番茄为材料, 研究H2O2和MAPK在BR诱导的抗氧化防护系统中的作用。结果表明, 外源BR提高抗氧化防护酶
SOD和CAT活性; 而这种诱导机制被H2O2产生抑制剂二苯基碘(DPI)和MEK1/2专一抑制剂PD98059阻断。进一步研究发现:
BR能够诱导细胞质外体H2O2的产生, 这种诱导被PD98059抑制; BR能够活化一种49 kDa MAPK, 这种活化被DPI抑制。本
研究结果证实细胞质外体H2O2和MAPK候选激酶(49 kDa MAPK)信号参与BR诱导的抗氧化防酶途径, 且两者之间存在交
互作用。
关键词: 番茄; 油菜素内酯; H2O2; MAPK; 抗氧化防护酶
Involvements of H2O2 and Mitogen-Activated Protein Kinase Signals in
Brassinosteroid-Activated Tomato Antioxidant Defense Enzymes Superoxide
Dismutase and Catalase
DIng Hai-Dong, LIu Hui, CHEn Yi, WAng Dan, LIAng Jian-Sheng*
College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China
Abstract: In this study, the role of H2O2 and MAPK (mitogen-activated protein kinase) in BR (brassinosteroid)-
induced antioxidant defense system were investigated in leaves of tomato, Lycopersicom esculentum Mill.. The
results showed that exogenous BR increased antioxidant defense enzymes SOD and CAT activities. However,
the induction mechanisms were blocked by pre-treatment with the apoplastic H2O2 production inhibitor DPI and
the mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1/2) specific inhibitor PD98059. Further studies showed that
BR was able to induce the production of apoplastic H2O2 and the activation of a 49-kDa MAPK, which were in-
hibited by PD98059 and DPI, respectively. The results suggest that the interactive cross-talk between apoplastic
H2O2 signal and a candidate MAPK kinase (48 kDa MAPK) signal are involved in BR-activated antioxidant de-
fense enzymes.
Key words: Lycopersicom esculentum Mill.; brassinosteroid; H2O2; MAPK; antioxidant defense enzymes
油菜素内酯(brassinosteroid, BR)是一类重要
的植物激素, 不仅参与植物的生长发育调控, 而且
也可以使植物对生物胁迫和非生物胁迫有一定应
答和调节作用。BR能够提高植物耐高温、低温、
干旱、盐害、病毒等逆境胁迫的能力 (宋丽等
2006; Xia等2009)。虽然, 近年来利用BR不敏感和
合成缺失突变体材料, 对BR信号产生、与膜受体
结合引起信号的感知和传递、最终引起BR诱导基
因的表达及参与植物生长发育进行了较为详细的
研究 , 如BR的细胞表面受体激酶BRI1、BRI1/
BAK1激酶复合物的转磷酸化激活、BIn2激酶活
性抑制、BSK激酶磷酸化、BSu1磷酸酶激活等
(Haubrick和Assmann 2006; Li和Jin 2007), 但是, BR
调控植物耐逆境胁迫的信号转导机理研究还很少
(Bari和Jones 2009)。积累的证据表明, BR诱导植
