全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (6): 586~590586
收稿 2013-03-18　　修定 2013-04-24
资助 作物生物学国家重点实验室开放课题(2011KF07)和江苏
省自然科学基金青年基金项目(BK2012073)。
* 同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: zfibcas@163.com)。
高盐和高温胁迫下外源脯氨酸对PSII颗粒的保护作用
邱念伟1,*, 杨翠翠1,*, 付文诚1, 胡胜1, 周峰2,**
1曲阜师范大学生命科学学院, 山东曲阜273165; 2南京晓庄学院生物化工与环境工程学院, 南京211171
摘要: 为研究脯氨酸在植物耐盐性和耐热性中的作用, 提取菠菜叶片的PSII颗粒, 进行高盐(100~800 mmol·L-1 NaCl)、高温
(30和40 ℃)以及盐和热交叉胁迫处理。PSII最大光化学效率(Fv/Fm)的测定结果表明, 0
℃下, 高盐胁迫处理对PSII颗粒伤害
较小; 无盐胁迫下, 30 ℃处理对PSII伤害不明显, 40 ℃高温处理则显著降低PSII活性; 盐和热交叉胁迫加剧了对PSII的伤
害。在PSII颗粒的保存液中加入脯氨酸(100~800 mmol·L-1)能显著提高PSII在高盐胁迫以及盐和热交叉胁迫下的活性, 但未
能提高其在高温胁迫下的活性。这一结果为脯氨酸提高植物耐盐性及对盐和热交叉胁迫抗性方面的功能研究提供了直接
证据。
关键词: 脯氨酸; 光系统II; 高盐胁迫; 高温胁迫; PSII最大光化学效率
Protective Effect of Exogenous Proline on PSII Particles under High Salinity
and High Temperature Stresses
QIU Nian-Wei1,*, YANG Cui-Cui1,*, FU Wen-Cheng1, HU Sheng1, ZHOU Feng2,**
1College of Life Sciences, Qufu Normal University, Qufu, Shandong 273165, China; 2School of Biochemical and Environmental
Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China
Abstract: To explore the role of proline in salt tolerance and heat tolerance of plants, photosystem II (PSII)
BBY particles prepared from spinach (Spinacia oleracea) leaves were treated with different concentrations of
NaCl (100–800 mmol·L-1), different temperatures (30 and 40 ℃) and cross treatments of NaCl and high temper-
ature. Then maximal efficiency of PSII photochemistry (Fv/Fm) was determined by plant efficiency analyser
(PEA). The results showed that single salt-treatment caused slight damage to PSII at 0 ℃, and 30 ℃ treatment
almost had no damage to PSII under 0 mmol·L-1 NaCl condition, but PSII activity (Fv/Fm) decreased markedly
at 40 ℃. While under cross treatments of salt and high temperature, PSII activity decreased more significantly
than under the single stress. Addition of 100–800 mmol·L-1 proline in store buffer could greatly increase the ac-
tivity of PSII under salt stress and cross stress of salt and high temperature, but could not increase the activity
of PSII under high temperature stress. These results above provide direct evidence that accumulation of proline
can enhance salt tolerance and cross-tolerance to salt and high temperature in plants.
