全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (5): 635–644　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0605 635
收稿 2015-11-17　　修定 2016-03-28
资助 国家自然科学基金(31360056和31360169)和内蒙古自治区
科技创新团队建设计划项目(2015)。
致谢 中国林业科学院齐力旺研究员惠赠了中间锦鸡儿转录组
数据。
* 通讯作者(E-mail: wangruigang@imau.edu.cn)。
中间锦鸡儿CiMYB177的克隆及表达分析
韩晓敏, 邢丹丹, 杨杞, 李国婧, 王瑞刚*
内蒙古农业大学生命科学学院, 呼和浩特010018
摘要: MYB转录因子超家族很多基因参与调控生物钟。本文利用RACE技术克隆到一个中间锦鸡儿MYB家族基因
CiMYB177, 其cDNA全长2 028 bp, 可以编码433个氨基酸。序列分析发现CiMYB177属于CCA1 (CIRCADIAN AND
CLOCK ASSOCIATED1)亚家族, 与大豆的GmMYB177一致性最高(70.3%)。用染色体步移技术克隆到该基因起始密码子
上游1 127 bp的启动子序列。用实时荧光定量PCR技术对CiMYB177的转录水平进行分析发现其表达呈节律性的昼夜变化,
并且受干旱、NaCl和冷的诱导。亚细胞定位观察发现CiMYB177定位到细胞核。
关键词: 中间锦鸡儿; 生物钟; 基因克隆; MYB转录因子
环境中的光照、温度和一些其他的条件如湿
度都会以天为周期不断变化。植物生长在这种昼
夜交替的环境中, 进化出了能够适应并且更加有
效地利用环境的生物钟机制。生物钟影响植物的
生长发育中的许多过程, 如: 种子萌发、下胚轴伸
长、叶的运动、抽薹、开花、气孔开闭、对胁迫
的响应等(McClung 2006; Yakir等2007)。
研究发现, 生物钟由三部分组成: 输入通路、
中央振荡器和输出通路(McClung等2002)。输入通
路中, 环境中的光照和温度的变化是调节植物生物
钟的主要信号。光敏色素(phytochromes, phy)家族可
以感受红光和远红光; 向光素(phototrophins)和隐花
色素(cryptochromes)可以感受UV-A和蓝光; 而UVR8
则是UV-B的受体(Chen等2004; Fraikin等2013)。
中央振荡器主要由多个调节相关基因的转录
和翻译的正负反馈环交织在一起组成 (Harmer
2009; McClung等2002)。两个MYB转录因子CCA1
(CIRCADIAN AND CLOCK ASSOCIATED1)和
LHY (LATE ELONGATED HYPOCOTYL)是这些
反馈环中共用的最主要成员(McClung 2006)。其
它成员如: PRR (pseudo-response regulators)家族的
TOC1能够抑制很多节律相关基因(Huang等2012);
LNK1 (night light-inducible and clock-regulated
gene1)和LNK2可以通过直接的蛋白与蛋白的结合
来增强很多与节律相关基因的转录活性(Xie等
2014)。最早发现的一个反馈环是, CCA1和LHY可
以抑制TOC1的表达, 同时TOC1又可以抑制CCA1
和LHY的表达, 这三者构成了一个典型的反馈环
(Alabadi等2001; Gendron等2012)。第二个负反馈
环是由CCA1和LHY及许多早晨阶段表达的基因
PRR7、PRR9构成的(Zeilinger等2006)。另外LNK1
和LNK2通过直接结合CCA1、RVE4和RVE8/LCL5
(LHY-CCA1-LIKE5)来增强它们的转录活性, 从而
调控下游的TOC1和PRR5等基因的表达 ; 同时
TOC1和PRR5又可以抑制LNK1和LNK2的表达
(Rugnone等2013; Xie等2014)。
生物钟的输出通路能够调控植物生长中的几
乎全部过程。基因转录水平的调节是这些调节过
程中重要的调控手段之一(Yakir等2007)。实际上,
不仅是输出通路的基因, 包括中央振荡器中的基
因也有很多是以转录水平为主进行调节的(Harmer
2009)。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有约三分之一
的基因受到生物钟的调控(Covington等2008)。
Covington等(2008)发现在拟南芥中有7类转录因子
家族都有比较多的成员体现出了昼夜节律性的变
化: CO (Constans-like)、MYB超家族(avian myelo-
