全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 781
收稿 2009-04-29 修定 　2009-06-17
资助 国家自然科学基金(30 6 60 0 1 3)。
* 通讯作者(E-mail: gongming63@163.com; Tel: 0871-
5 5 1 6 5 1 6 )。
一氧化氮对玉米幼苗体内脯氨酸积累及其代谢途径的影响
杨双龙 1,2,3, 龚明 2,3,*
1中国农业大学水利与土木工程学院, 北京 100083; 2云南师范大学生命科学学院, 昆明 650092; 3教育部生物能源持续开发
利用工程研究中心, 昆明 650092
提要: NO供体硝普钠(SNP)可显著提高玉米幼苗体内脯氨酸含量和脯氨酸合成途径中关键酶鸟氨酸转氨酶(OAT)的活性,
而降低降解途径中关键酶脯氨酸脱氢酶(ProDH)的活性, 作为NO淬灭剂的c-PTIO, 其作用则相反。但不论是SNP或c-PTIO
对玉米幼苗中Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性的影响均不显著。表明NO诱导的脯氨酸积累可能是NO激活了脯氨酸
合成中的鸟氨酸途径、同时抑制了脯氨酸降解途径的综合结果。
关键词: 一氧化氮; 玉米幼苗; 脯氨酸; 代谢途径
Effects of Nitric Oxide on Proline Accumulation and Metabolic Pathways in
Maize (Zea mays L.) Seedlings
YANG Shuang-Long1,2,3, GONG Ming2,3,*
1College of Water Conservancy & Civil Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2College of Life
Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China; 3Engineering Research Center of Sustainable Development and
Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education, Kunming 650092, China
Abstract: Treatment with the NO donor sodium nitroprusside (SNP) could lead to a significant accumulation of
proline, a rapid increase of the activity of the key enzyme ornithine-δ-aminotransferase (OAT) of proline biosynthesis,
and a decrease of the activity of the key enzyme proline dehydrogenase (ProDH) of proline degradation in maize
(Zea mays) seedlings. Whereas treatment with the NO scavenger 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (c-PTIO) exhibited contrary results to the SNP treatment. In addition,
both SNP and c-PTIO treatments had little effect on Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) activity.
These results showed that the NO-induced proline accumulation in the maize seedlings might be a combined
result of the activation of ornithine pathways of proline biosynthesis and inhibition of proline degradation pathway.
Key words: nitric oxide; maize seedlings; proline; metabolic pathways
干旱、高温、高盐、冰冻、氧化胁迫等均
会引起植物体内脯氨酸积累(Tr ova t o等 20 08 ;
Takagi 2008)。脯氨酸是植物体内的渗透调节物质,
除渗透调节作用以外, 还有保护蛋白质、生物膜、
亚细胞结构以及清除活性氧等功能(Kishor等2005;
Ashraf和Foolad 2007)。已知植物中脯氨酸合成有
谷氨酸途径和鸟氨酸两条途径, 两者的区别在于初
