全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1406~1412　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.02541406
收稿 2014-05-27　　修定 2014-07-15
资助 国家自然科学基金(31100201)、河南省教育厅科学技术研
究重点项目(13B210059)和河南省高等学校青年骨干教师
资助计划(2013GGJs-039)。
* 通讯作者(E-mail: zhangsongzi@163.com; Tel: 0371-
63558121)。
烟草NtGCN2的克隆与表达分析
张康旭, 刘国顺, 李雯雯, 王叶青, 杨永霞, 贾宏昉, 张洪映, 崔红, 张松涛*
河南农业大学烟草学院, 烟草行业烟草栽培重点实验室, 郑州450002
摘要: GCN2是目前所有测序植物中唯一的eIF2α激酶, 它可以通过磷酸化真核翻译起始因子eIF2α来调节蛋白的合成, 从而
对氨基酸的缺乏和各种胁迫做出响应。本研究采用RACE PCR技术从烟草K326中获得了GCN2的末端序列, 通过RT-PCR
方法获得了部分cDNA序列, 经过拼接得到了GCN2的全长cDNA序列, 将其命名为NtGCN2 (GenBank登录号KJ706220)。分
析发现, NtGCN2基因的cDNA全长为4 196 bp, ORF全长为3 759 bp, 编码1 252个氨基酸残基, 分子量为141.4 kDa, 等电点为
5.58。BlAsTP分析结果表明, NtGCN2与土豆和番茄的同源性分别达到90%和88%。对其蛋白质结构域进行预测发现,
NtGCN2包含了典型的GCN2激酶功能域。荧光定量PCR分析表明, 该基因在根、茎、叶和花中均有表达, 在叶片中表达最
强, 根中的表达最弱。
关键词: 烟草; GCN2; eIF2α激酶
Cloning and Expression Analysis of NtGCN2 in Nicotina tobaccum
ZHANG Kang-Xu, lIU Guo-shun, lI Wen-Wen, WANG Ye-Qing, YANG Yong-Xia, JIA Hong-Fang, ZHANG Hong-Ying, CUI
Hong, ZHANG song-Tao*
Key Lab for Tobacco Cultivation of Tobacco Industry, College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou
450002, China
Abstract: Higher plants contain only a GCN2-type eIF2α kinase in their genome, which can phosphorylate the
translation initiation factor eIF2α to regulate the general protein synthesis in response to amino acid starvation
or stresses. In this study, we cloned the GCN2 from Nicotina tobaccum K326 by rapid amplification of cDNA
ends (RACE), named NtGCN2, which included a 3 759-bp open reading frame encoding 1 252 amino acid
residues. The molecular weight of the predicted amino acid sequence of the NtGCN2 protein was 141.4 kDa
with a theoretical pI of 5.58. Further, sequence alignment by BLASTP showed NtGCN2 shared the high simi-
larity to Solanum tuberosum GCN2 (90%) and Solanum lycopersicum GCN2 (88%) and contained a typical ki-
nase catalytic domain and a His-tRNA synthetase-related domain. Finally, Real-time PCR was porfermed to re-
veal that NtGCN2 was expressed in roots, stems, leaves and flowers, with higher expression in leaves and
lower in roots.