Key words: proline; photosystem II; high salinity stress; high temperature stress; maximal efficiency of PSII
photochemistry
脯氨酸(proline)是植物体内重要的渗透保护
物质之一, 凡是引起细胞脱水的胁迫如干旱、高
温、盐渍、低温、冰冻、强光、重金属、营养不
良、病害等均会造成脯氨酸的积累, 尤其是水分
胁迫和盐胁迫时脯氨酸的含量可以增加数十倍甚
至上百倍(全先庆等2007; Verbruggen和Hermans
2008)。大部分文献认为脯氨酸在胁迫下不仅可以
调节细胞的渗透平衡, 还具有维持蛋白质、生物
膜和亚细胞结构稳定, 调节细胞pH值以及清除活
性氧等作用(Kavi Kishor等2005; Trovato等2008;
Szabados和Savoure 2010; Hayat等2012), 脯氨酸累
积量与植物的抗逆能力呈正相关(赵勇等2005;
Misra和Gupta 2005; Hayat等2012)。但也有不少文
献对脯氨酸的抗逆功能提出异议, 认为虽然脯氨
酸的合成过程对各类胁迫极为敏感, 但脯氨酸的
累积浓度往往不足以起到渗透调节的作用, 逆境
条件下脯氨酸大量合成的意义主要在于维持细胞
的代谢平衡(Hare和Cress 1997), 满足细胞内的能
量需求和NAD(P)/NAD(P)H比的稳定。因此, 脯氨
邱念伟等: 高盐和高温胁迫下外源脯氨酸对PSII颗粒的保护作用 587
酸可看作是植物抵御逆境伤害过程中的氮代谢产
物(Hare和Cress 1997; Hare等1998)。Song等(2005)
则发现脯氨酸的积累量以及脯氨酸合成酶活性与
小麦幼苗的耐盐性、耐热性及盐热交叉抗性均无
相关性, 可把脯氨酸的积累看作是植物受到胁迫
伤害或者抵御逆境的表征。如在盐胁迫下, 两种
烟草脯氨酸的积累量反而与其耐盐性相反(Celik
和Atak 2012)。
分子生物学实验结果显示, 外源喷施或者通
过基因工程措施提高植物细胞内脯氨酸含量仅能
微幅提高植物的耐逆性(Hare等1998)。大量积累
脯氨酸的拟南芥突变体甚至对盐胁迫更敏感(Liu
和Zhu 1997), Lv等(2011)也发现大量积累脯氨酸的
转基因拟南芥对热胁迫更敏感。因此, 脯氨酸在
植物抗逆性中的作用还不明确。目前, 关于脯氨
酸在逆境中保护蛋白质、生物膜及亚细胞结构的
功能研究多是间接观察, 缺乏直接的生物化学证
据。本文用对各种逆境均非常敏感的菠菜PSII颗
粒为实验材料, 离体分析了高盐和高温胁迫对光
系统II (photosystem II, PSII)颗粒的伤害以及脯氨
酸存在条件下对PSII颗粒的保护作用, 为分析脯氨
酸在植物抗逆性中的作用提供参考。
材料与方法
1 PSII颗粒的提取
选取健康的菠菜(Spinacia oleracea L.)成熟叶
片, 用双蒸水漂洗, 于4 ℃下暗适应2 h以上, 然后参
照Yamamoto等人(2011)的方法提取PSII颗粒, 提取
过程中实验材料均保存在黑暗(小于2 μmol·m-2·s-1)
和 0 ~ 4 ℃下。提取的P S I I颗粒用保存液 [ 2 0
mmol·L-1 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH 6.5)、400
mmol·L-1蔗糖、35 mmol·L-1 NaCl]匀浆, 并将叶绿素
浓度调至3.0 mg·mL-1, 分装后用液氮速冻, 置–70 ℃
超低温冰箱中保存备用。叶绿素浓度的测定参照
张其德(1985)的方法。
2 PSII颗粒的盐处理和高温处理
取上述超低温冰箱保存的菠菜PSII颗粒1 mL,
50 000×g离心5 min, 沉淀PSII颗粒, 然后分别用3
mL含有不同浓度脯氨酸和NaCl的保存液[含20
mmol·L-1 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH 6.5)]悬浮, 保存
液中NaCl和脯氨酸浓度梯度均为0、100、200、
400、800 mmol·L-1 (交叉组合配制成各种保存液)。
悬浮后PSII颗粒的叶绿素浓度均在1.0 mg·mL-1左
右。将各种保存液悬浮的PSII颗粒迅速放入0、
30、40 ℃的水浴中保温30 min。实验材料均在暗处
或微弱绿光(小于2 μmol·m-2·s-1)和0~4 ℃下。
3 PSII的活性测定
用植物效率分析仪(Plant Efficiency Analyser,