始底物的不同, 分别为谷氨酸(Glu)和鸟氨酸(Orn)。
Δ1-吡咯啉 -5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxy-
late synthetase, P5CS)是谷氨酸合成途径中的限速
和调节酶, 而调节鸟氨酸途径的核心关键酶是鸟氨
酸转氨酶(ornithine-δ-aminotransferase, OAT) (Kishor
等 2005; Trovato等 2008)。脯氨酸降解由两个连
续的线粒体酶催化, 即脯氨酸脱氢酶( p r o l i n e
dehydrogenase, ProDH)和 Δ1-吡咯啉 -5-羧酸脱氢
酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase,
P5CDH), 已有研究表明, ProDH是脯氨酸降解的限
速酶(Sanchez等 2001; Kishor等 2005)。虽然脯氨
酸积累在植物适应逆境胁迫中的作用已得到证实,
但是调节脯氨酸合成和降解的信号转导机制尚不清
楚(Kishor等 2005; Ashraf和 Foolad 2007)。已有
的一些实验表明, 某些信号分子, 如 ABA、Ca2+、
磷脂酶D、H2O2等均参与脯氨酸代谢的调节(Kishor
等 2005; Ashraf和 Foolad 2007; Yang等 2009)。
一氧化氮(nitric oxide, NO)是植物体内广泛存
在的信号分子, 它在植物的生长发育、细胞程序性
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死亡以及对逆境胁迫响应和适应过程中均起作用
(刘开力等 2004; Lamotte等 2005)。已有的少量研
究表明, 外源NO能够增强盐胁迫和金属离子胁迫
下植物体内脯氨酸的积累。如Ruan等(2004)报道,
NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)增强
NaCl胁迫下小麦幼苗中脯氨酸的累积; 10 μmol·L-1
SNP预处理30 min后, 遭受CuSO4胁迫的衣藻细胞
中脯氨酸含量即上升约 50% (Zhang等 2008)。但
其相关机制尚不清楚, NO是否参与正常生长条件
下植物体内脯氨酸的代谢过程也不清楚。本文采
用NO供体SNP (Ederli等2008)和NO淬灭剂c-PTIO
[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-
1-oxyl-3-oxide] (Maeda等 1994)处理玉米幼苗的方
法, 研究NO对正常生长条件下玉米幼苗体内脯氨
酸积累以及脯氨酸合成和降解途径的影响, 试图揭
示 NO在脯氨酸代谢中的作用。
材料与方法
玉米(Zea mays L.)品种 ‘晴三 ’种子购自昆明
市种子公司, 以 0.1%的HgCl2消毒 15 min, 用无菌
水充分漂洗干净, 于 26 ℃下浸种12 h, 吸胀后的种
子播种于垫有6层湿润滤纸的培养盒中, 置于26 ℃
恒温箱中暗萌发60 h, 选取长势一致的幼苗分别转
入垫有6层滤纸并加有0~ 500 μmol·L-1 SNP或0~50
μmol·L-1 c-PTIO 的培养盒中于 26 ℃下暗处理 24
h, 以加无菌水的为对照。
实验测定时取用幼苗的地上部分(长度约 3
cm)。脯氨酸含量用酸性茚三酮法测定(Bates 等
1973); P5CS的提取和活性测定参照Garcia-Rios等
(1997)的方法, 并略做改进: 反应混合液为 50
mmol·L-1的 Tris-HCl, 内含 2 mmol·L-1 MgCl2、5
mmol· L-1 ATP、50 mmol·L-1 Glu, 加入 0.2 mL酶
液, 以 0.4 mmol·L-1 NADPH启动反应, 用Ultrospec
2000分光光度计测定波长 338 nm处OD值, 以单
位时间内 NADPH 氧化量表示酶活性; OAT和
ProDH活性测定参考Sanchez等(2001)文中的方法,
O A T 活性以单位时间内 N A D P H 氧化量表示,
ProDH活性以单位时间内NADP+消耗量表示; 蛋白
质的测定按照 Bradford (1976)方法测定, 以牛血清
蛋白为标准样品。
所有实验均重复 3次, 每次实验中取样重复 3
次。实验数据用 SPSS 13.0分析, Sigmaplot 8.0进
行作图。
结果与讨论
1 外源NO供体SNP和NO淬灭剂 c-PTIO对玉米
幼苗体内脯氨酸积累的效应
如图1和图2所示: (1)玉米幼苗用不同浓度的
SNP处理 24 h后, 随着 SNP浓度的增加, 幼苗体内
脯氨酸含量逐渐上升, 150 μmol·L-1处理的含量达
到最高, 此后逐渐下降, 但以500 μmol·L-1 SNP处理
的脯氨酸含量仍然略高于不作SNP处理的(图1),
表明 SNP可促进玉米幼苗中脯氨酸的积累。(2)