物耐逆性至少部分与BR诱导细胞抗氧化防护系
统, 从而提高耐氧化胁迫能力有关。BR能够诱导
植物细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶
(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还
原酶(gR)等抗氧化防护酶活性提高, 诱导一些非
酶类抗氧化剂如抗坏血酸(ASC)、谷胱甘肽(gSH)
丁海东等: H2O2和MAPK介导油菜素内酯诱导番茄抗氧化防护酶SOD和CAT的信号途径 1011
等含量的增加(Özdemir等2004; Arora等2008; Ba-
jguz和Hayat 2009; Xia等2009)。越来越多的证据
表明, 过氧化氢(H2O2)可作为信号分子, 在生长发
育、气孔运动、激素应答、细胞程序性死亡以及
生物胁迫和非生物胁迫应答调控过程中起重要作
用(Mittler 2002; Miller等2008)。Xia等(2009)最近
的研究表明H2O2对BR胁迫诱导的抗氧化酶基因表
达及活性具有重要的调节作用。促分裂原活化蛋
白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的
级联系统被认为是植物细胞将胞外刺激信号转换
成胞内反应的主要途径之一(Zhang和Klessig 2001;
Jonak等2002; nakagami等2005)。MAPK的活化有
利于它转运到细胞核内, 磷酸化与活化下游的信
号组分如转录因子, 从而调节基因表达。大量的
研究表明, MAPK参与植物响应干旱、盐渍、各种
激素等信号的转导过程(nakagami等2005; Zhang
等2006; Colcombet和Hirt 2008; Xing等2008; Ding
等2009)。BR处理不能够活化水稻OsBRI1 (对BR
不敏感突变体)幼苗中的60 kDa MAPK (Sharma等
2001), 但是能够诱导黄瓜幼苗MAPK1和MAPK3基
因表达(Xia等2009)。但是, BR信号途径中MAPK
的具体调控机制及下游信号途径还未见报道。
在BR信号途径之中是否存在H2O2和MAPK途
径是本文要研究的问题。本文以番茄叶片为材料,
运用药理学、生理学、细胞生物学等手段 , 以
H2O2产生抑制剂二苯基碘(diphenylene iodonium,
DPI)和MEK1/2专一抑制剂PD98059处理, 研究
H2O2和MAPK在BR诱导的抗氧化防护系统中的作
用机制。这一研究不仅能够有利于我们对BR调控
机制的理解, 而且对农业上利用BR进行生产调控
具有重要的理论意义。
材料与方法
番茄(Lycopersicom esculentum Mill. cv. ‘浦红
90’)种子, 由上海市农业科学院园艺研究所提供。
种子经55 ℃烫种15 min、浸种6 h后置于28 ℃恒
温培养箱中催芽。待种子露白后, 播于盛白沙的
黑色营养钵中。待两片子叶露出, 用霍格兰氏液
(Hoagland solution) 0.5倍进行浇灌。待两片真叶
充分展开时, 从茎基部用刀片快速割取幼苗(Oroz-
co-Cárdenas和Ryan 2002; Zhang等2006), 置于纯水
处理1~2 h以去除伤害, 然后将离体植株置于铝箔
纸包裹的50 mL烧杯中, 用10 nmol·L-1 2,4-表油菜
素内酯(2,4-epibrassinolide, EBR)溶液进行时间不
等的处理。为研究各种抑制剂的影响, 先用100
µmol·L-1 PD98059和100 µmol·L-1 DPI预处理4 h, 再
转入10 nmol·L-1 BR进行处理8 h, 条件同上。以超
纯水处理为对照。处理结束后, 取第二片真叶作
为样品, 快速置于液氮中冷冻, -80℃保存。
抗氧化酶活性分析参照Jiang和Zhang (2002)
的方法。取冷冻叶片0.5 g, 加入10 mL 50 mmol·L-1
磷酸钾缓冲液(pH 7.0) (1 mmol·L-1 EDTA, 1%
PVP), 研磨成匀浆, 上清液为粗酶液。SOD活性通
过观察nBT的光还原抑制程度来测定, 以560 nm
时抑制nBT光还原50%作为一个酶单位。CAT活
性以H2O2在240 nm的分解速率来计算。根据H2O2
的摩尔消光系数为39.4 mmol·L-1·cm-1计算酶活
性。蛋白质含量测定方法参考Bradford (1976), 以
牛血清白蛋白作标准。
从番茄植株上取下叶片, 刀片取1~2 mm2的叶
块。置于5 mmol·L-1 CeC13 (pH 7.2)中真空渗透