Handy PEA; Hansatech Instrument Ltd., UK)测定
PSII最大光化学效率(maximal efficiency of PSII
photochemistry, Fv/Fm), 表示PSII的活性。测定光
源为3个发光二极管产生的650 nm的红光, 光强设
定为3 000 μmol·m-2·s-1, 荧光信号的记录时程为2 s。
迅速取出上述各处理保温后的样品, 倒入液体测定
管中, 暗中室温测定PSII活性, 每个处理5次重复。
实验结果
1 高盐和高温胁迫对PSII活性的影响
用含有不同浓度NaCl但不含脯氨酸等渗透保
护物质的保存液悬浮菠菜PSII颗粒, 在0、30、40 ℃
下保温30 min, 然后快速测定PSII的Fv/Fm。结果显
示, 在0 ℃下, 100~800 mmol·L-1 NaCl对PSII颗粒的
伤害较轻 , 与不含NaCl的保存液相比(Fv/Fm为
0.805), 100和200 mmol·L-1 NaCl处理对PSII活性的
影响不显著(P>0.05), Fv/Fm分别为0.798和0.791;
400和800 mmol·L-1 NaCl处理对PSII活性产生显著
影响(P<0.05), 分别使PSII的Fv/Fm下降到0.788和
0.753。用无NaCl和脯氨酸的保存液悬浮的PSII颗
粒, 在30 ℃下的活性与0 ℃下的相比差异不显著
(P>0.05); 40 ℃高温处理30 min则导致PSII活性显
著下降, Fv/Fm下降为0.677, 说明离体的PSII颗粒对
40 ℃高温非常敏感(图1)。
高盐和高温胁迫同时存在会加剧对PSII颗粒
的伤害, 伤害程度超过了两种胁迫单独存在时的
总和。以0 ℃下0 mmol·L-1 NaCl处理为对照, 0 ℃下
800 mmol·L-1 NaCl处理使PSII的Fv/Fm下降6.5%, 40
℃
下0 mmol·L-1 NaCl处理使PSII的Fv/Fm下降了
15.9%, 而40 ℃下800 mmol·L-1 NaCl处理使PSII的
Fv/Fm下降了76.5% (图1)。这说明高盐和高温两种
胁迫同时存在对PSII的伤害具有增倍效应。
2 高温胁迫下外源脯氨酸对PSII活性的影响
图2显示, 无盐条件下, 与不加脯氨酸的对照
相比, 添加不同浓度脯氨酸能轻微增大PSII的光化
学活性, 但统计结果差异不显著(P<0.05)。如在0
植物生理学报588
和30 ℃处理下, 添加100~800 mmol·L-1脯氨酸可使
PSII的Fv/Fm从0.805增加到0.818, 但脯氨酸浓度高
于200 mmol·L-1后, Fv/Fm几乎不再增加。40
℃高温
下, 不同浓度的脯氨酸也均未表现出对PSII颗粒的
保护效应。由此推测, 脯氨酸并不能提高PSII的耐
热性。
3 高盐胁迫下外源脯氨酸对PSII活性的影响
由图1可见, 在0 ℃和无脯氨酸等渗透保护物
质条件下, 只有高浓度NaCl (400、800 mmol·L-1)显著
抑制PSII最大光化学活性。因此, 图3只分析了在
400和800 mmol·L-1 NaCl条件下脯氨酸对PSII的保
护作用。结果显示, 在保存液中添加100~800 mmol·L-1
的脯氨酸能显著增加PSII的耐盐性(P<0.05)。当保
存液中无脯氨酸时, 400和800 mmol·L-1 NaCl处理
后PSII颗粒的Fv/Fm分别下降到0.788和0.753; 添加
800 mmol·L-1脯氨酸, Fv/Fm分别增加到0.812和
0.794。这说明脯氨酸在高盐胁迫下对PSII具有显
著的保护作用。
4 高温和高盐交叉胁迫下外源脯氨酸对PSII活性
的影响
虽然高盐和高温交叉处理加重了对PSII的伤
害, 但在保存液中添加脯氨酸后对PSII颗粒的保护
效果更为显著。如当保存液中不含脯氨酸时, 40 ℃
下用400和800 mmol·L-1 NaCl处理30 min, PSII的
Fv/Fm分别下降至0.367和0.179; 加入800 mmol·L
-1
脯氨酸使Fv/Fm值分别增加到0.442和0.391, 分别增
加17.5%和118.3% (图4), 在盐热交叉胁迫下PSII活
性显著提高, 但未恢复到对照水平。
讨　　论
活体植物中的PSII对环境胁迫的敏感性表现
不同。如玉米叶片的PSII对盐胁迫敏感(Sheng等
2008), 西红柿叶片的PSII对热胁迫敏感(Willits和
Peet 2001); 而盐生植物碱蓬的PSII在400 mmol·L-1
NaCl盐胁迫下仍保持稳定活性(Lu等2003); 在42 ℃