玉米幼苗经不同浓度 c-PTIO处理 24 h后, 随着
图 1 不同浓度 SNP对玉米幼苗体内脯氨酸含量的影响
Fig.1 Effects of different SNP concentrations on proline
content of maize seedlings
*: P<0.05; **: P<0.01。
图 2 不同浓度 c-PTIO对玉米幼苗体内脯氨酸含量的影响
Fig.2 Effects of different c-PTIO concentrations on proline
content of maize seedlings
*: P<0.0 5。
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c-PTIO浓度的增加, 其体内脯氨酸含量逐渐下降,
c-PTIO的浓度高至20 μmol·L-1时达到最低, c-PTIO
浓度进一步增加时又逐渐回升(图 2)。之所以有这
种变化趋势, 很可能是低浓度 c-PTIO下玉米幼苗
体内NO含量下降, 从而抑制了NO参与脯氨酸的
积累过程。但是, 随着 c-PTIO浓度的增加, 其本
身可能作为一个胁迫因子而促进幼苗体内脯氨酸积
累。SNP处理的效应可能正好相反。此外, 我们
在预备实验中曾观察到, 以 50~500 μmol·L-1 SNP
或 5~50 μmol·L-1 c-PTIO处理玉米幼苗 24 h后, 幼
苗生长受到的影响不显著, 植株表型正常。
此外, 根据图 1、2的结果, 我们测定了以 150
μmol·L-1 SNP和 20 μmol· L-1 c-PTIO分别处理 24 h
的过程中玉米幼苗体内脯氨酸含量变化。如图3所
示, 在 SNP处理过程中, 玉米幼苗中脯氨酸含量逐
渐上升, 而 c-PTIO处理的则逐渐下降, 这似乎暗示
NO参与玉米幼苗体内脯氨酸积累的调控。
等 2001)。SNP可提高OAT的活性, 经 SNP处理
24 h的玉米幼苗中OAT活性上升 18.8% (P<0.01);
c-PTIO处理的效应则与之相反, OAT活性下降
13.6% (P<0.05) (图 4)。
图 3 SNP和 c-PTIO处理过程中玉米幼苗
体内脯氨酸含量的变化
Fig.3 Changes of proline content in maize seedlings
during SNP and c-PTIO treatments
2 SNP和c-PTIO对脯氨酸合成和降解途径中关键
酶活性的效应
O A T 能将鸟氨酸转化为 γ - 谷氨酰半缩醛
(glutamic-γ-semialdehyde, GSA), 进而生成 Δ1-吡咯
啉 -5-羧酸(Δ1-pyrroline-5-carboxylate, P5C) (Zhao
图 4 SNP和 c-PTIO处理过程中玉米幼苗的
OAT活性的变化
Fig.4 Changes of OAT activity in maize seedlings
during SNP and c-PTIO treatments
P5CS催化谷氨酸到 P5C的合成反应, P5C进
而生成脯氨酸 (Hong等 2000; Zhao等 2001)。无
论是SNP还是 c-PTIO, 都对玉米幼苗体内P5CS活
性变化影响不大(P>0.05) (图 5)。
脯氨酸降解是控制植物体内脯氨酸积累的因
图 5 SNP和 c-PTIO处理过程中玉米幼苗的P5CS活性变化
Fig.5 Changes of P5CS activity in maize seedlings
during SNP and c-PTIO treatments
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月784
素, ProDH是降解脯氨酸为 P5C的关键酶(Sanchez
等 2001), SNP降低 ProDH的活性, 经 SNP处理 24
h后的玉米幼苗中 ProDH活性下降(P<0.01), c-
PTIO处理的 ProDH活性则上升(P<0.05) (图 6)。
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总之, 外源NO可提高植物体内脯氨酸的含量,
但其间机制尚不清楚(肖强和郑海雷 2004; 郝岗平
等 2007)。本文结果表明了两点: (1) NO影响玉米
幼苗体内脯氨酸的积累; (2) NO参与脯氨酸合成和
降解过程的调控, NO诱导脯氨酸积累可能是其促
进脯氨酸合成中的鸟氨酸途径、同时抑制了脯氨
酸降解途径的综合结果。
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图 6 SNP和 c-PTIO处理过程中玉米幼苗的
ProDH活性变化
Fig.6 Changes of ProDH activity in maize seedlings
during SNP and c-PTIO treatments