全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1563~1573　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0255 1563
收稿 2014-05-28　　修定 2014-08-23
资助 农业部转基因生物新品种培育重大项目(2013ZX08004004)、
“十二五”国家科技支撑计划课题(2012BAD19B04)和吉林
省玉米产业技术体系岗位科学家(201203-1)。
* 共同第一作者
** 通讯作者(E-mail: panhongyu@jlu.edu.cn; Tel: 0431-87836251)。
山葡萄转录因子基因VaDREB的克隆及其抗逆功能分析
周伟1,2,*, 吴宪1,3,*, 贾承国1, 胡瑞雪2, 杜茜3, 李启云3, 潘洪玉1,**
1吉林大学植物科学学院, 吉林长春130062; 2大庆市农业技术推广中心, 黑龙江大庆163311; 3吉林省农业科学院, 吉林长春
130124
摘要: DREB/CBF (dehydration-responsive element binding protein/C-repeat binding factor)转录因子能特异的与DRE/CRT (de-
hydration-responsive element/C-repeat)顺式作用元件结合, 在植物干旱、高盐和低温等非生物胁迫应答中起着重要的调控
作用。本研究从山葡萄中克隆得到了一个VaDREB转录因子基因(登录号XM_002283076.1), 并对其进行了序列分析、亚细
胞定位分析以及酵母和拟南芥中的功能鉴定。序列分析表明, VaDREB开放阅读框全长459 bp, 编码152个氨基酸, 预测蛋白
质分子量为17 kDa, 等电点为8.67, 包含一个AP2/ERF结合域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果表明, 该基因属于
DREB/CBF转录因子A-5亚类。亚细胞定位结果表明VaDREB蛋白定位于细胞核中。重组酵母菌株与表达VaDREB基因的
转基因拟南芥株系均表现出明显增强的盐、干旱、低温和高温胁迫耐受性表型, 基因表达分析结果表明, 转基因拟南芥株
系中抗逆相关功能基因的表达量出现了明显上调, 这些结果证明VaDREB转录因子在植物抗逆调控过程中起着重要作用。
关键词: DREB/CBF转录因子; 逆境胁迫; 亚细胞定位; 转基因拟南芥; 山葡萄
Cloning and Analysis of Resistance Function of VaDREB Transcription Factor
from Vitis amurensis
ZHOU Wei1,2,*, WU Xian1,3,*, JIA Cheng-Guo1, HU Rui-Xue2, DU Qian3, LI Qi-Yun3, PAN Hong-Yu1,**
1College of Plant Science, Jilin University, Changchun, Jilin 130062, China; 2The Daqing City Agro-Tech Extension and Service
Center, Daqing, Heilongjiang 163311, China; 3Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun, Jilin 130124, China
Abstract: The transcription factors DREBs/CBFs specifically interact with the DRE/CRT cis-acting element
and play important roles in tolerance response to drought, high-salinity and low temperature in plant. In this
study, we isolated a gene encoding DREB transcription factor from Vitis amurensis (GenBank No.
XM_002283076.1) and analyzed its sequence, subcellular localization and function in recombinant yeast cells
and T3 generation transgenic Arabidopsis. The DNA sequences of VaDREB comprised a 459 bp ORF, encoding
a putative protein of 152 amino acids with a predicted molecular mass of 17 kDa and isoelectric point (pI) of
8.67. The deduced amino acid sequences of VaDREB contained a highly conserved AP2/ERF domain. Se-
quence comparison and phylogenetic analysis revealed that VaDREB belonged to the A-5 subgroup of the
DREB/CBF subfamily. The results of subcellular localization analysis suggested that the VaDREB protein was
targeted to the nucleus. The recombinant yeast cells and transgenic Arabidopsis gained higher tolerance to salt,
drought and cold stress. But also, the expression level of some stress responsive genes were significantly upreg-
ulated in transgenic Arabidopsis compared with those in the wild-type Arabidopsis. These results suggest that
VaDREB may play a vital regulatory role in abiotic stress responses in Vitis amurensis.