Key words: tobacco; GCN2; eIF2α kinase
植物对各种生物胁迫和非生物胁迫的耐受将
决定作物的产物和质量。而胁迫和代谢信号之间
的互相作用决定了植物对于胁迫的应答效率。在
胁迫和氮/氨基酸信号之间的起到重要连接作用的
一个蛋白激酶叫作GCN2 (general control non-dere-
pressible 2), 该酶参与了蛋白合成的调节(Hey等
2010)。GCN2可以使真核翻译起始因子eIF2的α亚
基发生磷酸化, 从而应答氨基酸的缺乏和各种胁
迫(Halford等2004)。随着全球气候的改变, 植物要
面临各种环境改变而引起的胁迫, 作物也需要面
对诸如干旱、新的杂草、虫害、病害、冷害等各
种胁迫(Semenov和Halford 2009)。因此, GCN2介
导的胁迫应答对于植物的生存变得越来越重要。
蛋白质的合成效率是由翻译的起始所决定
的。在蛋白质翻译起始过程中, 真核翻译起始因
子eIF2α (a subunit of eukaryotic translation initiation
factor 2)的磷酸化对蛋白翻译起到了重要的调控作
用(Halford 2006)。eIF2α的磷酸化是通过eIF2α激
酶来完成的。eIF2α激酶可以使eIF2的α亚基上51
位丝氨酸发生磷酸化, 进而抑制抑制了eIF2-GDP
张康旭等: 烟草NtGCN2的克隆与表达分析 1407
向eIF2-GTP的转化, 阻止了翻译起始的进一步循
环, 从而导致蛋白质合成受到抑制(Browning 1996,
2004; Wek等2006)。
目前在动物中共发现4种可以使eIF2α发生磷
酸化的蛋白激酶(PKR、PERK、HRI和GCN2), 具
有高度保守的蛋白激酶功能域, 但是调节功能域
不同, 因此每种激酶应答不同的胁迫刺激(Hin-
nebusch 2005; Chaveroux等2010; Baird和Wek
2012)。其中 , GCN2首先在出芽酵母中发现的
(Hinnebusch 2005; Grallert和Boye 2013), 它是一个
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 参与了氨基酸缺乏的应
答。PERK激酶(the endoplasmic reticulum-resident
kinase)调整基因表达来应答内质网蛋白的错误折
叠(Zhan等2004)。PKR激酶(the interferon inducible
double-stranded RNA dependent protein kinase)参与
干扰素介导的抗病毒途径(Meurs等1990)。HRI激
酶(the heme-regulated initiation factor 2α kinase)
(Chen等1991; Mellor等1994)将蛋白合成(主要是球
蛋白)和亚铁血红素的可用性相关(Svitkin等1999;
Pavio等2003; Willcocks等2004)。
在哺乳动物中, GCN2是营养缺乏时首要的
eIF2α激酶(Deval等2009), 它比PERK和PKR的结构
复杂, 除了一个典型的真核激酶功能域之外, 它还
含有一个假的激酶功能域和一个组胺酰-tRNA合
成酶类似的功能域(Histidyl-tRNA synthetase,
HisRs), 该功能域可以结合空载tRNAs (Donnelly
等2013)。其N端存在一个GCN1/GCN20蛋白复合
物结合位点(RWD功能域), 其C端是核糖体结合位
点的功能域, N端和C端的功能域对于GCN2感知营
养胁迫信号是非常重要的(Hinnebusch和Natarajan
2002; Donnelly等2013)。
在所有已经测序的植物中, GCN2是由单个基
因编码的, 并且是唯一的eIF2α激酶。序列分析表
明, 高等植物中只存在一个GCN2类似的eIF2α激
酶(Zhang等2003, 2008; Hey等2010)。对于EsT
(expressed sequence tag)和基因组数据库的调查表
明, GCN2类似的基因存在于拟南芥、水稻、小
麦、大麦、马铃薯、大豆、甜菜、苜蓿、棉花、
白杨、莲花和百日草中(Lageix等2008)。在所有物
种中都只存在一个拷贝的GCN2基因, 并没有其它
不同的eIF2α激酶基因存在。虽然GCN2存在于很
多植物中, 但是GCN2性质尚未完全鉴定(Halford
2006)。高等植物中目前一个被鉴定的GCN2同源
物是拟南芥的AtGCN2 (Zhang等2003, 2008; Lageix
等2008)。它与动物和真菌中的GCN2结构相似, 并
且可以补偿酵母的gcn2突变体。目前烟草中尚未
有关GCN2基因的报道 , 本研究克隆了烟草中