blastosis virus superfamily)、bZIP (basic leucine
zipper)、MBF1 (multiprotein bridging factor 1)、
BBR-BPC (barley B recombinant-basic pentacyste-
ine 1)、TLP (tubby-like protein)和TCP (teosinte
branched1/cycloidia/PCF)。还有一类转录因子PRR
家族在调控生物钟的过程中起很重要的作用(Farre
和Liu 2013), PRR9、PRR7、PRR5、PRR3和PRR1/
TOC1的表达在转录水平上依次达到顶峰, 它们之
间间隔2到3 h (Makino等2001)。
植物生理学报636
REVEILLE基因是一类MYB相关(MYB-related)
基因, 属于MYB超家族中的CCA1分支, 与CCA1和
LHY属于同一个亚家族(Chen等2006)。拟南芥中
有9个REVEILLE基因(包括RVE7-like), 这些基因中
大多数在转录水平受到生物钟的调控, 表达呈昼夜
节律性的变化(Rawat等2011)。RVE1是一个生物钟
的输出通路中的基因, 能够特异性地在白天促进生
长素的合成, 在夜间却不能(Rawat等2009)。RVE2
的突变或者过表达会导致中央振荡器中部分基因的
表达紊乱, 影响拟南芥的开花、下胚轴的伸长(Zhang
等2007)。RVE7/EPR1 (EARLY-PHYTOCHROME-
RESPONSIVE1)同样是一个生物钟的输出通路中的
基因, 能够影响子叶的展开和花期(Kuno等2003)。
RVE8能够影响中央振荡器中部分基因的表达, 与
PRR5形成一个负反馈环(Hsu等2013; Rawat等
2011)。GmMYB177是大豆(Glycine max)中的一个
REVEILLE基因, Liao等(2008)发现GmMYB177参
与非生物胁迫响应, 可以增强拟南芥对多种非生
物胁迫的抗性。
本研究从中间锦鸡儿中克隆到一个MYB超家
族基因CiMYB177, 序列比对显示其属于REVEIL-
LE基因, 与大豆的GmMYB177一致性最高。荧光
定量PCR检测CiMYB177的表达呈昼夜节律性的变
化, 并且受到光照和非生物胁迫的影响。
材料与方法
1 植物材料及处理方法
中间锦鸡儿(Caragana intemedia Kuang et H.
C. Fu)种子采自于内蒙古自治区乌兰察布市四子
王旗坡底村(北纬41°26′, 东经111°41′)。播种于营
养土和蛭石(1:2)的混合土中, 22°C培养, 光照条件
为16 h光照/8 h黑暗。
选1月苗龄长势一致的植物进行处理。脱
水、NaCl和对照处理: 将苗从土中小心取出、洗
净分别置于滤纸、200 mmol·L-1 NaCl和蒸馏水中
处理。冷处理: 将生长在钵子中的苗连同钵子置
于4°C培养箱中处理。取样时间为0、1、3、8、
12和24 h。所有处理均从上午9 h左右开始处理。
每个时间点取3株苗的地上部分(茎和叶), 液氮速
冻, 保存于–80°C冰箱备用。
检测光周期响应: 将生长20 d的植物从植物
房转移到12 h光照/12 h黑暗的培养箱适应培养7
d, 开始处理, 正常光照(LD)的植物不做任何改变,
从进入黑暗时开始, 每隔3 h取样一直到84 h。对
于连续黑暗(DD), 植物在第2个白天开始处于一
直黑暗中。对于连续光照, 植物从第1个白天过后
一直处于光照条件下; 对于由黑暗变为正常条件
(DD到LD), 植物在适应培养阶段即处于连续黑暗
状态, 7 d后转入正常培养。以上处理均为每隔3
h取样。
2 RNA提取与real-time PCR
利用TRIzol法提取中间锦鸡儿总RNA。10 μg
总RNA去除DNA后(Ambion Cat# AM2224), 取
1 000 ng进行反转录(TaKaRa, Cat# D2640A)。反转
录产物稀释16倍后, 取5 μL作为模板进行real-time
PCR反应(TaKaRa, Cat# DRR041A)。反应程序:
95°C预变性1 min; 95°C变性5 s, 60°C退火30 s,
72°C延伸15 s, 40个循环。内参基因用柠条锦鸡儿
EF1a基因(Yang等2014)。用Primer 5.0设计引物,
具体步骤见试剂说明书。
3 基因克隆
CiMYB177的EST序列来自中间锦鸡儿转录组数
据库(Zhu等2013)。用Primer 5.0设计引物, 用RACE
技术克隆得到全长, 具体步骤见说明书(TaKaRa,
Cat#6107和Cat#6106)。全长引物为MYB177-5-Nco
和MYB177-3-Bgl, 选用的高保真酶为PrimeSTAR
(TaKaRa, Cat#DR010S)。扩增全长程序如下: 98°C