Key words: DREB/CBF transcription factor; stress tolerance; subcellular localization; transgenic Arabidopsis;
Vitis amurensis
在陆地环境下, 低温、干旱和高盐等环境因
子经常成为影响植物生存和生长的主要因素。由
于植物生存环境固定, 很难逃避变化不定的灾害
性气候因子, 所以在长期的进化过程中, 植物本身
建立起了一套完整的胁迫应答机制(Mizoi等2012),
来保证植物体在不良环境中的正常生长。研究发
现许多基因在转录水平响应非生物逆境胁迫, 这
些基因的产物可能参与胁迫应答反应(Ingram和
植物生理学报1564
Bartels 1996; Thomashow 1999; Shinozaki和Yama-
guchi-Shinozaki 2000)。大量研究表明, DREB/CBF
转录因子在提高植物的抗逆性方面具有重要作用
(Liu等2000; Agarwal等2006)。DREB/CBF转录因子
包含一个保守的AP2/ERF结合域, 由大约60个氨基
酸构成(Stockinger等1997), 通过AP2/ERF结合域能
够与启动子中的DRE/CRT顺式作用元件发生特异
性结合, 从而调控基因的表达。DRE/CRT元件的
核心序列是A/GCCGAC, 存在于很多环境胁迫相
关基因的启动子中(Yamaguchi-Shinozaki和Shi-
nozaki 1994; Stockinger等1997; Liu等1998)。在拟
南芥中共有145个AP2/ERF转录因子, Sakuma等
(2002)根据其AP2/ERF结合域特征将它们分成了
A P 2、R AV、D R E B、E R F和一个特异基因
AL079349五个亚家族。DREB亚家族成员在AP2/
ERF结合域中都有2个保守的氨基酸, 分别是第14
位的缬氨酸和第19位的谷氨酸(Yamaguchi-Shi-
nozaki和Shinozaki 1994)。对DREB蛋白的这两个
保守氨基酸定点突变, 通过电泳迁移率变动分析
表明, 第14位的缬氨酸在蛋白-DNA特异结合中起
主要作用(Sakuma等2002), 但是对于第19位的谷氨
酸在DREB蛋白中最主要的生物学作用目前仍不
清楚。DREB/CBF转录因子基因广泛存在于不同
的植物中, 自从第一个DREB/CBF转录因子CBF1
从拟南芥中克隆得到后(Stockinger等1997)。在水
稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea
mays)、棉花(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum
vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、胡杨(Pobulus
eubhratica)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)中
也都克隆得到了DREB/CBF转录因子基因。在植
物中过量表达DREB/CBF转录因子基因都能明显
的提高植株的胁迫耐受性(Liu等2000; Agarwal等
2006)。研究发现, 在番茄中组成型过量表达拟南
芥DREB1B/CBF1基因, 明显地增强了其过氧化氢
酶活性, 减少了H2O2积累, 并且也提高了转基因植
株的抗旱能力(Hsieh等2002a, b)。将大豆GmDREB
基因导入小麦中后, 转基因小麦的T1代植株相对于
野生型植株 , 抗旱、抗盐能力明显提高(Gao等
2005)。另外, 在玉米中过量表达耐盐植物盐芥
TsCBF1基因, 转基因玉米植株体内的相对水分含
量升高, 溶质积累量增多, 抗旱性明显增强。而且,
转基因玉米植株的花期抽丝间隔缩短, 在干旱条
件下比野生型的谷物产量高很多(Zhang等2010)。
在水稻、油菜、草莓、大麦和山丁子植物中过量
表达DREB/CBF基因, 同样也得了抗逆性增强的转
基因植株。
山葡萄也称东北山葡萄, 是葡萄科葡萄属落
叶藤本植物。山葡萄是葡萄属中最抗寒的一个种,
是葡萄抗寒、抗病育种的宝贵资源 (沈育杰等
2006)。用山葡萄浆果酿造的葡萄酒, 品质优良, 是
我国东北地区葡萄酒工业的主要原料。本研究以
葡萄(Vitis vinifera)中DREB序列为依据, 从山葡萄
中克隆得到了序列完全相同的DREB基因, 命名为
VaDREB。并对该基因做了亚细胞定位分析, 同时
将其在酵母和拟南芥中过量表达, 对其抗逆功能
进行了分析, 并通过qRT-PCR分析了VaDREB对下
游抗逆相关功能基因的激活活性。
材料与方法
1 材料
山葡萄(Vitis amurensis L.)植株叶片采自吉林
大学和平校区葡萄园。大肠杆菌DH5α、根癌农
杆菌EHA105、pCHF-1301、pYES2均由本实验室
保存。pMD18-T克隆载体、RNAiso Plus和反转录
试剂盒(PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA
Eraser)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。
胶回收试剂盒购自生工生物公司。DEPC (焦碳酸
二乙酯)购自宝泰克大连有限公司。引物由生工生
物公司合成。测序由华大基因公司完成。
2 方法
2.1 VaDREB基因的克隆及序列分析
根据目的基因的序列, 设计并合成特异性PCR
扩增引物。上游引物: 5 ATGGAGGGAGGACAG-
GAGTG 3, 下游引物: 5 TCAGAGATGATAGTG-
GTGGTC 3, 以山葡萄cDNA为模板进行PCR扩增,