1 h。把叶片放在固定液中室温固定1 h及在4 ℃过
夜。用二甲胂酸盐缓冲液(CAB)漂洗2次, 每次10
min。用1% (V/V)饿酸固定45 min, 乙醇(30%~100%;
V/V)逐级脱水后用混合树脂(Eponaraldite)包埋, 纯
树脂包埋12 h, 再换新树脂置换4 h, 然后60 ℃聚合
48 h包埋块在Reichert-ultracut E切片机上切片
(70~90 nm), 附于铜网上, 加速电压75 kV, 透射电
镜观察H2O2亚细胞定位(Zhang等2006)。
参照Ding等(2009)所描述的方法, 将-80 ℃保
存的样品液氮研磨成粉末, 加1.5倍体积的提取缓
冲液(100 mmol·L-1 HEPES, pH 7.5, 5 mmol·L-1
EDTA, 5 mmol·L-1 EgTA, 10 mmol·L-1 dithiothreitol,
10 mmol·L-1 na3VO4, 10 mmol·L
-1 NaF, 50 mmol·L-1
β-glycerophosphate, 1 mmol·L-1 PMSF, 5 µg·mL-1 le-
upeptin, 5 µg·mL-1 aprotinin, 5% glycerol), 4 ℃浸提
2 h, 23 000×g低温(4 ℃)离心1 h, 弃沉淀取上清, 上
清即为粗提液。凝胶激酶活性分析是将蛋白提取
液进行12% SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳, 其胶中嵌有
MBP 0.5 mg·mL-1作为激酶底物。电泳后, 凝胶经
过洗脱、变性、复性。然后将凝胶放入30 mL反
应缓冲液和200 nmol·L-1 ATP加50 μCi γ-32P-ATP, 在
植物生理学报1012
室温下反应60 min。而后转入终止液中终止反应。
用同样溶液将凝胶清洗4次。最后用玻璃纸将凝
胶制成干胶, 用Kodak XAR-5胶片放射自显影。
50 μg蛋白质与2 μg酪氨酸磷酸化单克隆抗体
4g10在免疫沉淀缓冲液中4 ℃孵育4 h, 大约加入
20 μL protein G agarose再孵育2 h, 简短离心收集蛋
白质-抗体复合物, 用免疫沉淀缓冲液洗3次, 然后
加入l×SDS上样缓冲液沸水煮3 min, 离心, 取上清,
进行10% SDS-PAgE电泳, 电泳结束后进行凝胶激
酶分析(Zhang等2006)。
实验结果
1 BR提高抗氧化酶活性
采用离体植株快速吸收水分的模式, 以外源
10 nmol·L-1 BR溶液处理离体番茄幼苗24 h, 观察
SOD和CAT活性变化。如图1所示, 对照情况下酶
活性随着时间进程呈不同的动态变化(SOD呈上升
趋势; CAT呈下降趋势)。然而, 外源BR处理同时
提高两种酶活性, 且在处理8 h时达最大(SOD和
CAT分别上升46.8%和54.2%)。BR却不能够显著诱
导其他两种常见的APX和gR活性(数据未列出)。
因此, 本文将处理8 h作为BR活性作用的时间点。
2 H2O2和MAPK介导BR激活的抗氧化防护酶途
径
为了研究其是否参与BR诱导的抗氧化防护
酶信号途径, 结合前人使用的抑制剂浓度(Zhang等
2006, 2010)和我们预实验结果, 我们以100 µmol·L-1
DPI和PD98059预处理离体幼苗, 再经BR处理8 h,
发现BR诱导的抗氧化防护酶的能力降低。如图2,
抗氧化酶SOD和CAT活性明显被抑制, 降低到对照
图1 BR对抗氧化防护酶SOD (A)和CAT (B)活性的影响
Fig.1 Effects of BR on the activities of antioxidant defense
enzymes SOD (A) and CAT (B) during 24 h treatment
图2 H2O2产生抑制剂DPI和MEK1/2抑制剂PD98059对BR诱导抗氧化防护酶活性的影响
Fig.2 Effects of pretreatment with H2O2 production inhibitor DPI and MAPK activation inhibitor PD98059 on antioxidant defense
enzymes in tomato leaves induced by BR treatment
丁海东等: H2O2和MAPK介导油菜素内酯诱导番茄抗氧化防护酶SOD和CAT的信号途径 1013
水平。药理学证据表明, H2O2和MAPK信号参与
BR激活的抗氧化防护酶途径。
3 BR诱导H2O2产生
为了进一步验证H2O2参与BR信号, 我们观察