GCN2的cDNA序列, 采用生物信息学软件对其序
列进行分析, 采用荧光定量PCR对GCN2在不同组
织中的表达进行了分析, 为进一步研究其功能奠
定了基础。
材料与方法
1 材料和主要试剂
实验材料为烟草(Nicotina tobaccum l.) K326,
DNA Marker、pMD19-T载体、PrimesTAR® GXl
DNA Polymerase、dNTP、Clontech的sMARTer™
RACE cDNA Amplification Kit (Cat. No. 634923)等
试剂购自宝生物工程有限公司(TaKaRa); Plant
Total RNA Isolation Kit (Cat. No.RE-05012)和DNA
凝胶纯化回收试剂盒(Cat. No. DE-02012)购于
Foregene公司。M-MLV Revere Transcriptase (RNase
H)反转录试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公
司。引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。
大肠杆菌感受态细胞DH5α为本试验室保存。
2 RNA提取及RACE模板制备
采用Plant Total RNA Isolation Kit提取总
RNA。5 RACE和3 RACE模板制备按照Clontech
的SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit操作
方法进行。
3 NtGCN2全长cDNA的克隆
根据小麦、拟南芥和水稻的GCN2序列保
守位点设计引物进行分段克隆(图1和表1), 根据
拼接后序列设计引物5 -RACE和MF1分别与
SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit中引物
10×Universal Primer A Mix (UPM) Long Primer
(0.4 μmol·l-1, 5 CTAATACGACTCACTATAGG-
CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3)和short
(2 μmol·l-1, 5 CTAATACGACTCACTATAGGC 3)
配对进行5/3 RACE PCR。根据测序结果拼接获
得烟草NtGCN2的cDNA全长序列。进而根据该
cDNA设计引物GCN2-ORF-F和GCN2-ORF-R扩增
植物生理学报1408
NtGCN2的ORF序列。PCR扩增产物采用1%琼脂
糖凝胶分离。采用DNA凝胶纯化回收试剂盒回收
纯化, 连接到pMD19-T载体, 转化大肠杆菌DH5α
感受态细胞, 然后涂布于lB培养基平板, 培养过
夜。挑取单克隆, 用M13引物进行菌落PCR验证。
挑选符合预期大小的阳性克隆送苏州金维智生物
科技有限公司进行测序, 每个片段至少测3个克隆,
采用DNAman软件进行序列拼接。
4 序列分析
利用NCBI的ORF finder功能确定NtGCN2的
阅读框架。运用Primer Premier 5.0软件推测蛋白
质序列, 经过NCBI网站BlAsT后, 选择与NtGCN2
同源性较高的其他植物GCN2序列, 采用Clustal W
1.83进行多重比对, 并用Phylip软件构建系统发育
树, 采用Neighbor-joining (NJ)算法的Complete
deletion模式建树, Bootstrap值取100。
5 NtGCN2的表达分析
于盛花期分别取烟草中部叶、根、茎和花各
1.0 g提取RNA, 依照M-MLV Revere Transcriptase
(RNase H)反转录试剂盒进行cDNA第一链的合
成。以烟草的NtGCN2 cDNA全长序列设计Re-
al-Time PCR引物NtGCN2-F (5 TTCCTCCTC-
GAATGGAGTAT 3)和NtGCN2-R (5 AAGATTC-
GTGTTATGGCCT 3), 以烟草根、茎、叶和花
cDNA为模板扩增目的基因片段。PCR程序为: 95 ℃
10 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。内参基
因为烟草L25基因(l18908), 内参引物 l25-F: 5
G C T T T C T T C G T C C C AT C A 3 ; l 2 5 - R : 5
CCCCAAGTACCCTCGTAT 3。实验进行3次重复。
结果与讨论
1 NtGCN2 cDNA序列的克隆和测序
以提取的cDNA为模板, 根据表1中引物进行
PCR扩增, 获得的各个片段如图2所示。PCR扩增