PCR产物回收后与pMD18-T载体连接, 16 ℃连接
过夜, 然后热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,
在氨苄青霉素抗性(Amp+) LB平板上筛选阳性重
组子。经酶切鉴定后送华大基因公司测序。山葡
萄RNA的提取和反转录参照试剂盒说明书。质粒
的小量制备、酶切、连接、转化等方法参照文献
(奥斯伯等1998)。
2.2 亚细胞定位
根据VaDREB和eGFP的序列设计并合成物异
周伟等: 山葡萄转录因子基因VaDREB的克隆及其抗逆功能分析 1565
性PCR扩增引物。VaDREB基因引物为 : P1 5
CGAGCTCATGGAGGGAGGACAGGAGTG 3, 下
划线为SacI酶切位点, P2 5 CACCATGGTGGC-
GACCGGTGGGAGATGATAGTGGTGGTCATC 3;
eGFP基因引物: P3 5 CATCTCCCACCGGTCGC-
CACCATGGTGAGCAAGGGCGAG 3, P4 5 TC-
CCCCGGGTTACTTGTACAGCTCGTC 3, 下划线
为SmaI酶切位点。以VaDREB和eGFP为模板, 分
别以P1和P2, P3和P4为引物, 通过PCR扩增得到相
应的目的基因片段, 再以回收的VaDREB和eGFP为
融合片段, 以P1和P4为引物, 通过overlapping PCR获
得VaDREB-eGFP融合片段。将融合基因VaDREB-
eGFP连入植物表达载体pCHF-1301。将PCR和酶
切验证正确的重组载体转化农杆菌EHA105, 采用
农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞, 25 ℃暗培养36 h
后, 用激光共聚焦显微镜观察VaDREB蛋白在细胞
中的定位。
2.3 酵母表达载体的构建及其重组酵母的胁迫处理
为了构建植物表达载体, 重新设计并合成了
相应的PCR扩增引物, 上游引物: 5 CCGGAAT-
TCATGGAGGGAGGACAGGAGTG 3, 下划线为
EcoRI酶切位点, 下游引物: 5 CCGCTCGAGTCA-
GAGATGATAGTGGTGGTC 3, 下划线为XhoI酶切
位点。将VaDREB连入酵母表达载体pYES2, PCR
和酶切验证正确后用醋酸锂化学转化法转化酿酒
酵母INVSc1 (Saccharomyces cerevisiae)菌株中, 并
转化pYES2空载体作为对照, 重组酵母分别命名为
INVSc1 (pYES2-VaDREB)和INVSc1 (pYES2)。
挑取酵母INVSc1 (pYES2-VaDREB)和INVSc1
(pYES2)菌液, 接种于SC-U液体培养基(葡萄糖终浓
度为2%)中, 30 ℃、200 r·min-1震荡培养24 h (潘妍等
2010), 测量菌液OD600 值, 并将其OD600值调为0.4, 取
5 mL菌液, 5 000×g离心2 min, 弃上清, 加入5 mL诱
导培养基(SC-U+2%半乳糖)重悬菌体, 30 ℃, 200
r·min-1振荡培养24 h, 测量其OD600值, 并将两种重组
酵母的浓度统一调整为OD600=2; 取等量的酵母,
8 000×g离心1 min, 弃上清。对这两种酵母进行不
同的胁迫处理, 每组实验重复3次。处理如下。
(1) NaCl和KCl处理: 将菌体重悬于5 mol·L-1
NaCl溶液和5 mol·L-1 KCl溶液中, 混匀后30 ℃放
置24 h进行胁迫处理; (2) Na2CO3和NaHCO3处理:
将菌体分别重悬于6%和8%的Na2CO3溶液混匀后
30 ℃放置2 h, 分别重悬于6%和8%的NaHCO3溶液,
混匀后30 ℃放置3 h; (3)干旱处理: 将菌体重悬于
40%的PEG6000和5 mol·L-1的山梨醇中, 混匀后30
℃放置24 h进行胁迫处理; (4)低温处理: 将菌体重
悬于SC-U液体培养基, 低温(−20 ℃)胁迫24 h, 其
间每隔6 h把菌体冻融一次; (5)高温处理: 将菌体重
悬于SC-U液体培养基, 53 ℃处理1 h; (6)百草枯处
理: 将菌体重悬于含有4 mmol·L-1百草枯SC-U培养
基中, 30 ℃处理24 h。将不同非生物胁迫处理后的
菌体分别稀释102、103、104和105倍, 取2 μL点样
在SC-U (含2%半乳糖)固体培养基上, 30 ℃培养48
h, 比较两种菌的菌落生长差异。
2.4 植物表达载体的构建及其拟南芥遗传转化
根据植物表达载体pCHF-1301的多克隆位点
设计并合成含有SacI和SmaI酶切位点的引物, 上游
引物: 5 CGAGCTCATGGAGGGAGGACAG-
GAGTG 3, 下划线为SacI酶切位点, 下游引物: 5
TCCCCCGGGTCAGAGATGATAGTGGTGGTC 3,
下划线为SmaI酶切位点。将基因VaDREB连入植物
表达载体pCHF-1301中。将PCR和酶切验证正确
的重组植物表达载体转化农杆菌EHA105, 采用农
杆菌介导的方法转化拟南芥植物。将收获的T0代
种子在含有30 mg·L-1潮霉素的MS培养基上进行筛
选。对筛选得到的拟南芥植株进行PCR验证。将
验证为阳性的每个拟南芥转基因株系继续进行筛
选、培养, 直到得到每个转基因株系的T3代种子。
2.5 拟南芥盐胁迫处理
过量表达VaDREB的拟南芥植株及野生型(对
照)在正常条件下[16 h光照(22 ℃)/8 h黑暗(20 ℃),
湿度80%]培养, 生长3周后, 用含有350 mmol·L-1
NaCl的Hoagland营养液浇灌, 定期观察拟南芥的
表型变化。
2.6 电导率测定
种植野生型拟南芥植株和VaDREB转基因拟
南芥, 在正常条件下培养3周左右, 分别进行干旱