预变性2 min; 98°C变性10 s, 60°C退火15 s, 72°C延
伸1.5 min, 35个循环; 72°C补充延伸5 min。在生工
生物工程(上海)股份有限公司测序。
用染色体步移试剂盒克隆得到CiMYB177的启
动子(TaKaRa, Cat#6108)。第1步延伸用在CiMYB177
的cDNA内设计的引物P1、P2和P3与试剂盒提供
的通用引物进行三轮的巢式PCR, 回收第三轮的产
物连接到pMD19 (TaKaRa, Cat#D104A)质粒测序。
测序结果与CiMYB177的cDNA拼接无误后进行下
一步的延伸。以拼接结果序列设计第2步引物P4、
P5和P6, 与试剂盒提供的通用引物进行3轮的巢式
PCR, 同样回收第3轮产物, 拼接测序结果。完成2
步延伸后, 以拼接结果设计扩增启动子引物MYB177-
5-Pst和MYB177-3-Nco来验证拼接结果。扩增启
动子程序: 98°C预变性2 min; 98°C变性10 s, 60°C
退火15 s, 72°C延伸1.5 min, 35个循环; 72°C补充延
伸5 min。本实验所用的全部引物见表1。
韩晓敏等: 中间锦鸡儿CiMYB177的克隆及表达分析 637
表1 本实验用到的引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 引物用途 引物序列(5→3)
q-MYB177-5 荧光定量检测 ATCCATTAGTGCTGCCCATACC
q-MYB177-3 荧光定量检测 TCATCTGCTGCATCGTCTTCG
MYB177-5-in 5 RACE CCAGTTGGGGTATCGGAAT
MYB177-5-out 5 RACE CGATGGAGAAGAAGGTTTGC
MYB177-3-in 3 RACE GAGCCCAAATCATCACCTG
MYB177-3-out 3 RACE TTCGTCCGATTCCGATACC
MYB177-5-Nco 扩增基因全长 gcccatggCTATGGCGATTCAAGGTCAAAATG
MYB177-3-Bgl 扩增基因全长 gcagatctAAGGAAAGCCTGATACGTTGCTCT
MYB177-P1 染色体步移 CGTTTCCGCACGAAAACTGATC
MYB177-P2 染色体步移 GGATGAGTTGGCTTTCGTTTTG
MYB177-P3 染色体步移 GGACAAACTTCCAGTTGGGGTAT
MYB177-P4 染色体步移 CACTAGAATGCTAGATGCCAGAATCC
MYB177-P5 染色体步移 CTCTGTGGTTGGCTGTTACTTCCT
MYB177-P6 染色体步移 TACTTGAATCGCCATGGAAGCAG
MYB177-5-Pst 扩增启动子 gcctgcagCCTAGTTAATTGTATCTGAGTCACT
MYB177-3-Nco 扩增启动子 cccatggCCAATCCAAATAGCAAATAAAT
4 序列分析
用Vector NTI10.0 拼接得到的序列结果。其他
物种基因序列来自于NCBI数据库(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/)。用Primer 5.0翻译核酸序列。用
MEGA 5.0构建系统进化树, 采用Neihbor-joining
(NJ)算法, Bootstrap 值设为1 000。启动子分析网址:
http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html。
5 亚细胞定位分析
将CiMYB177的编码区用引物MYB177-5-Nco
和引物MYB177-3-Bgl扩增后, 连接到pEASY-Blunt
(TransGen, Cat#CB111-02)质粒, 测序无误后用双
酶切法插入到pCAMBIA1302的NcoI与BglII之间,
把构建好的融合表达载体用浸花法转入拟南芥野
生型, 用含有13 mg·L-1潮霉素的1/2MS培养基筛选
植物。得到T2代植物后用荧光显微镜(Zeiss Axio
imager A1)观察幼苗的根。
实验结果
1 中间锦鸡儿CiMYB177的全长cDNA克隆
为了得到CiMYB177基因全长, 经过两轮的巢
式PCR, 得到的RACE结果如图1。5 RACE产物为
923 bp, 3 RACE产物为982 bp。为了验证由RACE
得到的拼接结果的正确性, 用全长引物扩增编码
区部分(图1), 测序结果与拼接后预测的序列一
致。CiMYB177的cDNA全长为2 028 bp, 其中开放
阅读框1 302 bp (包括终止密码子), 可以编码一个
433个氨基酸的蛋白, 5 UTR长410 bp, 3 UTR长316