产物经过与pMD19-T 载体连接后, 转化DH5α。筛
选阳性克隆进行测序分析。经过拼接之后共获得
3 300 bp左右的cDNA序列。
2 NtGCN2 cDNA末端的5/3 RACE
根据获得的cDNA片段序列信息设计引物进
行5/3 RACE, RACE-PCR扩增结果如图3所示, 其
中5/3 RACE分别扩增出750和1 200 bp左右片段,
均与预期大小符合。回收PCR产物并连接入T载
图1 PCR扩增NtGCN2片段所用引物示意图
Fig.1 Schematic diagram of the primers used for amplification of the NtGCN2 fragments
表1 PCR扩增NtGCN2片段所用引物序列
Table 1 Primers sequence used for amplification of the NtGCN2 fragments
引物名称 序列(5→3)
F3 (453~473) CGWGAAGGKCGKGTTATGAT
F4 (482~494) TGGTRGAGGCTGCYCAAGARTT
F5 (1 572~1 592) GCARCATCAGCATGTTGTWCG
R1 (1 622~1 642) TAGTAMCGWACAACATGCTG
R2 (1 622~1 648) GCCTGRTAGTAMCGWACAACAT
F7 (1 876~1 896) ATTGGDGATTTTGGTCTTGC
R5 (2 723~2 757) CTCATAGCAWAGTTCWAGCATMTCTCCTCC
MF1 (3 043~3 063) AAAGAAAGACGAAATGGGTG
MR1 (3 757~3 776) TCAAGATGTCGGACCTTCAC
5-RACE CAACCAGTATCATTCATTCCCAGG
GCN2-ORF-F GCGGTCATATGGGGCAAAGTTCAAAGAAGAAG
GCN2-ORF-R CTAACAGTCGACCTAGTTCCAGATGGATGGGTTTC
张康旭等: 烟草NtGCN2的克隆与表达分析 1409
酶功能域(kinase domain)和组胺酰-tRNA合成酶类
似的功能域(HisRs) (图5), 这些功能域符合GCN2
家族的特征(Zhang等2003, 2008; Lageix等2008)。
因此, 我们推测该基因为烟草GCN2。
5 NtGCN2的系统进化分析
采用Clustal W以及Phylip软件对NtGCN2以及
其他代表性物种的蛋白序列进行了进化分析。结
果(图6)表明, NtGCN2与同科植物土豆和番茄的
GCN2在进化树上属于同一分支, 与其它非茄科植
物进化关系较远。这说明茄科GCN2在进化上是
同步的。
6 NtGCN2基因表达分析
采用荧光定量PCR分析NtGCN2在植株根、
茎、叶和花中的表达情况。结果(图7)表明, Nt-
GCN2在叶片中表达最强, 其次是在花和茎, 根中
的表达最弱。NtGCN2的基因表达模式分析发现,
该基因与拟南芥的GCN2表达模式不同, 在拟南芥
中则是根中表达量最高(Zhang等2003)。这可能是
由于不同种属表达的特征不同。
图2 PCR扩增NtGCN2片段
Fig.2 PCR amplification of GCN2 fragments
F3R2、F4R1、F5MR1、F5R5、F7R5和MF1MR1分别指采用对应引物扩增的片段。M: DNA分子标记。下图同此。
图3 RACE PCR扩增NtGCN2 cDNA的5和3末端
Fig.3 RACE PCR amplification of the 5 and 3 ends
of the NtGCN2 cDNA
A: 5 RACE PCR; B: 3 RACE PCR。1和2: 2个样品; 下图同此。
图4 NtGCN2的ORF区域的PCR扩增
Fig.4 PCR amplification of the ORF of NtGCN2
体, 挑选单克隆进行测序, 获得NtGCN2 cDNA的5
和3末端序列。
3 NtGCN2 cDNA全长的获得
根据已经获得的3 300 bp左右的序列以及
5/3RACE获得序列进行拼接获得NtGCN2 cDNA
的全长, 根据全长设计引物进行PCR, 获得NtGCN2
的ORF大约4 000 bp (图4)。回收相应的片段连接
至pMD19-T进行测序。测序结果表明NtGCN2的
ORF全长为3 759 bp。
4 NtGCN2基因全长cDNA的序列分析
NtGCN2基因cDNA全长为4 196 bp, ORF finder
分析表明该cDNA包含一个3 759 bp的完整开放读
码框(ORF)。该ORF编码1 252个氨基酸, 分子量为
141.4 kDa, 等电点pI为5.58。序列提交NCBI数据