和冷冻处理。干旱处理: 将拟南芥植株从土中拔
出, 洗掉根上携带的土后放在吸水纸上, 然后在正
常光照、温度条件下放置2.5 h。冷冻处理: 将拟
南芥植株放置在–6 ℃处理3 h; 并以野生型拟南芥
做对照, 每个株系5次重复。分别称取0.1 g胁迫处
理的转基因植株和野生型拟南芥植株叶片, 加入
到装有0.4 mol·L-1甘露醇溶液的试管中; 将管放在
植物生理学报1566
摇床上, 23 ℃, 100 r·min-1轻轻振荡3 h (Fan等
1997); 用电导率测定仪逐管测定。然后将管放入
沸水中煮沸10 min; 待冷却至室温后, 再次逐管测
定电导率。根据公式相对电导率=起始电导率/总
电导率×100%, 计算叶片的相对电导率。
2.7 转基因拟南芥中抗逆基因在转录水平上的
qRT-PCR分析
分别提取了野生型和VaDREB转基因拟南芥
植株的叶片总RNA, DNA酶处理后将其反转录成
cDNA® (PrimeScript RT reagent Kit With gDNA
Eraser试剂盒, Takara)。并采用qRT-PCR分析了野
生型和VaDREB转基因拟南芥植株中AtRD29A、
AtRD29B、AtCOR15A、AtCOR15B、AtERD1、
AtERD10、AtRD17、AtKIN1和AtKIN2这些功能基
因在转录水平上的变化, 内参基因为拟南芥Actin2
(登录号AK230311)基因。基因登录号及其引物序
列如表1所示。反应程序为: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s,
58 ℃ 40 s, 40个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃
30 s; 每个处理均设了3次重复, 基因的相对表达量
计算采用2−ΔΔCT法。
实验结果
1 山葡萄VaDREB基因的克隆及生物信息学分析
根据葡萄DREB基因序列, 设计了特异引物,
采用RT-PCR方法从山葡萄中克隆得到了开放阅读
框全长为459 bp的VaDREB基因片段(图1), 序列分
析表明该基因编码152个氨基酸, 预测蛋白质分子
量为17 kDa, 等电点为8.67。Smart (http://smart.embl-
heidelberg.de/)在线软件预测结果显示, VaDREB蛋
白包含一个由64个氨基酸残基组成的AP2/ERF结
合域, 其中的第14位和第19位氨基酸残基分别为
缬氨酸和谷氨酸(图2), 说明此基因为典型的DREB/
CBF转录因子。在线软件BaCello (http://gpcr.bio-
comp.unibo.it/bacello/)预测该基因编码蛋白定位于
细胞核中。将VaDREB基因与其它植物的DREB/
CBF转录因子氨基酸序列进行了系统进化分析, 并
用MEGA 5软件构建了系统进化树, 结果(图3)表明
该基因属于DREB/CBF转录因子A-5亚类。将
VaDREB与DREB/CBF转因子A-5亚类的其它4
个转录因子进行了序列比对 , 结果 (图4)显示 ,
VaDREB蛋白序列与棉花GhDBP1蛋白序列的全序
表1 qRT-PCR分析所用基因及其引物序列
Table 1 Genes and the primer sequence of qRT-PCR
基因名称 基因登录号 引物序列
VaDREB XM_002283076.1 F: 5 AGGAAGTGGGGGAAGTGGGT 3
R: 5 TCTCAGGTGAAAGACGGCGG 3
AtActin2 AK230311 F: 5 GGAAGGATCTGTACGGTAAC 3
R: 5 TGTGAACGATTCCTGGACCT 3
AtRD29A D13044.1 F: 5 AGCCAAAACAGAGCACTTACACA 3
R: 5 CTTCTCATCAACAGTTCCCGC 3
AtRD29B D13044.1 F: 5 TGAAAGTAGAGAGTGGATTGGGA 3
R: 5 TTGGGACGAGATAGTTCTGGTG 3
AtCOR15A NM_180040.3 F: 5 TTCTTTCCACAGCGGAGCCA 3
R: 5 TGTTGCCGTCACCTTTAGCG 3
AtCOR15B NM_129814.2 F: 5 GAAGCCAATGAAACTGCGACT 3
R: 5 TACCCTCTACGAACTCAGCCG 3
AtERD1 NM_124486.2 F: 5 CCGCAGAACTAAAAACAACCC 3
R: 5 TCAAGAGAAATCCAGGAGCACT 3
AtERD10 NM_180616.2 F: 5 TTCACAAGTCGTCAACACCACAC 3
R: 5 CCATAAATCCCTTCTTCTCCTCC 3
AtRD17 NM_101894.3 F: 5 ACCAACGGTCGCAACAGAG 3
R: 5 CTTCCCCAAGAAATCAAACAAT 3
AtKIN1 NM_121601.2 F: 5 CAATGTTCTGCTGGACAAGGC 3
R: 5 CAATGTTCTGCTGGACAAGGC 3
AtKIN2 AY114545.1 F: 5 CAATGTTCTGCTGGACAAGGC 3
R: 5 CCTGTTGCGCGGAAGCT 3
周伟等: 山葡萄转录因子基因VaDREB的克隆及其抗逆功能分析 1567
列相似性为56.44%, 与大豆GmDREB2蛋白序列的
全序列相似性为56.47%, 5个蛋白在AP2/ERF结合
域氨基酸序列相似性非常高。
2 亚细胞定位分析
通过生物信息学预测VaDREB蛋白定位于细
胞核中, 为了获取该基因在细胞中的准确定位信
息, 我们将VaDREB基因融合到eGFP (绿色荧光蛋