BR对番茄叶片细胞中H2O2产生情况。我们采用
H2O2与CeCl3形成致密电子复合物的细胞化学方法
研究BR诱导叶片中H2O2积累的亚细胞位点。如图
3所示, BR处理离体叶片8 h, 发现叶肉细胞质外体
中H2O2积累(图3-B), 而水处理则不能(图3-A)。与
直接BR处理的叶片相比, DPI预处理后再进行BR
处理, 叶片中H2O2-CeCl3沉淀颗粒明显减少(图
3-C)。这些结果表明BR能够诱导H2O2大量积累,
且主要来源是nADPH氧化酶。
4 BR活化49 kDa MAPK
为明确外源BR对番茄叶片中MAPK的活化作
用, 我们用BR对离体幼苗进行处理, 以髓鞘碱性蛋
白(MBP)为底物的凝胶激酶分析的方法研究了BR
对叶片MAPK的活化情况。如图4-A, BR活化一个
分子量为49 kDa的MBP激酶, 且持续到8 h, 在2 h
时达到最大。抑制剂的溶剂DMSO对活性没有影
响(图4-B)。此外, 该酶活性不但能够被PD98059抑
制(图4-B), 而且能够被酪蛋白磷酸化抗体4g10免
疫共沉淀(图4-C)。MAPK的一个显著特征就是酪
氨酸磷酸化。4g10已被广泛用于MAPK的酪氨酸
磷酸化鉴定。这表明BR诱导番茄49 kDa的MBP激
酶是一种MAPK, 可以作为BR信号途径中一种
MAPK候选蛋白。
5 H2O2与MAPK相互关系
不同的信号途径中, H2O2与MAPK相互关系
也不同。如Jiang等(2003)认为活化的MAPKs激活
图3 BR诱导番茄叶片H2O2产生的亚细胞定位
Fig.3 Subcellular localization of H2O2 production induced by BR in leaves of tomato seedlings
A: 对照; B: BR处理; C: DPI预处理+BR处理; D: PD98059预处理+BR处理。虚线箭头: H2O2-CeCl3沉淀颗粒; 实线箭头: CW (细胞壁)。
Bar=1 µm。
图4 BR活化49 kDa MAPK
Fig.4 BR activated 49 kDa MAPK kinase
A: BR诱导以MBP为底物的49 kDa蛋白激酶活化; B: DPI和
PD98059抑制剂预处理抑制49 kDa蛋白激酶活性; C: 酪蛋白磷酸
化抗体4g10免疫共沉淀49 kDa蛋白激酶。
下游H2O2产生系统的活性, 以调控ABA诱导的气
孔关闭。而Zhang等(2006)研究发现ABA诱导的
H2O2激活ZmMPK5, 再激活下游靶标。为研究BR
信号通路中H2O2与MAPK的关系, 用MEK1/2的抑
制剂PD98059预处理离体叶片, 观察叶片中H2O2沉
积。如图3-D, 细胞的定位显示MAPK抑制剂几乎
完全阻断了BR诱导的质外体中H2O2的产生。用
H2O2产生抑制剂DPI预处理离体幼苗再通过凝胶
激酶反应测定叶片中MAPK的活性, 图4-B显示
DPI能阻断BR诱导的MAPK的活化。研究结果表
明, BR诱导质外体H2O2产生途径被MAPK级联介
导, 同时H2O2也参与了BR诱导的玉米叶片MAPK
活化, 两者存在交互对话(cross-talk)。
植物生理学报1014
讨　　论
大量研究显示BRs能够通过调控抗氧化系统,
提高耐氧化胁迫的能力, 进而调控植物对各种环
境胁迫的适应性(Bajguz和Hayat 2009)。BR预处
理能显著减轻高温胁迫对番茄植株的光合作用抑
制, 降低膜脂过氧化(MDA)程度, 增强抗氧化防护
酶SOD、APX、CAT的活性(Ogweno等2008)。
BRs预处理能增强铝胁迫下绿豆幼苗和镉胁迫下
鹰嘴豆幼苗的CAT、POD、SOD活性(Ali等2008;
Hasan等2008)。单独BR处理能够诱导玉米叶片
SOD、APX、CAT、gR活性及其基因表达(Zhang
等2010)。本文研究结果显示, 单独BR处理显著上
调番茄叶片SOD和CAT这两种抗氧化防护酶的活
性(图1), 但是对其他几种酶诱导效果不明显(数据
未列出)。之所以存在差异, 主要原因可能与不同
植物、不同处理时间、方法及不同BR浓度处理等
有关。
H2O2是细胞有氧代谢的产物, 在各种胁迫下
产生量增加, 不仅具有损伤生物大分子从而伤害
细胞的效应, 还是一种重要的信号分子, 通过诱导
细胞内一系列防御基因表达使细胞对环境作出响
应。大量研究表明H2O2作为信号分子广泛参与了
植物的生理过程, 包括病原防御、程序性细胞死
亡、胁迫防御、激素反应、光合作用调节、生长
发育等(Mittler 2002; Mittler等2004; Miller等