库, 登录号为KJ706220。
BlAsTP分析结果表明, NtGCN2与土豆和番
茄的同源性分别达到90%和88%。并且对其蛋白
质结构域进行预测发现NtGCN2包含了典型的激
植物生理学报1410
GCN2可以使翻译起始因子eIF2的α亚基发生
磷酸化, 从而应答氨基酸的缺乏和各种胁迫。随
着全球气候的改变, 植物要面临各种环境改变而
引起的胁迫, 作物也需要面对诸如干旱、新的杂
草、虫害、病害、冷害等各种胁迫。因此, GCN2
介导的胁迫应答对于植物的生存变得越来越重
要。本研究成功分离了烟草K326中NtGCN2基因
片段, 并对其序列结构和表达特点进行了初步分
图5 NtGCN2及同源序列的多重比较
Fig.5 Alignment of the NtGCN2 proteins and homolog sequences from plants
Potato: 土豆(Solanum tuberosum) stGCN2 (XP_006352074.1); Tomato: 番茄(Solanum lycopersicum) slGCN2 (XP_004250832.1); Arabi-
dopsis: 拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtGCN2 (AEE79918.1); Rice: 水稻(Oryza brachyantha) ObGCN2 (XM_006652390); Wheat: 小麦(Triti-
cum aestivum) TaGCN2 (FR839672); Tobacco: 烟草(Nicotiana tobacum) NtGCN2; kinase domain: 激酶功能域; His-tRNA synthetase-related
domain: 组胺酰-tRNA合成酶类似的功能域。
张康旭等: 烟草NtGCN2的克隆与表达分析 1411
析, 对进一步研究该基因的功能以及该基因参与
的烟草胁迫应答模式等方面都具有一定意义。
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图6 NtGCN2蛋白及同源序列的系统发育树
Fig.6 Phylogenetic tree of NtGCN2 protein and homolog
sequences from plants
stu: 土豆(Solanum tuberosum) stGCN2 (XP_006352074.1); sly:
番茄(Solanum lycopersicum) slGCN2 (XP_004250832.1); Nt: 烟草
(Nicotiana tobacum) NtGCN2; Ath: 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
AtGCN2 (AEE79918.1); Rice: 水稻(Oryza brachyantha) ObGCN2
(XM_006652390); Wheat: 小麦(Triticum aestivum) TaGCN2 (FR839-
672); Rco: 蓖麻(Ricinus communis) RcGCN2 (XP_002533444.1);
Vvi: 葡萄(Vitis vinifera) VvGCN2 (XP_002264839.2); Csi: 甜橙(Citrus
sinensis) CsGCN2 (XP_006478695.1); Car: 鹰嘴豆(Cicer arietinum)
CaGCN2 (XP_004507335.1); Fve: 草莓(Fragaria vesca) FvGCN2
(XP_004309842.1); Pvu: 菜豆(Phaseolus vulgaris) PvGCN2 (XP_
007131951.1); Cru: 荠菜(Capsella rubella CrGCN2) (XP_006292311.1);
Esa: 山萮菜(Eutrema salsugineum EsGCN2) (XP_006402691.1); Ptr:
杨树(Populus trichocarpa) PtGCN2 (XP_002310436.2); Gma: 大豆
(Glycine max) GmGCN2 (XP_006592149.1)。
图7 NtGCN2在烟草不同器官中的表达
Fig.7 NtGCN2 gene expression in different
organs of tobacco
**表示不同器官和不同样本间差异极显著(P<0.01), 实验结
果为3次实验数据的平均值。
植物生理学报1412
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