白)基因的5端, 并将VaDREB-eGFP融合基因连入
植物表达载体pCHF-1301, 采用农杆菌介导的遗传
转化法将空载体pCHF-1301和重组载体pCHF-1301-
VaDREB-eGFP分别转化到洋葱表皮细胞中。激光
共聚焦显微镜扫描结果(图5)显示, 在转单个eGFP
基因的洋葱表皮细胞中, 绿色荧光蛋白分布在整
个细胞中; 而在转VaDREB-eGFP融合基因的洋葱
图1 VaDREB的PCR扩增结果
Fig.1 PCR products of VaDREB
M: DNA marker; 1~5: VaDREB PCR扩增结果。
表皮细胞中, 只在细胞核中观查到绿色荧光蛋白
的分布。这表明, VaDREB是一个细胞核蛋白。
3 重组酵母INVSc1的抗逆性分析
将已验证为阳性的携带pYES2-VaDREB重组
质粒和pYES2空载体的酿酒酵母INVSc1用半乳糖
诱导, 并分别对其进行了胁迫处理, 之后取2 μL稀
释了不同倍数的菌液点样在SC-U (含2%葡萄糖)
固体培养基上, 30 ℃培养48 h后, 对两种菌的生长
差异进行了比较分析。结果(图6)显示, INVSc1
(pYES2-VaDREB)在NaCl、KCl、Na2CO3、NaHCO3、
PEG6000、低温和高温胁迫处理下的存活率都高
于对照INVSc1 (pYES2), 说明VaDREB基因的表达
增强了酵母INVSc1 (pYES2-VaDREB)对盐碱胁迫
和极端温度的耐受能力, 也表明VaDREB基因具有
一定的抗干旱功能。另外, 在百草枯胁迫处理后,
INVSc1 (pYES2-VaDREB)的存活率也高于对照IN-
图2 VaDREB的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of VaDREB
阴影部分: AP2/ERF结合域; *: 终止密码子。
植物生理学报1568
VSc1 (pYES2), 表明VaDREB基因的表达也增强了
重组酵母清除活性氧的能力。
4 VaDREB转基因拟南芥植株抗逆分析
4.1 转基因拟南芥的耐盐性分析
对野生型拟南芥和VaDREB转基因拟南芥植
株用盐溶液进行浇灌, 2 d后, 拟南芥植株叶片开始
黄化, 但转基因拟南芥植株大部分仍保持绿色。5
d后, 野生型拟南芥植株的叶尖部位开始枯萎, 并
不断向叶的中部延伸, 但转基因植株的叶片没有
出现这种症状, 并且转基因植株的叶片黄化程度
仍然较低, 一直到7 d后大部分植株叶片还保持绿
色。10 d后, 野生型拟南芥叶片出现大面积枯萎,
甚至整棵植株死亡, 而转基因拟南芥植株仍然保
持较好的生长状态, 植株几乎全部存活(图6)。这
图3 VaDREB的系统进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of VaDREB
图4 DREB/CBF氨基酸序列比对
Fig.4 Alignment of the DREB/CBF proteins
黑色阴影部分: 序列保守区; 下划线: AP2/ERF结构域; 双下划线: 保守氨基酸; VaDREB: 山葡萄; GhDBP1: 棉花; GmDREB2: 大豆;
AtRAP2.1、AtRAP2.9和AtRAP2.10: 拟南芥。
周伟等: 山葡萄转录因子基因VaDREB的克隆及其抗逆功能分析 1569
些结果表明, 过量表达VaDREB基因增强了转基因
拟南芥植株对盐胁迫的耐受性。
4.2 电导率测定
对干旱和冷冻处理后的野生型拟南芥和转基
图6 VaDREB在酵母中的抗逆功能分析
Fig.6 Resistance function analysis of VaDREB in yeast INVSc1
A: 对照; B: NaCl胁迫; C: KCl胁迫; D: 百草枯胁迫; E和F: 6%和8%的Na2CO3胁迫; G和H: 6%和8%的NaHCO3胁迫; I: 冷冻胁迫; J: 高
温胁迫; K: PEG6000胁迫; L: 山梨醇胁迫; CK: 未进行胁迫处理。
图5 VaDREB的亚细胞定位
Fig.5 Subcellular localization of the VaDREB protein
植物生理学报1570
因拟南芥进行了电导率测定。结果(图8)表明, 在
冷冻和干旱处理后, 转基因植株的相对电导率低
于野生型植株, 说明VaDREB基因的表达使得转基
因植株在低温和干旱胁迫下, 细胞膜的受损伤程
度降低, 胁迫耐受能力得到了提高。
4.3 T3代VaDREB转基因拟南芥中抗逆相关基因表
达量分析
为了研究VaDREB的转录调控作用, 用qRT-
PCR在转录水平上对野生型拟南芥植株和转基因
拟南芥植株中的9个功能基因的表达量进行了定
量分析。结果(图9)表明, 在转基因拟南芥中, 抗逆
相关功能基因的表达量都出现了不同程度的上调,
特别是KIN1、KIN2和COR15B基因, 其在转基因拟
南芥植株中表达量比在野生型中的表达量高出很
多, 最高的达到40多倍, 这表明VaDREB转录因子
的过量表达, 激活了拟南芥植株中下游功能基因
的表达使其表达量上调。
讨　　论
DREB转录因子是植物体胁迫应答中十分关
键的调控因子。本研究根据葡萄的DREB序列, 采
用RT-PCR的方法从山葡萄中克隆得到了一个序列
完全相同的VaDREB转录因子基因, 这说明葡萄
(Zhao等2014)与山葡萄在基因组成上高度相似。
VaDREB包含一个由64个氨基酸残基组成的AP2/
ERF结合域, 其中第14位和第19位分别为保守的缬
氨酸, 这两个氨基酸与DREB蛋白的DNA识别及特
异性结合相关(Sakuma等2002)。通过与绿色荧光
蛋白(eGFP)融合表达证实VaDREB是一个核蛋白。
图9 T3代VaDREB转基因拟南芥中抗逆
相关基因的qRT-PCR分析