2008)。最近, Xia等(2009)研究表明H2O2参与了BR
诱导的黄瓜耐氧化胁迫能力的提高, BR诱导的
H2O2集中在叶肉细胞的质外体中。Zhang等(2010)
研究发现BR不但能够诱导玉米叶片质外体H2O2的
产生, 也能够诱导叶绿体中H2O2产生, 而线粒体和
过氧化物酶体中的H2O2产生则不受BR诱导。我们
也发现BR能诱导叶肉细胞质外体中H2O2积累, 且
这种积累能够被nADPH氧化酶的抑制剂DPI阻断
(图3)。DPI是nADPH氧化酶专一抑制剂, 被用来
研究nADPH来源的H2O2信号通路。同时, DPI预
处理消除了BR诱导的番茄叶片SOD和CAT抗氧化
防护酶活性的提高(图2)。该结果表明BR通过
nADPH氧化酶调控质外体H2O2的产生, 进而调控
抗氧化防护酶SOD和CAT。
来自生物化学与遗传学的研究显示, 蛋白质
的可逆磷酸化在调节植物适应性响应各种环境胁
迫的生理状态与基因表达方面, 起着重要的作用
(Xiong和Yang 2003)。MAPK信号的级联系统主要
由三种功能上相互联系的蛋白激酶MAPKKK、
MAPKK和MAPK组成。在这种蛋白磷酸化的模
式中, 一种MAPKKK能够磷酸化和活化某一特定
的M A P K K , M A P K K再磷酸化和活化某一
MAPK。MAPK的激活有利于它转运到细胞核内,
磷酸化与活化下游的信号组分如转录因子, 从而
调节基因表达。MAPK参与多种激素信号途径如
ABA、JA、ETH等, 但是关于BR信号途径中的
MAPK研究还很少。Xia等(2009)报道BR诱导黄瓜
幼苗MAPK1和MAPK3基因表达。然而, 关于BR诱
导植物MAPKs活化的报道还很少。BR能够激活
玉米叶片中ZmMPK5 (Zhang等2010)。PD98059是
广泛用于MAPK分析的专一性抑制剂, 通过抑制
MEK1/2的激酶活性进而抑制下游MAPK的活性。
本研究BR能活化一个49 kDa MBPK, 活性能够持
续8 h, PD98059抑制剂和酪氨酸磷酸化抗体4g10
免疫共沉淀分析证明该激酶是一种MAPK(图4)。
Zhang等(2006)的研究显示ABA能诱导一46 kDa
MAPK的活化, 而MEK1/2抑制剂PD98059阻断
ABA对玉米叶片中抗氧化防护的增强, 暗示MAPK
参与了ABA诱导的抗氧化防护的增强。然而MAPK
是否参与BR诱导的抗氧化防护还不清楚。本实验
同时用PD98059预处理番茄幼苗发现对BR诱导的
抗氧化防护酶活性上调有明显抑制作用(图2), 表
明BR通过调控MAPK (如49 kDa MAPK)活性, 进
而调控抗氧化防护酶SOD和CAT。BR诱导MAPK
活化和激活SOD和CAT时间上存在差异, 推测BR
诱导SOD和CAT途径中, 在MAPK下游仍存在信号
通路, 但是具体信号途径仍有待研究。
已有的研究表明, H2O2和MAPK两种信号因
子之间在不同的信号途径中可能存在相互作用。
H2O2能诱导植物MAPKs的活化(Moon等2003;
Zhang等2006)。Zhang等(2006)的研究表明H2O2能
激活玉米叶片中MAPK并具有浓度效应。MAPKs
也能够影响植物中H2O2的积累(Zhang等2006; Ren
等2002; Yoshioka等2003)。运用能表达持续性活
化特性的MAPKK和MEKDD突变体的研究表明延
长MAPKs的活化将导致H2O2的大量产生(Ren等
2002; Yoshioka等2003)。BR诱导抗氧化防护信号
丁海东等: H2O2和MAPK介导油菜素内酯诱导番茄抗氧化防护酶SOD和CAT的信号途径 1015
途径中H2O2和MAPK之间的相互关系仍需进一步
探索。我们的研究结果显示, nADPH氧化酶的抑
制剂DPI能阻断BR对番茄叶片49 kDa MAPK的活
化(图4), 暗示H2O2是BR诱导MAPK活化必需的。
同时, MEK1/2抑制剂PD98059抑制BR诱导的质外
体中大部分H2O2的产生(图3), 表明MAPK参与了
BR诱导的质外体H2O2的产生。所有研究结果表
明, 在BR诱导抗氧化防护酶活化过程中, H2O2和
MAPK起着重要作用, 且之间存在交互对话(cross-
talk)。
总之, 本研究结果不仅显示番茄细胞质外体
H2O2信号和MAPK候选激酶(49 kDa MAPK)信号
参与BR诱导番茄叶片抗氧化防护酶(CAT和SOD)
活性提高, 而且揭示BR信号途径中H2O2和MAPK
之间存在交互对话。进一步的相关分子生物学方
面功能研究本实验室正在进行。
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