图1 NaCl与高温处理对PSII活性的影响
Fig.1 The effect of NaCl and high temperature on PSII activity
图中数据为5个重复的平均值±标准差; 不同处理间数据的
差异显著性用Duncan检验进行分析, 标有不同小写字母表示达到
P<0.05显著水平。图2~4同此。
图2 高温胁迫下外源脯氨酸对PSII活性
的影响(0 mmol·L-1 NaCl)
Fig.2 The effect of exogenous proline on PSII activity under
high temperature stress (0 mmol·L-1 NaCl)
图3 高盐胁迫下外源脯氨酸对PSII活性的影响(0 ℃)
Fig.3 The effect of exogenous proline on PSII activity
under high salinity stress (0 ℃)
邱念伟等: 高盐和高温胁迫下外源脯氨酸对PSII颗粒的保护作用 589
高温下, 高粱的PSII最大光化学活性仍不受影响
(Havaux 1992)。但离体PSII对盐胁迫和热胁迫均
比较敏感(Srivastava等1997; 王戈博等2005)。本文
结果也表明, 盐胁迫和高温胁迫均对离体PSII颗粒
产生明显伤害(图1)。说明碱蓬和高粱在盐胁迫和
热胁迫下启动了PSII保护机制。脯氨酸是否增加
PSII的耐盐性和耐热性还缺乏直接的证据。关于
脯氨酸的抗逆功能研究也多从体外喷施和内源含
量与植物耐逆性的关系角度进行分析, 由于活体植
物的抗逆性或者代谢活性受多因素影响, 因此很难
准确判断植物的抗逆性与脯氨酸具有直接关系。
本研究中, 在PSII颗粒的保存液中加入不同浓
度的脯氨酸, 然后进行高盐和高温处理, 可直接分
析脯氨酸对PSII颗粒的保护作用。结果表明 ,
100~800 mmol·L-1的脯氨酸能显著增加PSII的耐盐
性(图3), 但并未显著增加PSII的耐热性(图2)。这
一结果与喷施脯氨酸增加活体植物PSII耐热性的
研究结果相反(刘书仁等2010), 说明活体植物内存
在着其他抗高温机制, 如Pospisil和Dau (2000)用离
体实验证明甜菜碱和蔗糖可以增加PSII耐热性。
不过, 在高盐和高温双重胁迫下, 脯氨酸对PSII的
保护效果极为显著, 并且脯氨酸浓度越高, 保护效
果越好(图4)。活体植物对盐和热胁迫的交叉适应
现象也较为普遍, 如盐生植物碱蓬和滨藜在高盐
处理后PSII的耐热性增强(Qiu和Lu 2003; Lu等
2003), 干旱预处理也可提高高粱PSII的耐热性(Ha-
vaux 1992)。由于干旱、盐渍和高温等胁迫下, 脯
氨酸积累是植物的普遍反应(全先庆等2007; Ver-
bruggen和Hermans 2008), 所以脯氨酸可能参与了
植物对高盐和高温胁迫的耐性。脯氨酸在水溶液
中对蛋白质的保护机制是与蛋白质结合, 在蛋白
质周围形成水化层, 增强蛋白质的水合作用, 增加
蛋白质的可溶性和减少水溶性蛋白质的沉淀, 从
而保护蛋白质等生物大分子的稳定(Szabados和Sa-
voure 2010; Hayat等2012)。这一保护机制可以减
少蛋白质与高浓度Na+离子的接触, 但无法阻止蛋
白质与高温的接触。这很可能是脯氨酸能够显著
增加PSII在高盐胁迫下的活性, 而不能提高其对高
温耐受能力的重要原因。
自然环境复杂多变, 植物经常同时面临多种
环境胁迫, 如在炎热干旱的夏季, 植物会同时受到
干旱、高温和强光的多重胁迫, 提高作物对多重
胁迫的抗性具有重要意义。本文结果表明, 脯氨
酸虽然未能显著提高PSII对高温胁迫的抗性, 但显
著提高了PSII的耐盐性, 在盐和热双重胁迫下对
PSII的保护效果尤为突出。这一结果为研究脯氨
酸在植物抗逆中的功能提供了直接证据。但由于
本研究中所用的盐浓度和脯氨酸浓度均高于植物
组织中的实际浓度, 脯氨酸在活体细胞中的抗逆
功能尚需进一步验证。
参考文献
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图4 高盐(400和800 mmol·L-1 NaCl)和高温(40 ℃)
交叉胁迫下外源脯氨酸对PSII活性的影响
Fig.4 The effect of exogenous proline on PSII activity under
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