Fig.9 Expression analysis of stress-regulated genes in T3
VaDREB transgenic Arabidopsis plants by qRT-PCR
图8 冷冻和干旱处理下拟南芥叶片的电导率测定
Fig.8 Measurement of electrolyte leakage in Arabidopsis
leaves with cold and drought treatment
图7 VaDREB转基因拟南芥耐盐性分析
Fig.7 Analysis of salt tolerance of VaDREB transgenic Arabidopsis
周伟等: 山葡萄转录因子基因VaDREB的克隆及其抗逆功能分析 1571
研究基因的抗逆功能时, 真核生物酿酒酵母
是一个理想的模式生物, 具有快速、准确的优点
(Posas等2000; Rausell等2003)。并且其细胞结构更
适合于研究真核生物基因功能。我们以潘妍等
(2010)的相关研究为依据, 用酿酒酵母表达系统研
究了山葡萄转录因子基因VaDREB的抗逆功能。
转VaDREB基因酵母在各种逆境胁迫下的抗逆分
析结果(图6)显示, VaDREB基因的表达不同程度的
增强了酵母对盐碱、低温、高温和干旱的耐受
性。另外, 也用百草枯对转基因酵母的活性氧清
除能力进行了分析。因为研究表明, 环境中各种
胁迫因子会对植物体细胞中活性氧产生与清除系
统造成影响, 导致植物细胞遭受氧化胁迫(蒋明义
等1994)的损伤, 百草枯能诱导酵母产生活性氧, 转
基因酵母对百草枯的抗性分析一定程度上反映了
VaDREB基因对各种非生物胁迫的抗性功能。
为了更进一步研究VaDREB的功能, 我们将该
基因在模式植物拟南芥中进行了过量表达, 转基
因拟南芥植株表现出了明显的盐胁迫耐受性(图
7)。但VaDREB过量表达并没有导致拟南芥植株的
生长出现延滞。类似的研究报道也出现在别的基
因的研究结果中。Chen等(2007)在烟草中过量表
达大豆GmDREB2基因后, 明显的提高了转基因植
株的耐盐性, 但没有对植株的生长产生负面影响。
Oh等(2005)将拟南芥AtDREB1A基因在水稻中过量
表达后, 也没有观察到转基因水稻植株出现生长
延滞的表型。但是在转基因研究中, 为了避免基
因的过量表达造成植物体的能量浪费, 常用胁迫
诱导型启动子rd29A代替组成型启动子调控基因
在转基因植株中的表达, 并且发现rd29A启动子能
有效的调控基因表达, 提高转基因植株的胁迫耐
受性, 而不会导致转基因植株出现生长延滞等不
正常表型(Pino等2007; Zhao等2007)。电导率常被
作为衡量植物细胞膜受损程度的一个指标(Gilm-
our等1998; Vannini等2004), 灵敏, 并且测定简单。
我们对胁迫处理后的转基因拟南芥和野生型拟南
芥植株叶片的电导率进行了测定, 转基因拟南芥
植株的电导率都低于野生型。同时也发现低温对
植物细胞膜的损伤程度高于干旱的。
转录因子对植物的抗逆作用主要是通过开启
或关闭信号通路, 激活和调控下游功能基因的表
达来实现的。早期的研究中, 通过对不同DREB1/
CBF转基因拟南芥植株的cDNA微阵列分析, 鉴定
了40多个DREB1/CBF下游调控基因, 并且研究发
现这些基因大多编码胁迫相关蛋白(Nakashima等
2009)。我们选取了9个功能研究比较清楚、与植
物抗逆相关的功能基因, 在转录水平上对它们进
行了定量分析。9个基因中除了RD29B之外, 其它
几个基因的表达量都出现了不同程度的上调, 特
别是KIN1、KIN2和COR15B基因, 其在转基因拟南
芥植株中的表达量比在野生型拟南芥植株中的表
达量高出很多, 这表明, VaDREB转录因子的过量
表达, 激活了拟南芥植株中下游功能基因的表达,
其对拟南芥植株抗逆性的增强可能主要是通过调
控这些功能基因的表达实现的。对水稻OsDRE-
B1A基因的研究发现, 该转录因子更容易与DRE/
CRT元件核心序列为GCCGAC的启动子结合, 由
于KIN1、KIN2和ERD10三个基因启动子中DRE/
CRT元件核心区仅包含ACCGAC序列, 在过量表
达OsDREB1A基因的转基因拟南芥植株中, 这三
个基因的表达量并没有出现上调(Cong等2008)。
在VaDREB转基因拟南芥植株中, KIN1和KIN2这两
个基因的表达量明显上调, 表明VaDREB转录因子
更容易与DRE/CRT元件核心区为ACCGAC序列的
启动子结合, 或者是与包含ACCGAC或GCCGAC
序列的启动子都能发生结合, 具体情况还有待进
一步研究。这几个表达量出现上调的基因中, 其
启动子区都含有DRE元件, 而RD29B基因的启动子
区不包含DRE元件序列, 只包含一个ABRE元件序
列(Yang等2011)。Liu等(2007)曾研究发现DREB转
录因子家族A-5亚家族PpDBF1基因的表达受ABA
调控。Cong等(2008)对转录因子基因BiDREB1B研
究发现该基因与ABA依赖性及ABA非依赖性信号
调控通路都有关联。由于转录因子对功能基因的
调控并不都是直接作用, 很多调控作用是通过调
控网络间接实现的, 所以对于VaDREB基因是否参
于ABA信号调控通路还有得于进一步研究。
在拟南芥中过量表达ZmDREB1A、DREB1A/
CBF3和OsDREB1A都对植株的胁迫耐受性产生了
明显的增强作用(Liu等1998; Dubouzet等2003; Qin
等2004)。本研究中我们也分析了VaDREB在拟南
芥中过量表达后对植物抗逆方面的作用, 并且发
植物生理学报1572
现其明显的增强了拟南芥植物对高盐胁迫的耐受
性, 并且研究结果也表明该基因在植物干旱、低
温等胁迫应答中起着重要的调控作用。这为进一
步研究山葡萄的抗逆机制奠定了理论基础, 也为