bp (图2)。
图1 CiMYB177克隆电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of CiMYB177
1: 5 RACE电泳结果; 2: 3 RACE电泳结果; 3: CiMYB177的编码区克隆电泳结果。M1: DL2000 marker; M2和M3: GeneRulerTM 1 kb
DNA Ladder。
植物生理学报638
2 中间锦鸡儿CiMYB177的序列分析
用CiMYB177的氨基酸序列在NCBI数据库中比
对发现: 该蛋白与已经报道过的大豆的GmMYB177
(Liao等2008)的一致性最高, 达到70.3%; 与拟南芥
RVE1和RVE2的一致性分别达到35.8%和31.8%。
利用MEGA 5.0构建了系统进化树(图3), 发现CiM-
YB177属于MYB超家族中的CCA1分支, 在拟南芥
中与REVEILLE这类基因最近。推测CiMYB177
可能在昼夜节律中起一定作用。
3 中间锦鸡儿CiMYB177对昼夜节律和光的响应
为了研究CiMYB177的表达是否像拟南芥的
REVEILLE基因一样对昼夜变化有响应, 用实时荧
图2 CiMYB177 cDNA及氨基酸序列
Fig.2 The cDNA and amino acid sequences of CiMYB177
*表示终止密码子; 小写字母区域为UTR区域。
韩晓敏等: 中间锦鸡儿CiMYB177的克隆及表达分析 639
光定量PCR检测了CiMYB177在正常光照、连续黑
暗、连续光照及由连续黑暗变成正常光照条件下
的表达情况。结果(图4)发现, CiMYB177在正常光
照条件下表达呈周期变化, 在白天正午表达量最低,
在夜晚表达量最高, 达到300多倍的变化。在连续
黑暗条件下, CiMYB177的表达仍然可以维持36 h,
之后变得紊乱; 在连续光照条件下, 24 h内可以看到
一定的周期变化, 之后变得紊乱。当植物由连续黑
暗变成正常光照后, CiMYB177的表达逐渐从紊乱变
成有规律的周期变化。另外, 从图4中可以看出, 光
对CiMYB177的表达有较为明显的抑制作用。
4 中间锦鸡儿CiMYB177对胁迫的响应
用荧光定量PCR检测了CiMYB177在不同胁
迫处理下的表达情况。结果(图5)表明, CiMYB177
的表达量在对照条件下12 h有20多倍的提高, 此时
植物处于黑暗状态, 表达量上升, 这与前面的结果
一致(图4)。CiMYB177主要受脱水、NaCl和冷的
诱导, 转录水平最高可以达到近100倍的变化, 基
本都在处理3 h以后表达量开始上升。
5 中间锦鸡儿CiMYB177启动子的克隆及分析
CiMYB177的表达既受昼夜节律和光的调控,
又受非生物胁迫的诱导, 这表明CiMYB177基因启
动子上可能具有相应的调控元件。采用染色体步
移的方法经过两步延伸得到CiMYB177的启动子的
拼接序列, 再根据拼接序列设计引物, 将启动子克
隆重新测序, 确认拼接序列无误(图6)。最终得到
起始密码子上游1 127 bp的启动子序列。启动子分
析网站上分析后, 发现在启动子中包含许多与光、
周期及胁迫有关的顺式作用元件(表2)。
6 中间锦鸡儿CiMYB177的亚细胞定位
构建CiMYB177编码区与GFP的融合表达载体,
与GFP空载体分别转化拟南芥野生型。用荧光显
微镜观察生长了10 d的T2代转基因植物的根, 发现
空载体的荧光在细胞中分布广泛, 而转化CiMYB177-
GFP融合表达载体的根中只有细胞核可以观察到荧
光信号(图7), 表明CiMYB177是定位到细胞核的。
讨　　论
MYB转录因子超家族是植物中最大的家族之
一, 拟南芥中有198个成员, 其中有64个属于MYB
相关(MYB-related)基因(Chen等2006)。本研究克
隆到一个MYB相关基因CiMYB177, 属于CCA1分
支, 与拟南芥中的RVE1和RVE2一致性最高, 分别
达到35.8%和31.8% (图3)。从一致性的角度, 可能
CiMYB177更接近于RVE1。Rawat等(2009)研究表
明RVE1虽然不能改变中央振荡器中的关键基因
CCA1和LHY的表达, 但是可以通过调控生长素来
调控植物的生长, 而且这种调控关系只在白天发
生, 在夜晚是不起作用的。Zhang等(2007)对RVE2
(circadian 1, CIR1)的研究表明, RVE2的突变或者
过表达会导致中央振荡器中基因的表达紊乱, 并且
能够改变植物的开花、下胚轴的伸长和种子在黑
暗中的萌发。我们检测了CiMYB177对昼夜变化和
光的响应(图4), 从节律性表达方式来看, CiMYB177