以后利用植物基因工程手段提高作物的抗逆性提
供了有效的基因资源。
参考文献
蒋明义, 杨文英, 徐江, 陈巧云(1994). 渗透胁迫诱导水稻幼苗的氧
化伤害. 作物学报, 20 (6): 733~738
奥斯博主编(1998). 金由章译. 精编分子生物学实验指南. 第5版. 北
京: 科学出版社
潘妍, 王玉成, 张大伟, 杨传平(2010). 二色补血草LbGRP基因的克
隆及抗逆能力分析. 遗传, 32: 278~286
沈育杰, 赵淑兰, 杨义明, 李晓红, 宋润刚, 路文鹏(2006). 我国山葡
萄种质资源研究与利用现状. 特产研究, 3: 53~57
Agarwal PK, Agarwal P, Reddy MK, Sopory SK (2006). Role of
DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance
in plants. Plant Cell Rep, 25: 1263~1274
Chen M, Wang QY, Cheng XG, Xu ZS, Li LC, Ye XG, Xia LQ, Ma
YZ (2007). GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription
factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic
plants. Biochem Bioph Res Co, 353: 299~305
Cong L, Zheng HC, Zhang YX, Chai TY (2008). Arabidopsis DRE-
B1A confers high salinity tolerance and regulates the expression
of GA dioxygenases in tobacco. Plant Sci, 174: 156~164
Dubouzet JG, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura S,
Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2003). OsDREB
genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators
that function in drought-, high-salt- and cold- responsive gene
expression. Plant J, 33: 751~763
Fan L, Zheng S, Wang X (1997). Antisense suppression of phospholi-
pase Dα retards abscisic acid- and ethylene-promoted senescence
of postharvest Arabidopsis leaves. Plant Cell, 9: 2183~2196
Gao SQ, Xu HJ, Cheng XG, Chen M, Xu ZS, Li LC, Ye XG, Du LP,
Hao XY, Ma YZ (2005). Improvement of wheat drought and salt
tolerance by expression of a stress-inducible transcription fac-
tor GmDREB of soybean (Glycine max). Chinese Sci Bull, 50:
2714～2723
Gilmour SJ, Zarka DG, Stockinger EJ, Salazar MP, Houghton JM,
Thomashow MF (1998). Low temperature regulation of the Ara-
bidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early
step in cold- induced COR gene expression. Plant J, 16: 433~442
Hsieh TH, Lee JT, Charng YY, Chan MT (2002a). Tomato plants ecto-
pically expressing Arabidopsis CBF1 show enhanced resistance
to water deficit stress. Plant Physiol, 130: 618~626
Hsieh TH, Lee JT, Yang PT, Chiu LH, Charng YY, Wang YC, Chan
MT (2002b). Heterology expression of the arabidopsis c-repeat/
dehydration response dlement binding factor 1 gene confers
dlevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic
tomato. Plant Physiol, 129: 1086~1094
Ingram J, Bartels D (1996). The molecular basis of dehydration toler-
ance in plants. Annu Rev Plant Biol, 47: 377~403
Liu N, Zhong NQ, Wang GL, Li LJ, Liu XL, He YK, Xia GX (2007).
Cloning and functional characterization of PpDBF1 gene en-
coding a DRE-binding transcription factor from Physcomitrella
patens. Planta, 226: 827~838
Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki
K, Shinozaki K (1998). Two transcription factors, DREB1 and
DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate
two cellular signal transduction pathways in drought- and
low-temperature-responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391~1406
Liu Q, Zhao N, Yamaguch-Shinozaki K, Shinozaki K (2000). Regula-
tory role of DREB transcription factors in plant drought, salt and
cold tolerance. Chinese Sci Bull, 45: 970~975
Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2012). AP2/ERF fam-
ily transcription factors in plant abiotic stress responses. BBA-
Gene Regul Mech, 1819: 86~96
Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K (2009). Transcriptional
regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidop-
sis and grasses. Plant Physiol, 149: 88~95
Oh SJ, Song SI, Kim YS, Jang HJ, Kim SY, Kim M, Kim YK, Nahm
BH, Kim JK (2005). Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in
transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunt-
ing growth. Plant Physiol, 138: 341~351.
Pino MT, Skinner JS, Park EJ, Jeknić Z, Hayes PM, Thomashow MF,
Chen TH (2007). Use of a stress inducible promoter to drive
ectopic AtCBF expression improves potato freezing tolerance
while minimizing negative effects on tuber yield. Plant Bio J, 5:
591~604
Posas F, Chambers JR, Heyman JA, Hoeffler JP, de Nadal E, Ariño J
(2000). The transcriptional response of yeast to saline stress. J
Biol Chem, 275: 17249~17255
Qin F, Sakuma Y, Li J, Liu Q, Li YQ, Shinozaki K, Yamaguchi-Shi-
nozaki K (2004). Cloning and functional analysis of a novel
DREB1/CBF transcription factor involved in cold-respon-
sive gene expression in Zea mays L. Plant Cell Physiol, 45:
1042~1052
Rausell A, Kanhonou R, Yenush L, Serrano R, Ros R (2003). The
translation initiation factor eIF1A is an important determinant
in the tolerance to NaCl stress in yeast and plants. Plant J, 34:
257~267
Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shi-
nozaki K (2002). DNA-Binding specificity of the ERF/AP2
Domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in
dehydration- and cold-Inducible gene expression. Biochem Bio-
phy Res Co, 290: 998~1009
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2000). Molecular responses
to dehydration and low temperature: differences and cross-talk
between two stress signaling pathways. Curr Opin Plant Biol, 3:
217~223
Stockinger EJ, Gilmour SJ, Thomashow MF (1997). Arabidopsis
thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcription-
al activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA
regulatory element that stimulates transcription in response to
low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA, 94:
周伟等: 山葡萄转录因子基因VaDREB的克隆及其抗逆功能分析 1573
1035~1040
Thomashow MF (1999). Plant cold acclimation: freezing tolerance
genes and regulatory mechanisms. Annu Rev Plant Biol, 50:
571~599
Vannini C, Locatelli F, Bracale M, Magnani E, Marsoni M, Osnato M,
Mattana M, Baldoni E, Coraggio I (2004). Overexpression of the
rice Osmyb4 gene increases chilling and freezing tolerance of
Arabidopsis thaliana plants. Plant J, 37: 115~127
Yang W, Liu XD, Chi XJ, Wu CA, Li YZ, Song LL, Liu XM, Wang
YF, Wang FW, Zhang C et al (2011). Dwarf apple MbDREB1
enhances plant tolerance to low temperature,drought,and salt
stress via both ABA-dependent and ABA-independent pathways.
Planta, 233: 219~229
Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1994). A novel cis-acting
element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness
to drought, low-temperature, or high-salt stress. Plant Cell, 6:
251~264
Zhang S, Li N, Gao F, Yang A, Zhang J (2010). Over-expression of
TsCBF1 gene confers improved drought tolerance in transgenic
maize. Mol Breeding, 26: 455~465
Zhao J, Ren W, Zhi D, Wang L, Xia G (2007). Arabidopsis DREB1A/
CBF3 bestowed transgenic tall fescue increased tolerance to
drought stress. Plant Cell Rep, 26: 1521~1528
Zhao T, Xia H, Liu J, Ma F (2014). The gene family of dehydration
responsive element-binding transcription factors in grape (Vitis
vinifera): genome-wide identification and analysis, expression
profiles, and involvement in abiotic stress resistance. Mol Biol
Rep, 41: 1577~1590