图3 CiMYB177与拟南芥和大豆相关蛋白的系统进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequence of CiMYB177 with related proteins from Arabidopsis and G. max
植物生理学报640
与RVE2更接近, 在白天正午时表达最低, 在接近午
夜时表达量最高, 而RVE1是在黎明时表达量最
高。但是在连续光照或者连续黑暗时, RVE2仍然
可以维持节律性的变化, 而CiMYB177的这种节律
性的表达变化会逐渐消失, 仅仅能维持1 d左右
(Rawat等2009; Zhang等2007)。这可能预示着
CiMYB177并不是一个中央振荡器中的基因, 而是
像RVE1一样属于在输出通路中的基因。
CiMYB177与大豆中的GmMYB177相似度最
高。Liao等(2008)发现GmMYB177受到干旱、NaCl
和冷的诱导, 并且能够改变拟南芥对ABA的敏感
性以及对冷和NaCl的耐受性。本研究结果显示
CiMYB177受干旱、NaCl和冷的诱导(图5), 这与Gm-
MYB177相同。然而我们的这些处理都是从上午9 h
左右开始处理, CiMYB177的这种受到胁迫诱导表达
情况与节律性的变化之间有什么关系, 是否这种受
胁迫的诱导在夜间会比在白天更容易, 还需要进一
步研究。启动子分析结果表明CiMYB177的启动子
上有许多与光、周期和胁迫相关的顺式作用元件
(表2), 这解释了为什么CiMYB177既受周期调控,
图4 受昼夜节律和光调控的CiMYB177基因表达
Fig.4 Expression of CiMYB177 gene regulated by circadian and light
横轴下方的黑色和白色条框分别表示植物处于黑暗或者光照中。本实验有2次生物学重复, 得到的结果类似。每个数据有2个技术重复。
韩晓敏等: 中间锦鸡儿CiMYB177的克隆及表达分析 641
也受胁迫诱导。为什么在CiMYB177的启动子上都
是光诱导元件, 而CiMYB177却是光抑制的, 这可
能与结合到这些顺式作用元件上的蛋白有关, 可
能这些蛋白结合的元件相同, 但发挥的功能却是
相反的。
植物对胁迫的耐受性本身也受周期调控。温
度是一种昼夜节律的输入信号, 所以昼夜节律可
以调控植物对极端温度的适应性也就可以理解
了。CBF (C-repeat binding factor)作为植物响应冷
胁迫过程中的一个关键基因, 其在转录水平是受
到生物钟调控的(Eriksson和Webb 2011)。CCA1作为
昼夜节律中央振荡器中的关键基因, 改变了CBFs和
其下游的冷胁迫基因COR15A、COR47和 COR78,
并且增强了植物对冷的耐受性(Dong等2011)。在其
它胁迫方面, CCA1调控拟南芥对氧化胁迫的耐受性
和ROS (reactive oxygen species)相关基因的表达(Lai
图6 CiMYB177启动子克隆电泳图
Fig.6 Agrose gel electrophoresis analysis of the CiMYB177 promoter
1、2和3: 分别是染色体步移时第一步延伸的AP2引物与设计引物P1、P2和P3进行的三轮巢式PCR产物; 4、5和6: 分别是染色体步移
时第二步延伸的AP1引物与设计引物P4、P5和P6进行的三轮巢式PCR产物; 7: 扩增CiMYB177启动子PCR产物; M1: GeneRulerTM 1 kb DNA
Ladder; M2和M3: DL5000 marker。
图5 CiMYB177基因对不同处理的响应
Fig.5 Responses of CiMYB177 gene to varies treatments
本实验有2次的生物学重复, 得到的结果类似。每个数据有3个技术重复。
植物生理学报642
表2 CiMYB177启动子中的顺式作用元件
Table 2 Cis-elements in the promoter of CiMYB177
类型 顺式作用元件名称 物种 序列 作用
与光或周期调 -10PEHVPSBD 大麦(Hordeum vulgare) TATTCT 光周期调控
控有关 CCA1ATLHCB1 拟南芥(Arabidopsis thaliana) AAMAATCT CCA1结合位点
CIACADIANLELHC 番茄(Lycopersicones culentum) CAANNNNATC 周期调控有关
GATABOX 拟南芥(Arabidopsis thaliana) GATA 光诱导相关
GT1CONSENSUS 拟南芥(Arabidopsis thaliana) GRWAAW 光诱导相关
IBOXCORE 大部分被子植物 GATAA 光诱导相关
SORLIP1AT 拟南芥(Arabidopsis thaliana) GCCAC 在光诱导基因启动子中富集
SORLIP3AT 拟南芥(Arabidopsis thaliana) CTCAAGTGA 在光诱导基因启动子中富集
胁迫及其他 CBFHV 大麦(Hordeum vulgare) RYCGAC CBF1、CBF2结合位点
CCAATBOX1 大豆(Glycine max) CCAAT 与热有关
DRECRTCOREAT 水稻(Oryza sativa), 玉米(Zea mays) RCCGAC DRE/CRT的核心序列
WBOXNTERF3 烟草(Nicotiana tabacum) TGACY 诱导ERF3基因表达
LTRE1HVBLT49 大麦(Hordeum vulgare) CCGAAA 低温相关
LTRECOREATCOR15 拟南芥(Arabidopsis thaliana) CCGAC 低温和干旱相关
MYCCONSENSUSAT 拟南芥(Arabidopsis thaliana) CANNTG rd22和CBF3启动子上的MYC
识别位点
MYBCORE 拟南芥(Arabidopsis thaliana) CNGTTR MYB1、MYB2结合位点
MYBPLANT 拟南芥(Arabidopsis thaliana) MACCWAMC 苯丙烷途径、木质素合成相关
等2012)。Habte等以大麦(Hordeum vulgare)为材
料发现, 渗透胁迫可以作为昼夜节律的输入信号
(Habte等2014)。本研究表明CiMYB177可能同时在
昼夜节律和响应非生物胁迫方面具有调控作用。
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图7 CiMYB177亚细胞定位观察
Fig.7 Subcellular localization of CiMYB177
韩晓敏等: 中间锦鸡儿CiMYB177的克隆及表达分析 643
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植物生理学报644
Cloning and expression analysis of CiMYB177 from Caragana intermedia
HAN Xiao-Min, XING Dan-Dan,YANG Qi, LI Guo-Jing, WANG Rui-Gang*
College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
Abstract: Many MYB transcription factors play a role in the circadian clock. In this study, a MYB-related gene
CiMYB177 from Caragana intermedia was cloned by RACE, the cDNA sequence was 2 028 bp which encoded
433 amino acids. Sequence analysis showed that CiMYB177 was classified to the CCA1 (CIRCADIAN AND
CLOCK ASSOCIATED1) subfamily, and had the highest identity (about 70.3%) with GmMYB177 from Gly-
cine max. Genome walking was used to obtain the 1 127 bp CiMYB177 promoter sequence. The transcriptional
expression of CiMYB177 changed diurnally and induced by drought, NaCl and cold. Subcelluar localization re-
vealed that CiMYB177 localized in the nuclei.
Key words: Caragana intermedia; circadian clock; gene cloning; MYB transcription factor
Received 2015-11-17 Accepted 2016-03-28
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31360056, 31360169) and Inner Mongolia Science &
Technology Plan-Innovation Team (2015).
*Corresponding author (E-mail: wangruigang@imau.edu.cn).